膿毒癥時血小板的功能改變及抗血小板治療的研究進展

鐘林翠綜述，宋景春審校

0 引 言

膿毒癥是由感染失控引起的宿主反應(yīng)導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙［1］。隨著人口的老齡化、腫瘤發(fā)生率的不斷增加、器官移植不斷增多、免疫抑制劑的廣泛使用等，使得膿毒癥的發(fā)生率不斷上升，全球每年新增數(shù)百萬，其中超過1/4的人死亡［2］。血小板減少在膿毒癥中極為常見，并且是引起膿毒癥患者死亡的重要危險因素［3］。近年來研究顯示，血小板除了在止血和血栓過程中發(fā)揮著重要作用外，在感染?免疫反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展中也起著重要的作用［4］。已有較多臨床試驗表明，長期服用阿司匹林（Acetylsalicylic Acid，ASA）、氯吡格雷等抗血小板藥物的患者發(fā)生膿毒癥時，膿毒癥的嚴重程度比未服用者減輕，且死亡率也有所降低［5］。本文擬對血小板參與膿毒癥中的作用機制和抗血小板藥物在治療膿毒癥的臨床進展作一綜述。

1 血小板與炎癥反應(yīng)

在膿毒癥中，炎癥引起凝血途徑激活，導(dǎo)致凝血酶過度生成。作為強誘導(dǎo)劑，凝血酶可與血小板膜表面蛋白酶活化受體1和4結(jié)合啟動血小板的活化、聚集及釋放反應(yīng)。另外，膿毒癥造成的內(nèi)皮細胞活化、內(nèi)皮下膠原暴露、血管性血友病因子和組織因子顯著表達也是激活血小板的重要因素。

血小板活化后能夠釋放超過300種的細胞因子和趨化因子，在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中起重要作用。例如，血小板活化后可分泌促炎物質(zhì)、趨化因子、血管活性胺、類二十烷酸和蛋白水解級聯(lián)成分，直接或間接地通過激活旁鄰靶細胞引起炎癥反應(yīng)［6］。血小板在膿毒癥和其他急性炎癥反應(yīng)過程中，能夠?qū)Π准毎δ苓M行調(diào)節(jié)，如直接吞噬、外滲或黏附于病變血管壁的內(nèi)皮細胞表面。血小板?白細胞的這種相互作用在炎癥過程中，對白細胞的募集、激活和遷移起著關(guān)鍵作用，也是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵步驟［7］。其中血小板?中性粒細胞或血小板?單核細胞相互作用可發(fā)生于內(nèi)皮細胞表面，促使中性粒細胞?單核細胞遷移到組織損傷部位。此外，血小板還可通過其它多種機制激活中性粒細胞和單核細胞發(fā)揮促炎作用，例如在中性粒細胞上激活髓樣細胞觸發(fā)受體1等。因此，炎癥的放大是血小板與靶細胞相互作用的結(jié)果，而循環(huán)的單核細胞/和中性粒細胞?血小板聚集體可以促進炎癥信號的播散［8］。血小板活化后還可以表達腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）?α、IL?1和IL?6等炎癥因子，其中IL?1β為主要炎癥分子。IL?1β能誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞表達黏附分子，促進單核細胞、中性粒細胞等黏附到內(nèi)皮細胞，并同時促進內(nèi)皮細胞合成和分泌趨化因子，進一步提高血管通透性、白細胞募集和趨化效應(yīng)。

