微管正端示蹤蛋白與神經(jīng)系統(tǒng)疾病

宋彬彬 王玉波 賈炳泉 于 佳

微管是真核細(xì)胞中普遍存在的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，散布于胞質(zhì)中，參與細(xì)胞支撐、細(xì)胞遷移、細(xì)胞分裂、胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)冗^程，對于維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能具有重要作用。微管是由13條原纖維(protofilaments)構(gòu)成的直徑約22～25nm的中空管狀結(jié)構(gòu)，每條原纖維由α-和β-微管蛋白(tubulin)頭尾相連形成的二聚體線性排列而成。且tubulin二聚體排列具有極性，使微管也具有極性，分為負(fù)端和正端：負(fù)端集中于近核區(qū)的微管組織中心(MT-organizing center，MTOC)，最末端為α-tubulin，聚合速度慢，較穩(wěn)定；正端向外延伸，最末端為β-tubulin，聚合速度快，處于動態(tài)的聚合和解聚轉(zhuǎn)換狀態(tài)，即微管正端的動態(tài)不穩(wěn)定性(dynamic instability)，使微管正端快速伸長或收縮，調(diào)節(jié)微管形態(tài)[1]。多種與微管結(jié)合的蛋白可特異性定位于微管正端，為微管正端示蹤蛋白(plus-end tracking proteins，+TIPs)，+TIPs可形成復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)，調(diào)節(jié)微管的結(jié)構(gòu)和功能。神經(jīng)元體積較大，軸突和樹突分支較多且長，因此更為依賴微管。+TIPs突變或表達(dá)水平變化與肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)和無腦回畸形(lissencephaly)等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)。本文就多種+TIPs的結(jié)構(gòu)、功能，及其相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病進(jìn)行綜述。

一、微管正端示蹤蛋白結(jié)構(gòu)和功能

神經(jīng)元中+TIP種類較多，目前可分為兩大類：微管末端結(jié)合蛋白(end-binding proteins，EBs)依賴性+TIPs(EBs-dependent +TIPs)以及EBs非依賴+TIPs(EBs-independent +TIPs)。

1.微管末端結(jié)合蛋白(end-binding proteins，EBs):是+TIPs中含量最多的蛋白，自主定位于微管正端，并可與其他+TIPs相結(jié)合。哺乳動物中EBs蛋白主要有EB1、EB2和EB3，三者都可與微管正端結(jié)合，但與微管以及+TIP的親和力不同，EB1和EB3高于EB2。EBs 蛋白N端的CH(calponin homology)結(jié)構(gòu)域具有MT親和能力，介導(dǎo)與微管正端的結(jié)合；C端的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(coiled-coil doamin，CCD)負(fù)責(zé)EBs單體的二聚化；保守的EB同源結(jié)構(gòu)域(end binding homology domain，EBH)與CCD部分重疊；C端最末為高度保守的EEY/F序列。EBs主要作為微管正端的支架蛋白(scaffolding proteins)位于+TIP的中心，結(jié)合在微管正端的EBs可與胞質(zhì)快速交流，為蛋白質(zhì)快速結(jié)合提供平臺，有效形成和維持微管正端的完整性和功能，對于神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能有重要作用。EBs可識別微管正端最末端蛋白，促進(jìn)GTP水解，調(diào)節(jié)蛋白結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換和微管動力學(xué)[2]。Komarova等[3]研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的CHO-K1細(xì)胞中EB1和EB3可抑制微管崩解，促進(jìn)微管持續(xù)增長。

2.微管末端結(jié)合蛋白依賴性微管正端示蹤蛋白:根據(jù)+TIP與EBs結(jié)合方式，其可被分為兩大類，一類是具有高度保守CAP- Gly結(jié)構(gòu)域(cytoskeletal-associated protein glycine-rich domain)的+TIPs，可以與EB和微管蛋白羧基端的EEY/F修飾相結(jié)合。二類是具有SxIP基序(serine/threonine-any amino acid-isoleucine/leucine-proline motif)的+TIPs，種類較多，SxIP基序可以與EBs的EBH結(jié)構(gòu)域結(jié)合。

