金屬β內(nèi)酰胺酶及其抑制劑的研究進(jìn)展

鞠林成，史亞興，苗東旭，殷 波,宋永勝

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院泌尿外科，沈陽 110004)

細(xì)菌感染是臨床中十分常見的感染性疾病?；颊咭坏┌l(fā)生細(xì)菌感染，往往使其住院時間延長、醫(yī)療支出增加，尤其是醫(yī)院獲得性感染可以增加患者病死率[1]。臨床中針對細(xì)菌感染最重要的策略是給予患者抗生素治療，青霉素(一種β內(nèi)酰胺類抗生素)是最早在臨床中大規(guī)模使用的抗菌藥物，目前臨床中的β內(nèi)酰胺類包括青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類和單環(huán)β內(nèi)酰胺類。隨著制藥工業(yè)的不斷改進(jìn)，β內(nèi)酰胺類具有血藥濃度高、抗菌譜廣和毒性低的抗菌特點，是目前全球范圍內(nèi)應(yīng)用最廣、使用率最高的一類抗生素[2]。文獻(xiàn)報道，在所有種類的抗菌藥物中，β內(nèi)酰胺類在美國的使用率已經(jīng)超過65%[3]。β內(nèi)酰胺類可以靶向作用于一種位于細(xì)菌細(xì)胞壁上的關(guān)鍵酶——轉(zhuǎn)肽酶，并通過共價結(jié)合的形式與轉(zhuǎn)肽酶的活性位點結(jié)合，降低細(xì)菌細(xì)胞壁的機械強度，限制細(xì)菌細(xì)胞壁合成[4]，而且該類抗生素還可以通過共價修飾的方式抑制細(xì)菌細(xì)胞壁聚肽糖層合成的關(guān)鍵酶——青霉素結(jié)合蛋白，使得細(xì)菌細(xì)胞壁完整性缺失，最終導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞溶解[5]。但與臨床中應(yīng)用的其他種類抗菌藥物所面臨的情況相同，隨著β內(nèi)酰胺類的過度使用，臨床中的主要致病菌(如革蘭陰性菌中的肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌，以及革蘭陽性菌中的肺炎鏈球菌和金黃色葡萄球菌)不斷出現(xiàn)耐藥菌株并在全球范圍內(nèi)迅速播散，使β內(nèi)酰胺類這一有效的抗菌武器正在失去效力，細(xì)菌耐藥已成為臨床中不容忽視的嚴(yán)重問題。細(xì)菌對β內(nèi)酰胺類的耐藥機制可以分為4種：細(xì)菌以主動泵出的形式將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥物泵出細(xì)胞外；降低外膜滲透性減少抗生素進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；細(xì)菌通過自身突變或產(chǎn)生某種酶修飾抗生素的作用靶點導(dǎo)致靶點的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化進(jìn)而使藥物作用降低或無法發(fā)揮作用；表達(dá)β內(nèi)酰胺酶使抗生素失去活性[6]。而且細(xì)菌還會同時具有一種以上的耐藥機制，且彼此之間產(chǎn)生協(xié)同作用，最終也可導(dǎo)致對抗生素的耐藥[7]。臨床中主要致病菌最重要的耐藥機制是表達(dá)β內(nèi)酰胺酶。β內(nèi)酰胺酶是一種水解酶，可以催化水解β內(nèi)酰胺類抗生素的特征性四元環(huán)，進(jìn)而使β內(nèi)酰胺類結(jié)構(gòu)發(fā)生改變產(chǎn)生無效產(chǎn)物，最終導(dǎo)致該類抗生素失去抗菌活性?，F(xiàn)就金屬β內(nèi)酰胺酶(metallo-β-lactamases，MBLs)及其抑制劑的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 β內(nèi)酰胺酶的分類

目前文獻(xiàn)報道的β內(nèi)酰胺酶有2 000多種[8]，依據(jù)氨基酸序列的不同可將β內(nèi)酰胺酶分為A、B、C和D四類[9]。其中A、C和D類依靠酶活性位點的絲氨酸表達(dá)催化活性，因此被稱為絲氨酸β內(nèi)酰胺酶(serine-β-lactamases，SBLs)。1940年，Abraham和Chain報道了第1例SBLs[10]，至今SBLs的數(shù)量已經(jīng)超過了1 000種。在臨床上，克拉維酸、舒巴坦、他唑巴坦、阿維巴坦這4類抑制劑可以抑制SBLs的催化活性，恢復(fù)β內(nèi)酰胺類抗生素對細(xì)菌的抗菌活性[11]。因此,這些抑制劑與β內(nèi)酰胺類抗生素構(gòu)成的復(fù)合物可用來治療表達(dá)SBLs細(xì)菌引起的感染性疾病。與A、C和D三類β內(nèi)酰胺酶不同，B類β內(nèi)酰胺酶依靠活性位點的1～2個Zn2+表達(dá)催化活性，因此被稱為MBLs[9]。