血小板還能通過多種機制對炎癥控制做出貢獻，包括釋放抗炎細胞因子和抗炎癥介質(zhì)等［9］。例如，血小板釋放的轉(zhuǎn)化生長因子?β（transforming growth factor?β，TGF?β）作為一種多肽類生長因子就具有抑制炎性反應(yīng)的作用，而血小板存有的一氧化氮合酶能夠合成一氧化氮也能發(fā)揮抗炎作用等。還有一些血小板介質(zhì)（如多磷酸鹽）同時具有促炎和促凝功能。另外，血小板釋放的促炎細胞因子可以在不同的步驟中激活凝血級聯(lián)反應(yīng)［10］，凝血酶生成又反過來促進血小板活化，加速血小板生成炎癥因子，形成級聯(lián)放大效應(yīng)。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，細胞外DNA（cell?free DNA，cfDNA）和DNA結(jié)合蛋白也是參與炎凝通路的重要因子［11］。正常情況下，DNA存在于細胞核的核小體中。核小體是由有145個堿基對的DNA纏繞在組蛋白八聚體上形成的特殊結(jié)構(gòu)，內(nèi)源性脫氧核糖核酸酶可水解cfDNA成150～300堿基大小的DNA片段并進入血液循環(huán)。健康成人的血漿cfDNA水平約為 1μg/mL，半衰期 10～15min，主要在肝清除［12］。膿毒癥發(fā)生時，由于細胞壞死的增加和清除能力下降，血液中的cfDNA水平顯著升高，并可激活凝血因子Ⅻ和Ⅺ，進而啟動內(nèi)源性凝血途徑［13］。中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs）是cfDNA、組蛋白、細胞質(zhì)蛋白和顆粒共同組成的細胞外網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)［14］。血小板在中性粒細胞表面發(fā)生黏附和聚集是NETs釋放的觸發(fā)階段，NETs釋放后能夠繼續(xù)促進血小板活化和放大炎癥反應(yīng)。

2 血小板與免疫反應(yīng)

血小板在防御感染中的作用日益受到重視，能直接或間接地影響固有免疫與適應(yīng)性免疫應(yīng)答［15?16］。血小板目前被認為是病原體感受器，其與許多細菌、病毒、真菌和原蟲病原體及其產(chǎn)物直接或間接相互作用，從而促使病原體清除。血小板與病原體及其產(chǎn)物的相互作用取決于病原體的性質(zhì)、濃度和相互作用時間，并涉及多種機制。

已知血小板α顆粒含有多種趨化因子，能趨化和活化其他免疫細胞［17］。如血小板第4因子又稱CXCL4、β?血小板球蛋白為CXCL7中間體形式、調(diào)節(jié)正常T細胞表達和分泌的細胞因子又稱CCL5、巨噬細胞炎癥蛋白?1α又稱CCL3。血小板在迅速識別病原體后能分泌多種細胞因子和趨化因子，從而吸引免疫細胞到免疫應(yīng)答局部，參與免疫調(diào)節(jié)。例如，血小板及其產(chǎn)物能夠迅速募集、活化中性粒細胞發(fā)揮固有免疫效應(yīng)。在靜息狀態(tài)下，血小板P?選擇素（P?selectin/CD62P）的表達水平很低。而在膿毒癥中，血小板活化后表面P?選擇素表達上調(diào)并與白細胞上的P?選擇素糖蛋白配體?1結(jié)合，可以介導(dǎo)血小板與白細胞黏附，促進中性粒細胞聚集，而血小板的糖蛋白（glycoprotein，GP）IIb/IIIa與中性粒細胞上的整合素αMβ2（Mac?1）通過纖維蛋白原的橋接作用亦形成血小板?中性粒細胞聚集體［18］。此外，血小板也可以表達toll樣受體（toll?like recep?tors，TLRs），包括識別革蘭陽性菌細胞壁成分肽聚糖的TLR2和革蘭陰性菌細胞壁成分脂多糖的TLR4［18］。TLR4與脂多糖結(jié)合可以促進中性粒細胞活化，誘導(dǎo)NETs的產(chǎn)生［19］。NETs可結(jié)合細菌或真菌并防止其擴散，并保證足夠高的局部中性粒細胞顆粒酶來殺滅微生物。

血小板可以通過對T細胞、B細胞和抗原提呈細胞的相互作用來調(diào)節(jié)機體的免疫應(yīng)答。例如，血小板可以增強抗原提呈作用。樹突細胞（dendritic cell，DC）是體內(nèi)重要的專職抗原提呈細胞。CD40為CD154（CD40L）的受體，主要表達在DC、B細胞和單核/巨噬細胞上?；罨难“灞砻姹磉_CD154，通過CD40?CD154結(jié)合促進DC活化和成熟、單核細胞活化、免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換（IgM轉(zhuǎn)換成IgG）［18］。DC活化增加T細胞、B細胞的抗原提呈從而增強適應(yīng)性免疫應(yīng)答。T細胞識別抗原的能力受到主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）的限制，而MHC1抗原提呈途徑的關(guān)鍵蛋白位于血小板α?顆粒中［20］。其除此之外，血小板可以通過CD154和CCL5促使T細胞向Th1和Th17極化。調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Treg）是一類具有免疫調(diào)節(jié)功能的T細胞亞群［21］，在膿毒癥病理過程及其干預(yù)途徑中具有重要意義。而Treg的分化需要TGF?β的參與，血小板能夠合成和釋放大量的TGF?β。

