急性肝損傷模型及信號通路研究進(jìn)展

岳淑雯，陳真

(中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 211198)

肝臟是人體內(nèi)最大的實(shí)質(zhì)性器官，它承載著包括物質(zhì)的合成分解代謝、生物轉(zhuǎn)化和內(nèi)外分泌在內(nèi)的多種功能，血液供應(yīng)豐富，易受到體內(nèi)外各種致病因素和刺激因子的侵襲，引起肝臟的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生損傷[1]。肝臟疾病作為臨床上較為常見的疾病，一直是醫(yī)學(xué)與藥學(xué)重點(diǎn)研究的對象之一。

肝臟有一套在整體免疫系統(tǒng)中相對獨(dú)立的特殊免疫系統(tǒng)，用以維持肝臟內(nèi)部的免疫平衡[2]。在應(yīng)對中等程度的炎癥反應(yīng)時，肝臟的固有免疫機(jī)制具備一定的保護(hù)作用，能夠減少肝臟功能紊亂的發(fā)生；但當(dāng)肝臟遭遇嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，并引起肝臟功能不協(xié)調(diào)時，就會導(dǎo)致急性肝損傷的發(fā)生。肝臟疾病的發(fā)生是一個極復(fù)雜的過程，其中包含了眾多的細(xì)胞和炎性因子的參與，雖然目前關(guān)于肝臟損傷發(fā)生發(fā)展的過程的研究已有許多，但是其中確切的細(xì)胞和分子機(jī)制尚不是很清楚。肝臟炎癥是許多急慢性肝臟疾病發(fā)展成肝實(shí)質(zhì)損傷、肝纖維化、肝癌甚至肝衰竭的關(guān)鍵因素。

1 急性肝損傷模型的建立

為了更深入地了解肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，國內(nèi)外研究者利用各種肝損傷動物模型來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，相繼建立了一系列用于模擬急性肝損傷的動物模型，包括有四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)誘導(dǎo)的化學(xué)性肝損傷模型，刀豆球蛋白(concanavalin，Con)A、半乳糖胺(D-GalNactosamine，D-GalN)/脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)等誘導(dǎo)的免疫性肝損傷(immunological liver injury，ILI)模型；對乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)誘導(dǎo)的藥物性肝損傷模型；給予含乙醇飼料誘導(dǎo)的酒精性肝損傷模型等。研究發(fā)現(xiàn)，不同的肝損傷動物模型是由不同的發(fā)病機(jī)制介導(dǎo)的。

1.1 CCl4CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷模型是目前國際最常用的模型之一。CCl4作為一種親肝的細(xì)胞毒性物質(zhì)，能迅速被肝和腦吸收，目前對CCl4的肝臟毒性作用機(jī)制研究有很多，最得到公認(rèn)的機(jī)制主要是自由基的形成及引發(fā)的鏈?zhǔn)竭^氧化反應(yīng)。CCl4得到肝細(xì)胞的細(xì)胞色素P450的激活，生成自由基物質(zhì)CCl3·和CCl3OO·，這些自由基會對膜結(jié)構(gòu)上的多不飽和脂肪酸產(chǎn)生攻擊，促使細(xì)胞膜、線粒體膜等生物膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化，從而導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，后者反過來還能對各種生物膜造成進(jìn)一步的損傷，使其穩(wěn)定性和完整性降低、通透性增加，造成細(xì)胞內(nèi)各種酶的溢出以及其他細(xì)胞損傷，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞的凋亡與壞死。自由基除了可以引起生物膜脂質(zhì)過氧化，還會與膜上脂質(zhì)及蛋白質(zhì)分子發(fā)生不可逆結(jié)合，對細(xì)胞膜和微粒體膜上鈣泵的活性產(chǎn)生抑制，增加Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的紊亂，最后引起肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的損傷，使細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶溢出進(jìn)入血液，從而造成血清中ALT、AST含量的異常升高。血清中各種轉(zhuǎn)氨酶活性高低是判定肝細(xì)胞受損傷程度的重要指標(biāo)，臨床上用于反映肝細(xì)胞的損傷程度。

