微RNA與缺血性腦卒中的研究進(jìn)展

周 瑩，孟繁興，劉雪梅，張?jiān)蕩X，王鳳麗※

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院 a.腦病一科，b.實(shí)驗(yàn)中心，北京 100078；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院腦病科，北京 100091)

缺血性腦卒中是由短暫或永久性的局部腦血流減少引起的一種主要腦血管病，其特征是動(dòng)脈阻塞，故又稱腦梗死，占全球卒中的50%～85%[1]。世界衛(wèi)生組織稱，全球范圍內(nèi)受卒中影響的人數(shù)超過1 500萬，直接導(dǎo)致約570萬(16.6%)人死亡，造成約500萬患者終身殘疾，并有約430萬患者因殘疾死亡[2]。目前，在狹窄的時(shí)間窗內(nèi)(發(fā)病3～4.5 h)溶栓(重組組織型纖溶酶原激活劑)治療是治療缺血性腦卒中的唯一急性措施，因此及時(shí)恢復(fù)或改善局部腦血供對(duì)于改善腦卒中預(yù)后和腦卒中后功能恢復(fù)至關(guān)重要[3]，但受嚴(yán)格的時(shí)間窗限制，僅有3.4%～5.2%的患者獲得救治[4]，超出溶栓時(shí)間窗，提高腦梗死的臨床診療水平一直是醫(yī)學(xué)界關(guān)注的重點(diǎn)。腦缺血過程通常伴隨微RNA(microRNA，miRNA)表達(dá)譜異常，miRNA通過降解靶mRNA參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生、發(fā)育、病理損傷和修復(fù)過程[5]。miRNA幾乎參與所有的生物學(xué)過程，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切?，F(xiàn)就近年來miRNA與缺血性腦卒中的關(guān)系進(jìn)行綜述，為缺血性腦卒中的診斷、治療及預(yù)后提供新策略。

1 miRNA的生物合成及作用機(jī)制

miRNA是一類長(zhǎng)19～22個(gè)核苷酸的小型非編碼RNA，與信使RNA的3′端非翻譯區(qū)結(jié)合，介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控[6]。miRNA的合成和成熟分為兩個(gè)階段，即形成初級(jí)miRNA和前體miRNA[7]。在RNA聚合酶Ⅱ的作用下細(xì)胞核中編碼miRNA的基因轉(zhuǎn)錄成初級(jí)miRNA；再被核糖核酸酶(Drosha和Dgcr8)[8]加工形成長(zhǎng)約70個(gè)核苷酸單位的莖環(huán)前體miRNA；此時(shí)細(xì)胞核內(nèi)的前體miRNA通過核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)送至細(xì)胞質(zhì)，由Dicer酶處理為成熟的miRNA產(chǎn)物[9]，成熟的miRNA產(chǎn)物加載到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物中，與Argonaute(Ago)1～4[10]蛋白家族結(jié)合形成沉默復(fù)合物，并導(dǎo)向靶信使RNA，通過翻譯抑制和靶信使RNA降解[11]來調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而發(fā)揮調(diào)控作用[12]。

2 miRNA與靶向治療

缺血性腦卒中臨床多急性起病，因腦部局灶缺血可形成復(fù)雜的級(jí)聯(lián)反應(yīng)(腦缺血缺氧→能量代謝障礙→興奮性神經(jīng)介質(zhì)釋放→自由基反應(yīng)→鈣過量?jī)?nèi)流→細(xì)胞凋亡)稱為“缺血瀑布”。已有研究表明，miRNAs可用于治療特定疾病，miRNA治療的優(yōu)點(diǎn)之一是可以人工合成miRNA模擬物和抑制劑改變內(nèi)源性miRNA水平，目前已用于癌癥和丙型肝炎治療[13]。研究表明，miRNA分布廣泛，作用于缺血性腦卒中的后循環(huán)和腦組織中[14]，并參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一些病理過程，阿爾茨海默病和多發(fā)性硬化也均與miRNA的特異性改變有關(guān)，表明miRNA可以作為臨床的生物標(biāo)志物，獲得來源于外周血的“液體活檢”[15]。miRNA和靶基因共同參與多種與缺血性腦卒中相關(guān)的病理生理過程，如動(dòng)脈粥樣硬化、神經(jīng)血管再生、腦水腫、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等，提示miRNA可成為缺血性卒中早期診斷的生物標(biāo)志物和有效的治療靶標(biāo)。研究表明，miR-21在不同類型腦卒中中均可作為生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)[16]。Wang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，miR-3473b通過靶向調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞抑制因子3誘導(dǎo)腦卒中神經(jīng)炎發(fā)生，間接促使腦卒中的發(fā)生。Bukeirat等[18]研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a影響線粒體活性，為靶向miR-34a治療腦卒中、阿爾茨海默病等腦血管病和神經(jīng)退行性疾病提供了新的治療策略。