(1)CAP-Gly結(jié)構(gòu)域蛋白:細(xì)胞質(zhì)連接蛋白(cytoplasmic linker protein，CLIPs)主要包括CLIP170和CLIP115，富集于軸突生長錐，調(diào)節(jié)微管穩(wěn)定性和軸突的形成，其中CLIP170可與肌動蛋白actin結(jié)合蛋白IQGAP1協(xié)同作用調(diào)節(jié)樹突的形態(tài)，是重要的細(xì)胞極性調(diào)節(jié)因子。CLIP170的N端具有CAP-Gly結(jié)構(gòu)域，可以與EB1和α-tubulin的C端EEY/F 修飾結(jié)合；C端具有兩個鋅結(jié)合域(zinc-binding domains)和EEY/F修飾，可與具有CAP-Gly結(jié)構(gòu)域的+TIPs相結(jié)合。CLIP115與CLIP170的N端相似，但缺失CLIP170的C端結(jié)構(gòu)域及功能。Komarova等[4]研究發(fā)現(xiàn)CHO-K1細(xì)胞中微管正端CLIPs表達(dá)水平下降引起動力蛋白激活蛋白dynactin最大亞基p150glued在微管正端定位減少，微管修復(fù)(rescue)速率顯著下降，微管壽命變短。

p150glued是由DCTN1基因編碼的，定位于微管正端。p150glued的N端具有CAP-Gly結(jié)構(gòu)域，可與含有EEY/F序列的微管蛋白α-tubulin以及EB1和CLIP170直接結(jié)合；C端的CC1結(jié)構(gòu)域可與動力蛋白dynein的中鏈(intermediate chain，IH)結(jié)合。其中p150glued CAP-Gly結(jié)構(gòu)域與微管直接結(jié)合力較弱，EB1、CLIP170和p150glued相互作用可以增強(qiáng)p150glued在微管正端的定位，抑制微管正端崩解(microtubule catastrophe)。本研究發(fā)現(xiàn)9月齡p150glued微管結(jié)合功能缺失小鼠模型的脊髓組織中乙?；?tubulin水平增加，提示p150glued可調(diào)節(jié)微管穩(wěn)定性變化[5]。

(2)包含SxIP基序蛋白:細(xì)胞質(zhì)連接蛋白(cytoplasmic linker protein-associated proteins)具有CLASP1和CLASP2兩個亞型。CLASP1廣泛表達(dá)，CLASP2主要表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)。CLASPs不僅可與CLIPs結(jié)合，其具有SxIP基序可以與EB1結(jié)合；具有3個TOG(tumor overexpressed gene)樣(TOG1/TOG2/TOG3)結(jié)構(gòu)域可以捕獲動態(tài)的微管末端。研究發(fā)現(xiàn)，CLASP2的TOG2結(jié)構(gòu)域與微管正端結(jié)合后可促進(jìn)微管重建，抑制崩解。敲減CLASPs的MDA-MB-231細(xì)胞中過表達(dá)EB3可增加微管解聚藥物秋水仙素(colchicine)誘導(dǎo)的微管正端崩解的頻率；過表達(dá)TOG2可抑制崩解[6]。

血影斑蛋白(spectraplakins)家族包含微管微絲交聯(lián)因子(microtubule-actin crosslinking factor proteins 1/2，MACF1/2)是一種細(xì)胞骨架交聯(lián)蛋白，可與中間纖維、肌動蛋白(actin)相互作用，調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、細(xì)胞遷移和極化。spectraplakins蛋白 C端GAR結(jié)構(gòu)域(growth arrest-specific 2 protein-related region)和SxIP基序可與微管結(jié)合。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠和果蠅神經(jīng)元中spectraplakins水平下降使微管不能成束，軸突變短。小鼠腦發(fā)育過程中，敲減MACF1可使乙?；⒐艿鞍姿较陆?，動態(tài)微管聚合解聚增強(qiáng)。抑制皮質(zhì)椎體神經(jīng)元遷移，引起神經(jīng)元定位異常[7]。