1.2 D-GalN/LPS 腹腔注射LPS以及D-GalN是構(gòu)建小鼠急性肝損傷模型的較為便捷的方法。LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁表面的成分，據(jù)報道它可以引發(fā)內(nèi)毒素?fù)p傷，可通過刺激包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)的免疫細(xì)胞釋放炎癥因子，從而使肝細(xì)胞發(fā)生凋亡與壞死[3]。在D-GalN誘導(dǎo)的肝臟毒性模型中，對mRNA合成的抑制和對糖復(fù)合物的轉(zhuǎn)移后修飾的部分抑制是關(guān)鍵步驟。繼發(fā)損傷中，巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞被激活，炎癥反應(yīng)進(jìn)一步發(fā)展為肝細(xì)胞凋亡。毒性劑量的D-GalN是通過耗竭三磷腺苷、抑制大分子合成導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死的。另外，也有研究認(rèn)為D-GalN通過包括脂質(zhì)過氧化物在內(nèi)的氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)因子來介導(dǎo)氧化應(yīng)激的產(chǎn)生。有報道稱包含自由基的反應(yīng)在D-GalN介導(dǎo)的壞死中有重要的作用。有研究證明，降低線粒體DNA的表達(dá)水平會導(dǎo)致線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體和ATP合酶的活性下降，從而導(dǎo)致活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生，ROS在多種肝損傷模型中都是造成損傷的主要物質(zhì)[4]。在LPS和D-GalN的協(xié)同作用下，實(shí)驗(yàn)動物的肝細(xì)胞在短時間內(nèi)大量死亡，肝臟生理功能嚴(yán)重受損。

1.3 對乙酰氨基酚 對乙酰氨基酚是世界范圍內(nèi)廣泛使用的解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥，它在治療劑量下的合理使用是相對安全的，但是高劑量的APAP會導(dǎo)致肝臟毒性，這使得APAP成為急性肝損傷的主要致病原因之一[5]。在美國，每年約56 000人因過量服用APAP所致肝損傷就診于急診室，2 600人住院治療，500人死亡。我國目前也有過量服用APAP致死的病例報道，APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷已然成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。

正常情況下，APAP會被葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucuronosyltransferases，UGTs)或硫酸轉(zhuǎn)移酶(sulfotransferases，SULTs)催化成無毒代謝物。過量的APAP會使機(jī)體的醛糖酸化反應(yīng)通路和硫酸鹽化反應(yīng)通路飽和，多余的APAP在細(xì)胞色素P450酶系統(tǒng)的作用下生成具有高毒性的活性中間物N-乙酰-P-苯并醌亞胺(n-acetyl-p-benzoquinone-imine，NAPQI)。正常情況下NAPQI會被谷胱甘肽(glutathione，GSH)解毒，進(jìn)而被多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance-associated protein，MRP)轉(zhuǎn)移進(jìn)入尿液。然而大量堆積的NAPQI會耗竭GSH，導(dǎo)致氧化應(yīng)激最終引發(fā)肝細(xì)胞損傷[6]。

1.4 酒精性肝損傷 酒精攝入過量，無論是長期性還是一次性，都是重要的社會、經(jīng)濟(jì)和臨床問題，它已成為世界排名第五的可預(yù)防性致病致死原因。酒精攝入過量是世界范圍內(nèi)多臟器病變的致病因素，這其中就包括酒精性肝病。酒精性肝病是一系列臨床疾病，包括脂肪肝(steatosis)、酒精性肝炎(alcoholic hepatitis，AH)，甚至有可能進(jìn)一步發(fā)展為更嚴(yán)重的疾病如肝纖維化和肝癌。乙醇主要在肝臟代謝，被氧化為乙醛后與肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)乙醇脫氫酶作用并產(chǎn)生大量H+，導(dǎo)致異常的氧化應(yīng)激反應(yīng)，并且影響脂肪代謝，促進(jìn)α-磷酸甘油合成甘油三酯，最終導(dǎo)致肝臟的脂肪堆積；另有少部分經(jīng)肝細(xì)胞微粒系統(tǒng)催化產(chǎn)生大量自由基，導(dǎo)致肝細(xì)胞損害。同時，乙醇可增加腸道通透性及促進(jìn)內(nèi)毒素從腸道進(jìn)入門靜脈系統(tǒng)，誘導(dǎo)內(nèi)毒素血癥，刺激庫普費(fèi)細(xì)胞(kuffer cells，KC)產(chǎn)生大量細(xì)胞因子，導(dǎo)致肝臟炎性損傷[7]。

