創(chuàng)傷性腦損傷動物模型的研究進展

周建國綜述，唐華民審校

0 引 言

創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是一種由外力引發(fā)的顱內(nèi)損傷，這種外力可來自于打擊、撞擊、子彈、甚至是爆炸［1］。TBI主要導(dǎo)致神經(jīng)細胞壞死，引起繼發(fā)性損傷級聯(lián)反應(yīng)，包括：興奮性中毒、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、血腦屏障（bloodbrain barrier，BBB）破壞和神經(jīng)炎癥［1-3］。為了進一步研究TBI的病理生理機制及其治療措施，從20世紀80年代開始先后研發(fā)了很多種類的TBI動物模型，目前有以下幾種模型被廣泛應(yīng)用于實驗研究：即重物墜落損傷模型（weight-drop injury models，WDI），液壓沖擊損傷模型（fluid percussion injury models，F(xiàn)PI），控制性皮質(zhì)損傷模型（controlled cortical impact injury models，CCI），穿透彈道式腦損傷模型性（penetrating ballistic-like brain injury models，PBBI），爆炸傷模型（blast injury models，bTBI）等。本文將對這5種模型的造模原理和特點作一綜述。

1 WDI模型

大多數(shù)WDI模型的基礎(chǔ)是將輕度麻醉的動物暴露顱骨（有或沒有開顱手術(shù)）后，通過自由落體的重物引起損傷。TBI的嚴重程度可以通過調(diào)整重物的重量或釋放的高度來控制，損傷的性質(zhì)和神經(jīng)功能缺損取決于受傷部位（中央或外側(cè)）和生物力學(xué)。最常用的WDI模型是Fenney等［4］的局灶性損傷，Marmarou等［5］的彌漫性損傷和 Shohami等［6］的混合性局灶/彌漫性損傷。

1.1 Fenney模型在Fenney的重物墜落模型中，通過開顱手術(shù)，將重量傳遞至完整的硬腦膜引起皮質(zhì)損傷［4，7］。從形態(tài)學(xué)上看，這些損傷是由損傷后頭幾個小時內(nèi)直接在挫傷皮層處發(fā)生的白質(zhì)出血以及24h壞死腔的發(fā)展而引起的［4］。然而，這種損傷模型近年來已經(jīng)不受歡迎，可能是因為需要開顱手術(shù)。

1.2Marmarou模型Marmarou的沖擊加速度WDI模型用于誘導(dǎo)彌漫性軸索損傷（diffuse axonal injury，DAI）模型，模擬人類跌倒或機動車事故引起的彌漫性 TBI［5］。在 Marmarou 模型中，將麻醉動物作頭皮中線切口以暴露顱骨，然后將其頭部固定在金屬盤上，以防止顱骨骨折；置大鼠于泡沫床，將黃銅的重量落到金屬盤上使大鼠頭部受到撞擊［5］。動物死亡的原因主要是因為閉合性頭部損傷（closed head injury，CHI）引起的呼吸抑制，繼而出現(xiàn)了低血壓等癥狀。該模型能夠在嚙齒類動物中產(chǎn)生分級腦損傷，而不會產(chǎn)生大幅度的高血壓波動或過度的腦干損傷［5］。單次和重復(fù)性mTBI均可引起視神經(jīng)/管、小腦、皮質(zhì)脊髓束、外側(cè)淋巴結(jié)和胼胝體的創(chuàng)傷性軸索損傷［8］。在顯微鏡下，該模型產(chǎn)生大腦神經(jīng)元、軸突和微脈管系統(tǒng)的分級廣泛損傷，還可導(dǎo)致大量DAI，主要涉及胼胝體、內(nèi)囊、視神經(jīng)、大腦腳和腦干等［9］。Ezaki等［10］使用Marmarou模型，提出外周撞擊力不能誘導(dǎo)TBI小鼠中海馬的CA1區(qū)、CA3區(qū)神經(jīng)元變性；此外，除了外周撞擊力或頭皮切口以外的因素也可能引起海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)神經(jīng)元變性。Buchele等［11］介紹了一種新型閉合性彌漫性TBI大鼠模型，它可能更接近地模仿人類額葉損傷機制，出現(xiàn)創(chuàng)傷后慢性認知缺陷以及DAI。