p140Cap(cas-associated protein)是重要的接頭蛋白，對于細(xì)胞的黏附和生長具有重要作用。p140Cap具有SxIP基序，可與定位于微管正端的蛋白EBs相結(jié)合。研究發(fā)現(xiàn)，海馬神經(jīng)元中p140Cap與EB3相互作用可以調(diào)節(jié)微管以及樹突棘的數(shù)量和形態(tài)，敲減p140Cap可破壞其與EBs間作用，影響微管和微絲細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，使樹突棘數(shù)量明顯下降，偽足增加[8]。

tau微管蛋白激酶(tau-tubulin kinase 1/2，TTBK1/2)屬于酪蛋白激酶1(casein kinase1，CK1)家族，二者具有高度同源的催化結(jié)構(gòu)域和SxIP基序，非催化結(jié)構(gòu)域存在差異。TTBK1特異性表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，參與tau的磷酸化和積聚，其主要使tau Ser422位點(diǎn)磷酸化，并且可激活細(xì)胞周期蛋白依賴激酶5 (cycline-dependent kinase 5，CDK5)等，調(diào)節(jié)信號通路，影響微管穩(wěn)定性[9]。TTBK2廣泛表達(dá)，可磷酸化tau Ser208和Ser210等位點(diǎn)。且TTBK2以EB1/3依賴方式促使微管解聚蛋白KIF2A的S135位點(diǎn)磷酸化，抑制微管的解聚，而TTBK2缺失可阻礙微管的重建[10]。

在教學(xué)設(shè)計與評價上的主要特點(diǎn) 教學(xué)設(shè)計從普通的到信息化教學(xué)設(shè)計，教學(xué)評價從單一的、統(tǒng)一的到多元的、有針對性的評價。信息化教學(xué)設(shè)計涉及翻轉(zhuǎn)課堂和微課程的教學(xué)設(shè)計，以及其他信息化教學(xué)手段的教學(xué)設(shè)計；而教學(xué)評價在傳統(tǒng)的考試基礎(chǔ)上增加了檔案袋評價、概念圖評價、項(xiàng)目評價以及在線考試等方式。

皮層蛋白結(jié)合蛋白2(CTTNBP2)為神經(jīng)元特異性F-actin調(diào)節(jié)蛋白，具有SxIP基序可與EB結(jié)合定位在微管正端。神經(jīng)元發(fā)育過程中，CTTNBP2 的N端雙螺旋結(jié)構(gòu)域(coiled-coil motifs，NCC)可調(diào)節(jié)CTTNBP2 寡聚體的形成；CTTNBP2中間結(jié)構(gòu)域(middle region，Mid region)可與微管相互作用，并通過CTTNBP2寡聚體誘導(dǎo)微管成束，從而調(diào)節(jié)微管穩(wěn)定性和樹突脊的形成[11]。

結(jié)腸腺瘤性息肉病蛋白(adenomatous polyposis coli，APC)為微管正端支架蛋白，主要位于大腦皮質(zhì)，其C端具有SxIP基序，使其聚集于微管正端。APC為RNA結(jié)合蛋白，可調(diào)節(jié)β2B-tubulin mRNA的表達(dá)，促進(jìn)tubulin合成。β2B-tubulin主要定位于生長錐的微管動態(tài)區(qū)， APC與β2B-tubulin mRNA的結(jié)合受損可引起微管結(jié)構(gòu)異常和細(xì)胞遷移障礙[12]。