3 miRNA與腦缺血再灌注損傷

目前針對(duì)缺血性腦卒中患者的治療主要是將血流受阻滯的腦組織及時(shí)再通，迅速恢復(fù)腦組織缺血部分的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)，維持正常代謝[19]。但在血流再灌注治療過程中常會(huì)導(dǎo)致組織進(jìn)一步受損，稱為缺血再灌注損傷。缺血再灌注損傷的病理機(jī)制主要是腦組織中的白細(xì)胞增多堵塞毛細(xì)血管，細(xì)胞產(chǎn)生的各種毒性物質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)的鈣元素超載破壞細(xì)胞內(nèi)線粒體的結(jié)構(gòu)并損害細(xì)胞功能[20]，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生氧自由基導(dǎo)致高能磷酸化合物缺乏從而影響細(xì)胞能量代謝[21]。

miRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的一種非編碼、內(nèi)源性的小RNA分子，廣泛存在于真核生物中，通過抑制翻譯水平來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，是一種重要的基因調(diào)控因子，臨床研究和實(shí)驗(yàn)室研究均證明miRNAs是一種潛在的治療腦缺血的靶分子。Sun等[22]用體外氧葡萄糖剝奪/再灌注和體內(nèi)大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型研究miR-298和核因子κB激活劑1(nuclear factor kappa B activator 1,Act1)在缺血性腦卒中中的作用和機(jī)制，并采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法評(píng)估m(xù)iR-298與Act1的調(diào)節(jié)關(guān)系，檢測(cè)結(jié)果表明miR-298直接結(jié)合到Act1轉(zhuǎn)錄本的3′端非翻譯區(qū)。在體內(nèi)外，miR-298通過轉(zhuǎn)染模擬抑制Act1蛋白過表達(dá)，負(fù)調(diào)控Act1/c-Jun氨基端激酶/核因子κB信號(hào)和下游自噬通路，增強(qiáng)細(xì)胞凋亡和自噬，加重缺血性腦梗死和神經(jīng)功能缺損，說明miR-298通過靶向Act1加重腦缺血再灌注損傷[23]。張軍峰等[24]在體外模擬的腦缺血再灌注損傷的細(xì)胞模型中觀察到氧葡萄糖剝奪/再恢復(fù)后細(xì)胞內(nèi)miR-25表達(dá)下調(diào)，而miR-25過表達(dá)使細(xì)胞活力增強(qiáng)，凋亡減少，可能通過Bax/Bcl-2-caspase-3通路抑制細(xì)胞凋亡，提示腦缺血再灌注損傷治療過程中miR-25可能會(huì)成為治療的潛在靶點(diǎn)。還有研究表明，miR-29b通過靶向髓細(xì)胞白血病1影響腦缺血再灌注損傷期間的神經(jīng)細(xì)胞凋亡[25]。

4 miRNA與動(dòng)脈粥樣硬化

缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制主要與動(dòng)脈粥樣硬化引起的腦組織缺血有關(guān)[26]，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成是動(dòng)脈粥樣硬化的標(biāo)志，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成包括單核巨噬細(xì)胞聚集、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、脂質(zhì)沉著、吞噬以及炎癥反應(yīng)等一系列重要過程[27]。內(nèi)皮細(xì)胞的功能損傷能促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞的聚集和吞噬作用，或者產(chǎn)生慢性炎癥反應(yīng)等，使粥樣性斑塊在血管內(nèi)膜下沉積生成。Gao等[28]納入148例病例(其中大動(dòng)脈粥樣硬化組57例，動(dòng)脈粥樣硬化組41例，健康對(duì)照組50例)，通過受試者工作特征曲線證明了miR-126和miR-143識(shí)別動(dòng)脈粥樣硬化患者和健康對(duì)照者的能力，且具有較高的特異度(分別為73.3%和68.9%)和靈敏度(分別為85.6%和86.7%)，表明miR-126和miR-143可能是潛在的動(dòng)脈粥樣硬化的特異性生物標(biāo)志物。