2 通路研究進(jìn)展

2.1 Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Keap1)-核因子E2相關(guān)蛋白2(Nrf2) Nrf2被認(rèn)為是應(yīng)對氧化應(yīng)激最主要的調(diào)節(jié)因子之一，Keap1-Nrf2通路在氧化應(yīng)激和外源性物質(zhì)應(yīng)激中都扮演著重要的保護(hù)作用。Nrf2(NF-E2 related factor 2)是bZip(basic region-leucine zipper)類轉(zhuǎn)錄因子，它屬于Cap′n′collar(CNC)家族。Keap1(Kelch-like ECH-associated protein 1)是Cullin3為基底的泛素E3連接酶調(diào)節(jié)蛋白，它在非應(yīng)激狀態(tài)下會抑制Nrf2的活性。在非應(yīng)激條件下，Keap1與Nrf2連接停留在細(xì)胞質(zhì)中，并促進(jìn)Nrf2的泛素化；Nrf2不斷地被蛋白酶體降解[8]；Keap1可以對多種刺激產(chǎn)生反應(yīng)，其中包括活性氧(reactive oxygen species，ROS)、活性一氧化氮(reactive nitrogen oxide species，RNOS)和總金屬。當(dāng)受到刺激時，Keap1-Cul3復(fù)合體的泛素E3連接酶活性下降，Keap1失去活性，從而使得Nrf2穩(wěn)定存在。失活的Keap1不會和Nrf2解偶聯(lián)，因此從頭合成的Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。Small Maf蛋白包括MafG、MafK和MafF，它們屬于Maf轉(zhuǎn)錄因子家族，該蛋白可以和CNC轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，如NF-E2 p45、Nrf1、Nrf2、Nrf3、Bach1和Bach2，形成異二聚體。Nrf2和其他的CNC蛋白不能直接與DNA發(fā)生結(jié)合，所以需要與Small Maf形成異源二聚體共同參與到轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中。因此，缺乏Small Maf蛋白會減弱Nrf2的激活。Nrf2與Small Maf蛋白組成的異源二聚體激活相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，其中包括解毒酶相關(guān)基因和抗氧化相關(guān)基因，從而起到該通路的抗氧化活性。該二聚體首先和相關(guān)的順式調(diào)節(jié)元件結(jié)合，這些和編碼解毒酶相關(guān)基因的激活相關(guān)的順式調(diào)節(jié)元件被稱為抗氧化反應(yīng)原件(antioxidant response element，ARE)[9]。

Nrf2作為重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可以通過與ARE結(jié)合上調(diào)多種酶的含量，包括MRPs、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferases，GSTs)、NAD(P)H醌氧化還原酶1(Nicotinamide quinone oxidoreductase1，NQO1)和血紅素氧化酶(hemeoxygenase，HO-1)，從而產(chǎn)生細(xì)胞保護(hù)作用，有效應(yīng)對氧化應(yīng)激[10]。HO-1是一種關(guān)鍵的保護(hù)酶，它可以對炎癥導(dǎo)致的臟器損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。許多實(shí)驗(yàn)表明，抑制HO-1會造成炎癥調(diào)節(jié)因子表達(dá)明顯增加，反之，增強(qiáng)HO-1的酶活性能降低這些因子的表達(dá)。同時也有實(shí)驗(yàn)表明，HO-1對LPS造成的臟器損傷也有保護(hù)作用[11]。