3.微管末端結(jié)合蛋白非依賴性微管正端示蹤蛋白：lissencephaly-1(LIS1)蛋白高度保守，N端具有雙螺旋結(jié)構(gòu)域(coiled-coil domain，CCD)調(diào)節(jié)二聚體的形成；C端具有7個WD40重復(fù)序列，可與tubulin、dynein/dynactin和CLIP170相互結(jié)合，調(diào)節(jié)微管動力學(xué)，抑制微管正端的崩解。LIS1參與調(diào)控神經(jīng)祖細(xì)胞的分裂、神經(jīng)細(xì)胞的遷移、突觸的形成和胞內(nèi)軸突運(yùn)輸?shù)冗^程，對于腦的發(fā)育具有重要作用。LIS1缺失的純合小鼠胚胎期死亡，LIS1缺失NIH3T3細(xì)胞中微管結(jié)構(gòu)受損[13]。體外培養(yǎng)雞E10～E13胚胎期感覺神經(jīng)元，加入適量laminin后，dynein和tubulin快速到生長錐，微管正端的dynein可招募dynactin和LIS1，促進(jìn)軸突延伸；抑制LIS1或dynein功能使微管不能成束，阻礙軸突延伸。海馬神經(jīng)元中，LIS1、dynein和dynactin富集于生長錐，沉默LIS1的表達(dá)使微管散亂分布，干擾生長錐形成、軸突延伸以及突觸形成[14]。

kinesin4家族蛋白kinesin21A由驅(qū)動結(jié)構(gòu)域、桿部雙螺旋結(jié)構(gòu)域以及尾部WD40重復(fù)序列組成。WD40重復(fù)序列可與+TIPs相互作用使kinesin21A定位在微管正端，kinesin21A也可與微管結(jié)合蛋白1b(microtubule-associated protein 1b，Map1b)相互作用，抑制微管生長和突變(catastrophes)[15]。

二、微管正端示蹤蛋白參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生

微管是重要的神經(jīng)元骨架，調(diào)節(jié)神經(jīng)元發(fā)育、極化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)壬砘顒?。微管正端示蹤蛋白對于神?jīng)退行性變和神經(jīng)發(fā)育異常等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展有重要作用。

1. 神經(jīng)退行性疾病:肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是最常見的運(yùn)動神經(jīng)元病，患者皮質(zhì)、腦干和脊髓的運(yùn)動神經(jīng)元特異性變性死亡，導(dǎo)致四肢、軀干、胸部等肌肉逐漸萎縮無力。ALS中5%～10%為家族性患者，DCTN1是其致病基因之一。研究發(fā)現(xiàn)，ALS患者中存在DCTN1 R1101K、T1249I、M571T和R785W等突變型，且DCTN1功能缺失的運(yùn)動神經(jīng)元中出現(xiàn)軸突運(yùn)輸障礙、神經(jīng)肌肉接頭去神經(jīng)支配、微管穩(wěn)定性和自噬異常等ALS病理表現(xiàn)，而DCTN1突變或缺失引起運(yùn)動神經(jīng)元特異性損傷可能是由于運(yùn)動神經(jīng)元體積較大，軸突較長，分支較多，對于細(xì)胞骨架和軸突運(yùn)輸?shù)母淖兏鼮槊舾衃5，16]。遠(yuǎn)端型遺傳性運(yùn)動神經(jīng)病(distal hereditary motor neuropathy，dHMN)也屬于運(yùn)動神經(jīng)元病。dHMN 具有多種亞型，其中dHMN 7B型(distal hereditary motor neuropathy type 7B)是由DCTN1 G59S突變引起的[17]。

佩里綜合征(Perry syndrome)是一類伴發(fā)抑郁、體重減輕和肺換氣不足等癥狀的帕金森綜合征，患者黑質(zhì)和藍(lán)斑部位的神經(jīng)元大量變性死亡。研究發(fā)現(xiàn)，DCTN1是佩里綜合征的致病基因，與佩里綜合征相關(guān)的p150glued突變主要發(fā)生在其N端的CAP-Gly結(jié)構(gòu)域。DCTN1G71A突變型佩里綜合征小鼠模型早期(6月齡)活動能力下降，晚期(16月齡)運(yùn)動協(xié)調(diào)動能障礙[18]。目前為止，與佩里綜合征有關(guān)的DCTN1突變型為F52L、G67D、G71A/E/R、T72P、Q74P和Y78C。