細(xì)胞凋亡在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展過程中扮演重要角色，作用程度取決于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的階段和凋亡細(xì)胞的類型[29]。Liu等[30]研究發(fā)現(xiàn)，miR-410抑制金屬蛋白酶組織抑制因子2依賴的絲裂原活化的蛋白激酶通路對(duì)小鼠缺血性腦卒中后氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有神經(jīng)保護(hù)作用，提示提高miR-410表達(dá)及降低金屬蛋白酶組織抑制因子2表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞存活并抑制細(xì)胞凋亡，從而減少缺血性腦卒中的腦梗死面積，為缺血性卒中的治療靶點(diǎn)提供新思路。另外，人們普遍認(rèn)為頸動(dòng)脈內(nèi)膜增厚是動(dòng)脈粥樣硬化的癥狀，Huang等[31]用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)血漿miR-29c水平，用頸動(dòng)脈超聲檢測(cè)頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度，發(fā)現(xiàn)頸動(dòng)脈內(nèi)膜增厚的患者miR-29c水平高于頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度正常的患者，表明miR-29c增加與頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度密切相關(guān)，可作為鑒別動(dòng)脈粥樣硬化患者的生物標(biāo)志物。

5 miRNA與血管再生

缺血性腦卒中后的血管再生是一個(gè)極為復(fù)雜的過程，血管再生是使預(yù)先存在的毛細(xì)血管發(fā)展形成新的血管，通過增加腦血流量來治療缺血性腦卒中的方法。已有研究表明，血管再生與神經(jīng)功能恢復(fù)有密切關(guān)系，間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外來體遞送的miRNA可調(diào)節(jié)心臟、傷口和骨修復(fù)的炎癥，而炎癥反應(yīng)和細(xì)胞因子是血管神經(jīng)生成的關(guān)鍵促進(jìn)因素[32]。Qing等[33]發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元和間充質(zhì)干細(xì)胞可通過外泌體介導(dǎo)的神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞間通訊促進(jìn)血管生成，一般以堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子/小凹蛋白-1/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等信號(hào)通路促進(jìn)腦缺血半暗區(qū)神經(jīng)血管新生。He等[34]采用大鼠MCAO模型和氧-葡萄糖剝奪細(xì)胞模型，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和Western印跡分別檢測(cè)miR-150和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)，用雙熒光素酶測(cè)定確認(rèn)miR-150和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子之間的結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)miR-150可以負(fù)調(diào)控血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)， miR-150表達(dá)上調(diào)可降低MCAO后大鼠梗死邊緣區(qū)的血管密度，減少腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的形成、增殖和遷移，表明miR-150可以通過血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子調(diào)控大鼠腦卒中后血管的新生。Ge等[35]采用液壓打擊法建立大鼠顱腦創(chuàng)傷模型，經(jīng)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)損傷后0 h至 14 d 不同時(shí)間點(diǎn)miR-21表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷灶腦皮質(zhì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的miR-21表達(dá)增加，并在損傷后48 h達(dá)到峰值，通過激活與血腦屏障穩(wěn)定相關(guān)的血管生成素1/酪氨酸激酶受體2通路，促進(jìn)腦組織血管生成修復(fù)、減輕血腦屏障滲漏。Ge等[36]通過大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞體外劃痕損傷模型，進(jìn)一步研究miR-21-5p對(duì)細(xì)胞炎癥和凋亡的影響發(fā)現(xiàn)一方面，miR-21-5p通過調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)和核因子κB信號(hào)通路抑制炎癥反應(yīng)；另一方面，miR-21-5p通過調(diào)節(jié)凋亡因子的表達(dá)和蛋白激酶B信號(hào)通路抑制細(xì)胞凋亡，同時(shí)在體外實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)miR-21-5p可以促進(jìn)血管生成素1/酪氨酸激酶受體2通路的激活，提示miR-21-5p通過抑制炎癥和細(xì)胞凋亡，影響核因子κB、蛋白激酶B和血管生成素1/酪氨酸激酶受體2信號(hào)通路的活性，產(chǎn)生促進(jìn)腦組織血管生成修復(fù)、減輕血管屏障滲漏的作用，受損腦組織中的血管生成可促進(jìn)局部脈管系統(tǒng)的恢復(fù)，從而為神經(jīng)重塑提供關(guān)鍵的神經(jīng)血管基質(zhì)，這對(duì)創(chuàng)傷性顱腦損傷后的神經(jīng)元恢復(fù)具有重要意義，因此miR-21-5p也可能是治療腦損傷后血腦屏障的靶點(diǎn)。