Ramos-Tovar等[12]的實(shí)驗(yàn)證明，Nrf2作為內(nèi)源性的細(xì)胞保護(hù)系統(tǒng)可以激活抗氧化酶的表達(dá)，降低活性代謝物的水平；CCl4造成的小鼠急性肝損傷中，Nrf2的表達(dá)水平下降。Liu等[13]的實(shí)驗(yàn)證明，在ConA誘導(dǎo)的急性肝損傷模型中，相較于野生型小鼠，Nrf2敲除的小鼠損傷更嚴(yán)重；給予Nrf2的激活劑CDDO-Im，相較于Nrf2敲除的小鼠，特異性敲除肝臟中Keap1的小鼠和野生型小鼠損傷明顯減少。González-Rodríguez等[14]的實(shí)驗(yàn)用針對Keap1的小干擾RNA(short interfering RNA，siRNA)來研究Nrf2在急性肝損傷中的作用：小鼠尾靜脈分別注射包含Keap1- siRNA和空白siRNA的脂質(zhì)體，48 h后用ConA誘導(dǎo)急性肝損傷模型，結(jié)果顯示，沉默肝臟中的Keap1，從而激活Nrf2，可以減輕ConA誘導(dǎo)的炎癥相關(guān)肝臟損傷。

2.2 TLR4 通過Toll樣受體4(Toll-Like receptor-4，TLR4)引起固有免疫系統(tǒng)的激活是多種病原學(xué)導(dǎo)致的肝臟炎性疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，例如酒精性脂肪肝炎(alcoholic steatohepatitis，ASH)、非酒精性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、藥物氧化毒性、肝臟免疫疾病和肝移植排斥反應(yīng)。TLRs是一類模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)。PRRs起初被認(rèn)為是與對微生物攻擊的反應(yīng)有關(guān)，它通過感受/探測特殊的病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，例如脂多糖、微生物多肽，蛋白質(zhì)(胞壁二酰肽，鞭毛蛋白)和雙鏈核糖核酸(double-stranded ribonucleic acids，dsRNA)，并觸發(fā)一系列的免疫反應(yīng)。近年來發(fā)現(xiàn)，PRRs不僅可以識別微生物信號，還可以識別機(jī)體內(nèi)部的“危險”信號(danger-associated molecular patterns，DAMPs)，包括代謝紊亂引起的飽和脂肪酸、磷脂質(zhì)、膽固醇結(jié)晶、尿酸鈉結(jié)晶、淀粉樣β蛋白和細(xì)胞外ATP[9]。

TLR4在肝臟所有細(xì)胞中都有表達(dá)，但是在肝巨噬細(xì)胞上表達(dá)量最多。配體與TLR4的結(jié)合會激活一系列細(xì)胞內(nèi)信號通路，這種激活作用可以通過兩條不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路產(chǎn)生： MyD88(myeloid differentiation primary responsegene 88)依賴途徑和TRAM-TRIF依賴途徑。TLR4通過上述兩條通路引起核轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，如絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信號通路、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)和激活蛋白-1(activation protein-1，AP-1)。上述信號通路會進(jìn)一步激活特定基因的轉(zhuǎn)錄，上調(diào)炎癥因子的表達(dá)，包括TNF-α、IL-6和IL-1b等，導(dǎo)致炎癥的產(chǎn)生。

Ning等[15]的實(shí)驗(yàn)表明，D-GalN/LPS導(dǎo)致的急性肝損傷模型能增加TLR4的表達(dá)，并提高TNF-α、IL-1β和IL-6的轉(zhuǎn)錄；將TLR4的阻斷劑TAK-242能夠減少上述炎癥因子的表達(dá)。Tang等[16]的實(shí)驗(yàn)表明，酒精介導(dǎo)的小鼠急性肝損傷中，肝臟中TLR4及其下游的NF-κB的表達(dá)量顯著上升。Jia等[17]的實(shí)驗(yàn)證明，酒精造成的急性肝損傷模型中，小鼠特異性敲除肝細(xì)胞TLR4可以減少肝臟損傷。