阿爾茨海默病是癡呆的常見類型，主要累計海馬、大腦皮質(zhì)和皮下組織，病理表現(xiàn)為tau高度磷酸化形成神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性記憶衰退、慢性認(rèn)知功能障礙、語言和社交功能減退等。研究發(fā)現(xiàn)，TTBK1及其變體與AD發(fā)生相關(guān)。TTBK1是神經(jīng)元特異性激酶，可以磷酸化tau的AD相關(guān)位點(diǎn)AD患者腦中TTBK1水平顯著提高，tau Ser422位點(diǎn)磷酸化增強(qiáng)[19]。TTBK1轉(zhuǎn)基因小鼠記憶障礙，腦中磷酸化NFTs積聚，海馬區(qū)CDK5和calpainⅠ活性增強(qiáng)，NMDA receptor types2B(NR2B)水平下降，這提示TTBK1可能通過調(diào)節(jié)CDK5和calpain的活性而與AD發(fā)生相關(guān)。

2.神經(jīng)發(fā)育相關(guān)疾病:威廉斯綜合征(Williams syndrome)為神經(jīng)發(fā)育障礙引起。威廉斯綜合征染色體異常區(qū)域包含CLIP115蛋白的編碼基因CYLN2。CLIP115敲減小鼠具有生長緩慢、大腦異常、海馬區(qū)功能障礙和運(yùn)動協(xié)調(diào)缺陷等威廉斯綜合征癥狀。CLIP115缺失的小鼠成纖維細(xì)胞中微管增長率未發(fā)生明顯變化，但CLIP170和dynactin與微管正端結(jié)合顯著增多，可能改變胞內(nèi)逆向軸突運(yùn)輸。

常染色體隱性智力障礙(autosomal recessive intellectual disability，ARID)是指發(fā)育過程中出現(xiàn)智力功能明顯低于同齡水平及社會適應(yīng)能力顯著減弱。Larti等[20]通過基因測序法研究發(fā)現(xiàn)伊朗一ARID患者家族中出現(xiàn)CLIP170的無義突變p.Q1010*；ARID患者的淋巴母細(xì)胞中CLIP1基因(CLIP170編碼基因)轉(zhuǎn)錄和蛋白水平下降；皮膚成纖維細(xì)胞中微管正端只發(fā)現(xiàn)野生型(未突變型)CLIP170，提示CLIP170缺陷可能引起ARID。

自閉癥/孤獨(dú)癥(autism)是廣泛性發(fā)育障礙的代表性疾病。研究發(fā)現(xiàn)自閉癥患者中存在CTTNBP2L1213V突變型及其內(nèi)含子2中鳥苷酸突變?yōu)樾叵汆奏ぁ４送?，研究發(fā)現(xiàn)APC功能缺失型突變與識別和自閉癥樣疾病(cognitive and autism-like disabilities)發(fā)生相關(guān)。條件性敲除前腦神經(jīng)元中APC的小鼠模型學(xué)習(xí)和記憶功能障礙，伴隨重復(fù)行為增加，社會興趣減少等自閉癥表現(xiàn)，這可能是由于突觸結(jié)構(gòu)和功能異常引起的[21]。