6 miRNA的臨床和機(jī)制研究

miRNA作為基因表達(dá)調(diào)控的重要開關(guān)，幾乎參與所有的生物學(xué)和病理過程。越來越多的臨床和機(jī)制研究正趨于使用miRNA作為疾病診斷、治療及預(yù)后的方法。Zou等[37]納入了來自亞洲人群的14項(xiàng)病例對(duì)照進(jìn)行Meta分析，基于6 083例缺血性卒中和7 248例對(duì)照(無任何神經(jīng)系統(tǒng)疾病)，結(jié)果顯示，在亞洲人群中，miR-146a(rs2910164)的GG基因型和miR-149的CC基因型(rs2292832)可能會(huì)增加缺血性腦卒中的易患性，提示這兩個(gè)miRNA的基因型與缺血性腦卒中風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。年齡的增長(zhǎng)與卒中患病率增加有關(guān)，有研究表明女性卒中較男性更嚴(yán)重，Selvamani和Sohrabji[38]使用模擬年齡為成年女性(6～7個(gè)月)和中年女性(10～12個(gè)月)的雌性大鼠，和同等數(shù)量年齡匹配的雄性大鼠進(jìn)行MCAO處理，應(yīng)用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)成年雌性大鼠組miR-363-3p表達(dá)升高，且梗死面積最小，而在成年雄性大鼠組和中年雄性大鼠組中卻無明顯變化，提示miR-363-3p對(duì)女性卒中具有神經(jīng)保護(hù)作用，對(duì)女性卒中早期識(shí)別和治療具有重要價(jià)值[39]。在卒中恢復(fù)期，miRNA也發(fā)揮重要作用。Edwardson等[40]使用上肢功能恢復(fù)作為神經(jīng)修復(fù)的替代指標(biāo)，于腦卒中后19 d，收集27例輕度和中度上肢損害的患者在腦卒中后關(guān)鍵期的血漿，恢復(fù)良好的22例患者中有6種miRNA(miR-371-3p，miR-524，miR-520g，miR-1255A，miR-453和miR-583)表達(dá)顯著增加，3種miRNA(miR-941，miR-449b和miR-581)水平顯著降低，提示表達(dá)上調(diào)的miRNA可能與神經(jīng)修復(fù)機(jī)制有關(guān)，同時(shí)此類上調(diào)的miRNA對(duì)優(yōu)化康復(fù)治療時(shí)機(jī)、減輕卒中殘疾負(fù)擔(dān)具有重要意義。Zhang等[41]收集 251例急性缺血性卒中患者2周后的漢密爾頓抑郁量表，將其分為抑郁組和非抑郁組，找到與腦卒中后抑郁相關(guān)的潛在miRNA，通過對(duì)比抑郁患者與非抑郁患者的miRNA譜，發(fā)現(xiàn)某些差異miRNA，包括hsa-miR-4476、hsa-miR-887、hsa-miR-3615、hsa-miR-3202、hsa-miR-183-3p和hsa-miR-3184-3p等，其中某些miRNA與癌癥相關(guān)，特別是與細(xì)胞凋亡和壞死有關(guān)，因此研究這些miRNA有助于盡早篩查出卒中后抑郁患者，血液miRNA可以作為抑郁診斷的潛在生物標(biāo)志物，研究還發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重神經(jīng)功能缺損和頸動(dòng)脈狹窄的患者更容易出現(xiàn)早發(fā)性抑郁，同時(shí)輕度卒中后抑郁與低密度脂蛋白之間也可能存在聯(lián)系。

7 小 結(jié)

腦卒中是嚴(yán)重威脅我國(guó)居民健康及生命的主要疾病，2016年全球疾病負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，腦卒中是造成我國(guó)致殘致死的第一位病因[42]。卒中的風(fēng)險(xiǎn)隨著年齡的增加而增加，但也可發(fā)生在任何年齡[43]，因此早期監(jiān)測(cè)和治療是改善腦卒中預(yù)后的基本策略。miRNA可調(diào)控100多個(gè)基因靶點(diǎn)，一個(gè)基因也可被多個(gè)miRNA調(diào)控，這些分子可作為腦卒中不同階段的診斷、預(yù)后和治療性生物標(biāo)志物[44]。然而腦卒中是一個(gè)復(fù)雜的病理過程，機(jī)體中的miRNA也存在復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng)[45]，利用miRNAs作為腦卒中的生物標(biāo)志物具有很大潛力，與傳統(tǒng)的疾病生物標(biāo)志物相比，miRNAs能反映特定的細(xì)胞病理生理改變，可能提示出腦卒中的具體病因，并可能進(jìn)行急性腦卒中的早期診斷和識(shí)別[46]。但目前缺血性卒中與miRNA的研究仍較少，且大多數(shù)可用于評(píng)估腦卒中miRNA臨床有效性的研究均在亞洲人群中進(jìn)行，因此這種結(jié)果可能不完全適用于其他種族，無法完全闡明miRNA對(duì)腦卒中患者的影響。另外，大多數(shù)miRNA啟動(dòng)子尚未被鑒定，miRNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有待進(jìn)一步明確[47]。因此，使用miRNA作為生物標(biāo)志物和常規(guī)療法相結(jié)合能否改善卒中患者的預(yù)后仍需更深入的研究。