血小板還可以直接或間接清除病原體。血小板通過分泌多種抗菌肽和蛋白，如β?防御素1和殺血栓素、血小板殺微生物蛋白?1等直接殺菌［22］?；罨“遽尫诺腃XCL4，CXCL7和CCL5也具有殺菌作用。血小板還通過自身表達Fcγ受體與免疫復(fù)合物結(jié)合進行免疫殺傷。

3 抗血小板藥物與膿毒癥治療

膿毒癥時大量細菌成分及炎性介質(zhì)導(dǎo)致血小板異常活化，膿毒癥休克時可出現(xiàn)血小板減少，并伴有血小板聚集和活化功能抑制?？寡“逯委熆梢詼p少血小板活化，抑制炎性細胞周圍的白細胞和血小板聚集，進而減輕炎癥和免疫調(diào)節(jié)介質(zhì)的釋放，減輕膿毒癥中的炎癥反應(yīng)［23］。

3.1 環(huán)氧化酶抑制劑ASA為環(huán)氧化酶抑制劑的代表藥物，通過抑制環(huán)氧化酶?1和血栓素A2產(chǎn)物來抑制血小板的活化而實現(xiàn)抗炎作用。因為活化的血小板能夠釋放CD40L，其與CD40結(jié)合可增加核轉(zhuǎn)錄因子?kB及炎性因子表達。此外，ASA還可以觸發(fā)15?脂氧素A4的合成，并通過內(nèi)皮細胞和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶來增加一氧化氮合成以發(fā)揮抗炎作用。一氧化氮還能夠抑制白細胞和內(nèi)皮細胞之間的相互作用，以減少多形核中性粒細胞的募集［24］。

已有動物實驗發(fā)現(xiàn)，ASA對膿毒癥模型具有保護作用。例如，1981年Halushka等［25］研究發(fā)現(xiàn)，在注射內(nèi)毒素（20mg/kg）30 min前分別給予3.75 、15、30 mg/kg的ASA預(yù)處理，結(jié)果膿毒癥休克大鼠24h存活率分別為11%、60%、70%。2011年，Erlich等［26］研究發(fā)現(xiàn)，入重癥監(jiān)護病房前就接受了抗血小板治療（95%為ASA）的患者較未接受抗血小板治療患者，其急性肺損傷發(fā)生率明顯降低（12.7%vs28.0%）。2012年，Eisen等［27］對一家三級醫(yī)院重癥醫(yī)學科近9年收治的7945例全身炎癥反應(yīng)綜合征患者進行回顧性隊列研究，所有患者被分為使用ASA與未使用ASA兩組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)24h內(nèi)接受了ASA較未接受ASA治療的患者死亡率明顯降低（10.9%vs17.2%），其進展為膿毒癥的發(fā)生率也顯著降低（6.1%vs19.4%）。2015年Falcone等［28］報道，應(yīng)用ASA治療的肺炎患者較未使用ASA相比，進展為膿毒癥和膿毒癥性休克的發(fā)生率均更低（4.6%vs11.5%）。另外，還有兩項研究ASA治療膿毒癥的隨機對照臨床試驗正在進行。一項是“ASA治療膿毒癥”（NCT01784159），該試驗將評估連續(xù)7d給予ASA治療對嚴重膿毒癥患者器官功能障礙和通氣時間的影響。另一項是在澳大利亞開展的ANTI?SEPSIS 研 究 （Aspirin to InhibitSepsis，AC?TRN12613000349741），將評估長期（5～7年）應(yīng)用ASA 100 mg/d，能否預(yù)防患者住院或入住ICU，能否緩解膿毒癥嚴重程度、降低患者死亡率。

3.2 P2Y12受體抑制劑P2Y12受體是二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）誘導(dǎo)血小板聚集反應(yīng)的主要受體。ADP與P2Y12受體結(jié)合促進致密顆粒進一步釋放ADP，從而增強血小板聚集，形成血栓，進一步加重微循環(huán)障礙［29］。噻吩并吡啶類藥物通過阻斷血小板P2Y12受體與ADP的結(jié)合，阻斷后續(xù)ADP介導(dǎo)的糖蛋白IIb/IIIa和GPIa/IIa的活化，從而抑制誘導(dǎo)的血小板活化和聚集。氯吡格雷是目前臨床使用最廣泛的噻吩并吡啶類藥物，不可逆性抑制P2Y12受體。