無腦回畸形(lissencephaly)一般是由妊娠期12～24周神經(jīng)元遷移缺陷引起腦溝和腦回發(fā)育缺陷，病理表現(xiàn)為腦回完全消失，腦表面光滑，也稱光滑腦。臨床患者通常伴隨不同程度的精神、運(yùn)動和智力障礙。LIS1缺失或突變是引起無腦回畸形主要原因之一。LIS1相關(guān)無腦回畸形包括isolated lissencephaly sequence(ILS)、皮質(zhì)下帶異位癥(subcortical band heterotopia，SBH)和Miller-Dieker綜合征(Miller-Dieker syndrome，MDS)。Nataliya等研究811位無腦回畸形患者發(fā)現(xiàn)，81%具有基因突變，且LIS1基因突變最多，占40%。研究發(fā)現(xiàn)，無腦回畸形中LIS1主要可發(fā)生錯義突變(T 92C、A 446G等)、無義突變(C 265T、C 430T等)、移碼突變(154-155 ins A、162-163 ins A等)、剪切突變(c.569-10T > C、c.900+1G> A等)和部分缺失突變。

先天性眼外肌纖維化1型 (congenital fibrosis of the extraocular muscles type 1，CFEOM1)主要是由于軸突尋路缺陷 (axon pathfinding defects)引起動眼神經(jīng)發(fā)育缺陷，使眼睛運(yùn)動障礙。研究發(fā)現(xiàn)，CFEOM1患者中存在KIF21A突變型如R954W(約70%)、R954Q、E944Q和M356T等。KIF21A R954W knock-in小鼠模型的神經(jīng)元發(fā)育過程中，動眼神經(jīng)較細(xì)，分支異常，表現(xiàn)出動眼神經(jīng)和運(yùn)動神經(jīng)元數(shù)量減少，上瞼提肌變小，去神經(jīng)支配等CFEOM1表征。KIF21A突變使其與微管結(jié)合增強(qiáng)，可能通過功能獲得方式引發(fā)CFEOM1[22]。

3.神經(jīng)肌肉系統(tǒng)疾病:MACF1缺陷與神經(jīng)肌肉系統(tǒng)疾病相關(guān)。MACF1缺失的純合體小鼠胚胎期死亡。特異性抑制小鼠神經(jīng)系統(tǒng)中MACF1的活性可使細(xì)胞遷移受損，大腦結(jié)構(gòu)紊亂，小鼠出生24～36h后呼吸衰竭而死。

MACF2缺陷與遺傳性感覺自主神經(jīng)病(hereditary sensory and autonomic neuropathy，HSANs)和肌張力障礙(dystonia)有關(guān)。HSANs是由遺傳因素引起的以周圍神經(jīng)受損為主的疾病。患者刺痛、虛弱、感覺疼痛和冷熱能力降低，可致四肢末端反復(fù)發(fā)作性無痛性潰瘍，致步態(tài)不穩(wěn)等。研究發(fā)現(xiàn)HSANs患者中存在MACF2突變，使其轉(zhuǎn)錄異常；MACF2敲減的小鼠模型神經(jīng)異常、肌肉攣縮。肌張力障礙是由于肌肉收縮不協(xié)調(diào)引發(fā)的運(yùn)動障礙綜合征。MACF2異常可引起肌張力障礙，MACF2缺失的小鼠模型感覺神經(jīng)元變性，共濟(jì)失調(diào)，且感覺神經(jīng)元中自噬小體積累，自噬溶酶體和受損線粒體數(shù)量增加，提示MACF2異?？赡芡ㄟ^引起自噬障礙而導(dǎo)致疾病[23]。

三、展 望

微管為神經(jīng)元的細(xì)胞骨架和軸突運(yùn)輸軌道，對于維持神經(jīng)元的生長和功能具有重要作用。+TIPs種類較多，作用復(fù)雜，可調(diào)節(jié)和維護(hù)微管的正常結(jié)構(gòu)和功能，對于細(xì)胞遷移、神經(jīng)元極化以及突觸形成和功能等具有重要作用，其表達(dá)異常參與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，微管正端示蹤蛋白的突變或功能缺失與運(yùn)動神經(jīng)元變性死亡緊密相關(guān)，其具體分子機(jī)制是進(jìn)一步研究方向。隨著分子生物學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)等研究技術(shù)的發(fā)展，可深入研究+TIPs的生理功能及其參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理基礎(chǔ)和分子機(jī)制，對于臨床疾病的防治提供一定的參考意義。