1.3Shohami模型Shohami等［6］研究小組介紹了一種用于CHI的嚙齒動物模型，被廣泛用于誘導(dǎo)混合性局灶/彌漫性損傷。使用標準化的WDI裝置在未受保護的顱骨上誘發(fā)損傷，可導(dǎo)致神經(jīng)損傷和BBB功能破壞。Shultz等［12］研究證實損傷后會出現(xiàn)神經(jīng)炎癥、水腫和BBB破壞。產(chǎn)生CHI后對小鼠進行神經(jīng)功能損傷程度評分（neurological severity scores，NSS）的最佳時間為1h［13］。進行NSS評估可以了解動物的運動功能、警覺性和尋求行為的神經(jīng)功能障礙。動物的神經(jīng)損傷嚴重程度與腦損傷的嚴重程度高度相關(guān)。WDI模型裝置簡單，易于操作，實驗可控，能夠復(fù)制分級腦損傷，成本較低，因此得到普遍應(yīng)用。但是動物腦損傷死亡率較高，穩(wěn)定性、重復(fù)性較差。

2 FPI模型

FPI模型率先由Dixon等［14］于1987年建立，操作過程是將麻醉的動物置于立體定位框中，切開頭皮，在前囟和人字縫的中間、矢狀縫上方鉆出直徑為4.8 mm的孔，通過鐘擺撞擊液體儲存器活塞，對骨窗施加液體壓力脈沖，撞擊造成腦組織的短暫位移、變形，從而導(dǎo)致彌漫性腦損傷，損傷的嚴重程度取決于壓力脈沖的強度［15］。根據(jù)開顱手術(shù)距離矢狀縫的位置，可將FPI模型分為中線（以矢狀縫為中心），矢狀縫旁（距離中線＜3.5mm）和側(cè)方液壓模型（距離中線＞3.5mm）。LFPI模型是目前使用最廣泛的TBI動物模型之一，主要用于嚙齒動物［16］。Reid等［17］用LFPI模型研究創(chuàng)傷后癲癇（Posttraumatic epilepsy，PTE），結(jié)果顯示FPI導(dǎo)致早期帶尖峰高頻震蕩和來自周圍的新皮質(zhì)引起自發(fā)性局灶性癲癇發(fā)作，癲癇的嚴重程度隨著時間的推移而增加，并與損傷嚴重程度有關(guān)，說明了LFPI可用作PTE模型。Wahab等［18］建立了一個音圈驅(qū)動液壓損傷裝置，該裝置的特點：①可重復(fù)性出現(xiàn)液壓沖擊損傷，能夠控制損傷的速度和程度；②產(chǎn)生的損傷結(jié)果與常用的鐘擺式FPI系統(tǒng)一致，具有與不同損傷程度和持續(xù)時間相關(guān)的病理生理學(xué)的研究能力；③FPI的死亡率與損傷的上升時間密切相關(guān)。Hameed等［19］建立了快速側(cè)方液壓模型（rapid lateral fluid percussion Injury，rLFPI），該模型能快速、可重復(fù)的造出癲癇性損傷模型，并能夠縮短手術(shù)和麻醉時間；rLFPI模型可導(dǎo)致外傷性癲癇發(fā)作和區(qū)域性膠質(zhì)細胞增生，局限于腦皮質(zhì)的細胞凋亡和健側(cè)腦室擴大的慢性病理變化。

FPI模型可以精確控制致傷部位和打擊方向，并輸出精準的沖擊壓力，應(yīng)用范圍較廣。但骨窗處需要用骨水泥連接打擊帽，每次打擊前均需矯正，造模效率較低，且器材昂貴。此外，與其他動物模型相比，具有較高的死亡率，這可能是由于腦干損傷時間延長導(dǎo)致呼吸驟停。

3 CCI模型

CCI，有時是指皮質(zhì)挫傷，是一種使用受控的氣動或電磁裝置［20-23］，將沖擊器驅(qū)動至暴露的完整硬腦膜上，直接誘導(dǎo)皮質(zhì)損傷。CCI模型最先是由Lighthall等［20］建立，該設(shè)備由加壓氣體（即氣動驅(qū)動）驅(qū)動，目前氣動CCI仍然廣泛用于研究TBI病理生理學(xué)和測試新療法［21-22］。與氣動CCI裝置一樣，電磁CCI裝置選擇傳統(tǒng)的與商用立體框架結(jié)合使用，便于調(diào)節(jié)沖擊角度；有些設(shè)備還與可以提升傷害裝置，與關(guān)節(jié)支撐臂兼容，以便于在豬和其他大型動物中建立CCI模型。目前很少有研究證據(jù)比較氣動和電磁模型；然而，一項研究表明，與氣動CCI相比，電磁CCI具有更高的可重復(fù)性［23］。