已有動物實驗證實，氯吡格雷預(yù)處理可以減輕脂多糖誘導(dǎo)的膿毒癥大鼠的血小板下降，減輕肺組織內(nèi)的纖維蛋白沉積，減少炎癥介質(zhì)的分泌，從而提高膿毒癥大鼠生存率［30?31］。氯吡格雷的預(yù)治療還可以減低脂多糖誘導(dǎo)膿毒癥大鼠的促炎物質(zhì)水平（IL?6和TNF?α），并使產(chǎn)生活性氧的中性粒細胞減少［32］。但 Gross等［33］對 2001?2005 年肯塔基州接受醫(yī)療補助的患者進行回顧性隊列研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氯吡格雷能夠增加社區(qū)獲得性肺炎的發(fā)病率，但不會

增加住院患者病情的嚴重程度。替格瑞洛為第一代環(huán)戊基三唑嘧啶類抗血小板藥物，同樣作用于血小板表面的P2Y12受體，是首個可逆地結(jié)合型P2Y12受體拮抗劑。Thomas等［34］將30名健康志愿者隨機分為替格瑞洛治療組（n=10）、氯吡格雷治療組（n=10）和不使用抗血小板藥物的對照組（n=10），結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種P2Y12抑制劑均可顯著降低血小板?單核細胞聚集體的形成，下調(diào)促炎性細胞因子（包括TNFα，IL?6和CC趨化因子配體2）的水平和抑制了D?二聚體的產(chǎn)生。與氯吡格雷相比，替格瑞洛不僅顯著降低IL?8和集落刺激因子的峰值水平，還能提高了抗炎細胞因子IL?10的峰值水平。

3.3 GPIIb/IIIa受體拮抗劑血小板GPIIb/IIIa（α 1b/β3）受體為血小板聚集的關(guān)鍵介質(zhì)。GPIIb/IIIa拮抗劑可阻斷纖維蛋白原與活化的血小板GPIIb/IIIa受體結(jié)合，并通過抑制血小板聚集的最后共同通路發(fā)揮強大的抗血小板作用［35］。GPIIb/IIIa拮抗劑主要包括單克隆抗體、肽類抑制劑和非肽類抑制劑3類。AZ?1是一種新型抗GPIIb/IIIa受體的小鼠單克隆抗體，在兔膿毒癥休克模型中，使用AZ?1可減少單核細胞組織因子表達，改善凝血功能，恢復(fù)內(nèi)皮依賴性血管舒張功能和減輕內(nèi)皮細胞損傷，最終降低死亡率［36］。同樣在膿毒癥兔模型中，已有研究發(fā)現(xiàn)阿昔單抗可以保護血管內(nèi)皮功能［37］。依替巴肽也可以通過阻斷GPIIb/IIIa來抑制血小板聚集，減弱血小板顆粒酶B介導(dǎo)的細胞凋亡，從而改善膿毒癥小鼠的生存預(yù)后［38］。

4 結(jié)語與展望

綜上所述，膿毒癥是目前危重癥患者主要的死亡原因之一，其主要表現(xiàn)為過度炎癥反應(yīng)、免疫功能失調(diào)和凝血功能紊亂。其中血小板在膿毒癥的炎癥和免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要作用，血小板被活化后通過釋放細胞因子調(diào)節(jié)炎癥、免疫功能以及凝血功能進而導(dǎo)致膿毒癥的病情加重。目前臨床上常用的抗血小板藥物（如ASA）不僅能夠有效抑制血小板聚集，還能夠通過調(diào)節(jié)與血小板活化相關(guān)的物質(zhì)水平進而發(fā)揮抗炎與免疫調(diào)節(jié)作用。但是，目前國內(nèi)外關(guān)于抗血小板藥物治療膿毒癥的循證依據(jù)尚未完全明確，并且膿毒癥的抗血小板治療時機、劑量和療程尚不明確，需要進一步開展臨床多中心、大規(guī)模的前瞻性研究。