2.3 NLRP3 人類胞質(zhì)中的NLRs家族已知有22個成員，分為5個亞家族：NLRA、NLRB、NLRC、NLRP和NLRX。所有成員均包含一個NACHT結(jié)構(gòu)域，這個結(jié)構(gòu)域與低聚反應(yīng)(oligomerization)相關(guān)，另有一個C端亮氨酸富集重復(fù)結(jié)構(gòu)域，這個結(jié)構(gòu)域參與PAMPs和DAMPs的感知。NLR不同亞家族靠N端效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域區(qū)分，該結(jié)構(gòu)域賦予各NLRs不同的特性。NLRP亞家族的成員包含一個熱蛋白結(jié)構(gòu)域(pyrin domain，PYD)，功能是把NLR受體分子和下游銜接蛋白及效應(yīng)分子連接起來，它的主要功能是組合多蛋白炎癥復(fù)合體，也稱為炎癥復(fù)合體，以此對應(yīng)激信號產(chǎn)生反應(yīng)。其中，NLRP3炎癥復(fù)合體是研究比較透徹的。被PAMPs和DAMPs激活后，NLRP3通過募集凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein，ASC)形成NLRP3炎癥復(fù)合體，這個復(fù)合體包含一個N端的PYD，一個C端的胱天蛋白募集域蛋白(caspase activation and recruitment domain，CARD)，和一個caspase-1酶原，它是激活caspase-1的先決條件。隨后，被激活的caspase-1將IL-1β和IL-18切割成活性形式，因此導(dǎo)致細(xì)胞的程序性死亡[18]。

細(xì)胞質(zhì)中形成NLPR3炎癥復(fù)合體(復(fù)合體包括NLRP3、caspase-1和ASC)需要兩個步驟：①第一步，第一信號通過TLR-NF-κB使炎癥復(fù)合體各組分轉(zhuǎn)錄增多，包括NLRP3、pro-IL-1β和pro-IL-18。這一步是必需的，因?yàn)镹LRP3在靜息的細(xì)胞中的基礎(chǔ)表達(dá)量不足以有效激活炎癥復(fù)合體。②第二信號(ATP、草酸結(jié)晶等)使NLRPs產(chǎn)生同源低聚，組成活化狀態(tài)的復(fù)合體，該復(fù)合體可以將前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為具有生物活性的IL-1β和IL-18[9]。因此，抑制NLRP3炎癥小體的活化可能是控制炎癥反應(yīng)在合理范圍的良好策略。

Pourcet等[19]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腹膜巨噬細(xì)胞中NLRP3的調(diào)節(jié)需要NR1D1，人或小鼠敲除NR1D1的原代巨噬細(xì)胞中NLRP3的表達(dá)發(fā)生改變，IL-1β和IL-18的表達(dá)也會發(fā)生改變；將巨噬細(xì)胞和NR1D1的激活劑SR9009共培養(yǎng)可以減少NLRP3的表達(dá)和細(xì)胞因子的分泌，給予NLRP3的抑制劑MCC950可以減輕D-GalN/LPS誘導(dǎo)的急性肝損傷。Gehrke等[20]的實(shí)驗(yàn)證明，相較于野生型小鼠，敲除肝臟IL-1R1的小鼠在給予D-GalN/LPS后4 h肝臟中NLRP3和caspase-1的轉(zhuǎn)錄明顯減少，實(shí)驗(yàn)表明，肝細(xì)胞中IL-1R1的表達(dá)減少會影響NLRP3通路，減少細(xì)胞凋亡，減少可能導(dǎo)致肝臟炎癥的炎癥調(diào)節(jié)因子的釋放。

3 總結(jié)

急性肝損傷是許多肝臟疾病的起始狀態(tài)，探究其發(fā)生的機(jī)制，是藥物研發(fā)的關(guān)鍵。目前認(rèn)為，急性肝損傷的發(fā)病機(jī)制與氧化應(yīng)激和炎癥有著密切的關(guān)系。Nrf2是氧化應(yīng)激的重要調(diào)節(jié)因子之一，這也是其成為應(yīng)對急性肝損傷可能的通路之一。靜息狀態(tài)下，Keap1與Nrf2結(jié)合，使后者泛素化從而停留在細(xì)胞質(zhì)中；受到刺激后，Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)解毒和抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)，對急性肝損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。TLR4是一類模式識別受體，可以對體內(nèi)外產(chǎn)生的多種危險因素發(fā)生響應(yīng)，該通路激活后會導(dǎo)致炎癥細(xì)胞分泌炎癥因子，破壞肝臟穩(wěn)態(tài)。NLRP3被激活后會形成炎癥復(fù)合體，產(chǎn)生具有活性的caspase-1，后者將IL-1β和IL-18的前體切割成有活性的形式，從而導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡。上述3條通路都為解釋急性肝損傷的產(chǎn)生提供了思路，也是研發(fā)治療藥物的可能靶點(diǎn)。