CCI模型被稱為最精準的模型之一，迅速地成為臨床前TBI最常用的模型之一。其最常用于實驗室大鼠及小鼠上，也可適用于大型動物上，如豬和非人靈長類動物。操作過程是將麻醉動物置于立體定位框架中，在前囟和人字縫之間選擇預(yù)定的坐標進行單側(cè)開顱手術(shù)，然后通過氣動或電磁裝置以給定的速度將驅(qū)動剛性撞擊頭至給定的深度，沖擊完整的硬腦膜，造成皮質(zhì)損傷。這種模型的優(yōu)勢在于可以調(diào)整CCI操作中的參數(shù)，例如：深度、速度、沖擊或停頓時間，沖擊器尖端的大?。?4］。由于可以調(diào)整許多參數(shù)，因此可以通過多種方式來實現(xiàn)更輕度的CCI模型，比如：減小沖擊深度，降低沖擊速度，減小尖端的大小［24］。電磁CCI研究發(fā)現(xiàn)，保持尖端大小、停頓時間和速度（分別是3.5 mm，0.1 s，5.25 m/s）恒定，隨著沖擊深度（分別是1.5、2.0、2.5 mm）、損傷的程度逐漸增加，認知功能障礙逐漸增加，但是沒有情緒障礙［25］。有文獻表明，TBI患者的執(zhí)行功能障礙與腦損傷嚴重程度直接相關(guān)［26］。已知CCI后的大體組織學(xué)變化包括：皮質(zhì)挫傷，血腦屏障破壞，海馬細胞損失和總體腦容量丟失，還會導(dǎo)致灰/白質(zhì)萎縮、慢性腦室擴大、細胞凋亡、壞死、軸突損傷和炎癥。CCI模型的功能缺陷體現(xiàn)在多方面，包括整體神經(jīng)功能、記憶、學(xué)習(xí)、運動功能和額葉功能。CCI模型還可以用于PTE的研究［27］。有研究報道，使用CCI誘導(dǎo)TBI模型在一年后出現(xiàn)了一些病理生理學(xué)改變，包括慢性小膠質(zhì)細胞活化，病變體積擴大、海馬神經(jīng)元變性、腦室擴大、髓鞘丟失和膽堿能神經(jīng)元代償反應(yīng)［28-29］。

CCI模型有幾個顯著的優(yōu)勢：①可以高度控制損傷參數(shù)，造模穩(wěn)定；②具有臨床相關(guān)性，可產(chǎn)生類似于人類TBI方面的形態(tài)學(xué)和腦血管損傷反應(yīng)；③可用于模擬整個壽命期間的損傷。盡管CCI可以操控損傷參數(shù)以用來控制傷害嚴重程度，但在實驗室中對于輕度、中度或嚴重的損傷沒有標準化。此外，該裝置價格比較昂貴，需要經(jīng)常維護，實驗精度要求較高。

4 PBBI模型

PBBI是一種穿透性創(chuàng)傷性腦損傷大鼠模型，通常是由于高能量彈頭和沖擊波造成，在腦部形成一個暫時的空洞，空洞體積是彈頭本身大小的許多倍［30］。腦組織損傷和臨床表現(xiàn)主要取決于解剖路徑和能量傳遞的程度［31］。PBBI從腦出血狀態(tài)（0～6h）發(fā)展為核心區(qū)域的細胞壞死，嗜中性粒細胞（24h）和巨噬細胞（72h）浸潤，遠離核心病灶區(qū)域的神經(jīng)元和纖維束（丘腦，內(nèi)外囊和大腦腳）退化［32］。PBBI后，IL-1β、IL-18、半胱天冬酶-1（caspase-1）、半胱氨酸蛋白酶激活區(qū)凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）、X-連鎖凋亡抑制蛋白和NOD樣受體蛋白3的表達在48h左右達到高峰；來自PTBI動物的腦蛋白裂解物顯示通過ASC梯度證明了巨噬細胞形成，在損傷后48h還有g(shù)asdermin-D的持續(xù)表達；ASC在活化的小膠質(zhì)細胞中表達持續(xù)到傷后12周［33］。PBBI亦可出現(xiàn)BBB［34］，繼而引起神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞的突然中斷和快速破壞，導(dǎo)致血液中早期生物標志物出現(xiàn)［35］。經(jīng)PBBI誘導(dǎo)后的大鼠，聯(lián)合低氧血癥和失血性休克會進一步降低丙酮酸水平，增加乳酸/丙酮酸比例，加劇創(chuàng)傷后代謝紊亂［36］?？梢允褂肕orris水迷宮來評估PBBI大鼠模型認知缺陷［37］。PBBI可以誘發(fā)產(chǎn)生灰/白質(zhì)損傷，腦腫脹，癲癇發(fā)作，神經(jīng)炎癥，認知障礙［38-39］?，F(xiàn)今，包括抗癲癇藥物、神經(jīng)生長因子和人類神經(jīng)干細胞移植在內(nèi)的治療性研究已經(jīng)得到相應(yīng)評估［38-40］。

PBBI的幾種病理生理學(xué)特征與其他TBI模型相似，但由于損失的穿透性及形成的暫時性空腔，其在原發(fā)病灶中會引起廣泛的顱內(nèi)出血［7］。

5 bTBI模型

bTBI在作戰(zhàn)軍人的頭部受傷中比較常見。由于伊拉克和阿富汗戰(zhàn)爭，美國武裝部隊頭部受傷的情況一直在上升。在伊拉克自由行動中的一個作戰(zhàn)地點研究表明，有78%受傷是由簡易爆炸裝置引起［41］。越靠近爆炸地點，傷勢往往越重。值得注意的是，即使是較小的bTBI也會產(chǎn)生長期或遲發(fā)性認知、神經(jīng)精神癥狀［42］。為了有助于更好地理解bTBI以降低軍人的發(fā)病率、死亡率，許多bTBI實驗室正在模擬類似于爆炸物產(chǎn)生的爆炸波。即將動物置于激波管中，并暴露于由氣壓或爆炸引起的爆炸波中。爆炸波會損害大腦血管、神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、BBB破壞，以及小膠質(zhì)細胞激活和神經(jīng)炎癥［43］。和其他損傷模型一樣，bTBI也會出現(xiàn)腦室擴大、灰/白質(zhì)萎縮、軸突損傷、細胞凋亡、神經(jīng)炎癥等病理結(jié)果［43-44］。沖擊波引起的腦損傷機制目前尚不清楚，但有研究者認為：①沖擊波引起聲阻抗失諧，導(dǎo)致腦組織中的沖擊泡沫效應(yīng)；②爆炸可能導(dǎo)致體腔內(nèi)壓力增加，誘發(fā)血液涌入大腦產(chǎn)生大腦功能障礙［45］；③ 線粒體功能障礙［46］。Ning等［47］發(fā)現(xiàn)咖啡因在bTBI后不同階段可以對興奮性中毒、炎癥、星形膠質(zhì)細胞增生和神經(jīng)元損失起神經(jīng)保護作用，長期服用咖啡因可改善記憶功能障礙。此外，腺苷A1受體表達上調(diào)可能對慢性咖啡因消耗起到有利影響，可以為針對bTBI的腺苷受體的靶向治療提供可行性策略［47］。BCI-838（第II組代謝型谷氨酸受體拮抗劑前藥）可用于逆轉(zhuǎn)bTBI大鼠模型中的創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（posttraumatic stress disorder，PTSD）相關(guān)特征，改善焦慮、恐懼和長期識別記憶［48］。

隨著bTBI研究的發(fā)展，研究應(yīng)特別注意以下幾個方面：①bTBI發(fā)病率高，會產(chǎn)生長期的后遺癥和PTSD，影響軍人的作戰(zhàn)能力；②需要開發(fā)便攜式人員保護裝備，盡可能減少傷員的長期認知功能障礙；③bTBI機制涉及多學(xué)科，需加強力學(xué)、數(shù)學(xué)、計算機專家的合作，以獲得“全新”突破；④體內(nèi)成像技術(shù)，高分辨率成像技術(shù)等先進技術(shù)的應(yīng)用將有助于深入闡明爆炸傷害并提出系統(tǒng)的解決方案［49］。

總的來說，與實驗性TBI的急性效應(yīng)相比，慢性效應(yīng)仍然表現(xiàn)不佳。雖然TBI動物模型復(fù)制了臨床上觀察到的大部分組織病理學(xué)和功能結(jié)果，但現(xiàn)有的動物模型不能完全復(fù)制人類TBI，研究人員在使用實驗性TBI模型時需要謹慎考慮，以確保選擇最合適的模型來解決研究問題。