2 MBLs的結(jié)構(gòu)

MBLs之間的氨基酸序列同源性低，文獻(xiàn)報道小于25%[12]。所有的MBLs都含有αβ/βα的特征性結(jié)構(gòu)，即β折疊在內(nèi)側(cè)，α螺旋位于外側(cè)。兩個α螺旋與β折疊構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域之間是酶的活性位點，活性位點有Zn2+結(jié)合。根據(jù)活性位點金屬離子的個數(shù)以及活性位點金屬離子結(jié)合氨基酸的不同，MBLs又可分為3個亞群：B1、B2和B3亞群[13]。B1和B3亞群MBLs活性位點有2個Zn2+，可以水解青霉素類、頭孢菌素類及碳青霉烯類抗生素。B2亞群MBLs活性位點有1個Zn2+，專一水解碳青霉烯類抗生素。B1亞群MBLs的第1個Zn2+結(jié)合3個組氨酸并通過1個氫氧化物與第2個Zn2+連接，形成四面體配位結(jié)構(gòu)；第2個Zn2+結(jié)合1個組氨酸、1個半胱氨酸、1個天冬氨酸和1個水分子，并由1個氫氧化物與第1個Zn2+連接，形成三角雙錐體配位結(jié)構(gòu)；B2亞群MBLs活性位點的Zn2+結(jié)合1個組氨酸、1個半胱氨酸和1個天冬氨酸；B3亞群與B1亞群結(jié)構(gòu)類似，不同之處在于第2個Zn2+結(jié)合2個組氨酸和1個天冬氨酸。

3 MBLs與臨床感染的相關(guān)性

B1亞群MBLs數(shù)量最多且大部分與臨床有相關(guān)性，如在多種革蘭陰性致病菌中發(fā)現(xiàn)的亞胺培南酶(imipenemases，IMPs)、維羅那亞胺培南酶(Verona imipenemases，VIMs)和新德里金屬β內(nèi)酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamases，NDMs)，以及在銅綠假單胞菌中發(fā)現(xiàn)的巴圣保羅金屬β內(nèi)酰胺酶1(S?o Paulo metallo-β-lactamases 1,SPM-1)、蠟樣芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)的β內(nèi)酰胺酶Ⅱ、脆弱擬桿菌中發(fā)現(xiàn)的耐碳青霉烯和頭孢菌素酶以及腦膜炎膿毒菌中發(fā)現(xiàn)的β內(nèi)酰胺酶B。B2亞群MBLs數(shù)量最少，包括嗜水氣單胞菌中發(fā)現(xiàn)可以水解碳青霉烯類的MBLs、維氏氣單胞菌中發(fā)現(xiàn)的亞胺培南酶和居泉沙雷菌中發(fā)現(xiàn)對碳青霉烯類耐藥的MBLs。B3亞群MBLs多存在于機會致病菌中，主要包括嗜麥芽窄食單胞菌中發(fā)現(xiàn)的L1型MBLs和戈爾曼軍團(tuán)菌中發(fā)現(xiàn)的MBLs[12,14]。

1966年(大約在SBLs發(fā)現(xiàn)的25年后)，Sabath和Abraham[15]首次在一種名為蠟樣芽孢桿菌的非致病菌中發(fā)現(xiàn)了一種含有金屬鋅并且可以被乙二胺四乙酸(一種金屬離子的螯合劑)抑制的β內(nèi)酰胺酶。在此之后的20年中，由于發(fā)現(xiàn)的MBLs主要存在于非致病菌中，沒有造成嚴(yán)重的臨床問題，因此MBLs并沒有引起足夠的關(guān)注。隨著時間的推移，研究發(fā)現(xiàn)MBLs可以由染色體編碼在多種細(xì)菌中傳播，如脆弱擬桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、產(chǎn)氣單胞菌以及金黃桿菌屬，而且在腸桿菌屬、銅綠假單胞菌、黏質(zhì)沙雷菌及不動桿菌屬致病菌中還發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒介導(dǎo)的MBLs耐藥基因[14]。重要的是，除單環(huán)β內(nèi)酰胺類抗生素外，MBLs可以水解包括碳青霉烯類在內(nèi)的其他所有的β內(nèi)酰胺類抗生素[16]。與SBLs不同，目前臨床上還沒有任何一種針對MBLs的抑制劑可以抑制MBLs的活性。MBLs耐藥基因在細(xì)菌中傳播使其成為“超級細(xì)菌”，導(dǎo)致臨床上的抗生素失去效力，使越來越多的細(xì)菌感染性疾病無藥可用。其中播散程度最為廣泛、與臨床關(guān)系最為密切的是IMPs、VIMs和NDMs[12]。

1991年，日本學(xué)者在銅綠假單胞菌中發(fā)現(xiàn)了一種可以水解亞胺培南的β內(nèi)酰胺酶，即IMP-1[17]。目前美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)有73個IMPs的變異型，IMPs主要在日本流行。VIM-1是在意大利維羅那發(fā)現(xiàn)并于1999年被報道的[18]，NCBI可查到56個VIMs的變異型，VIMs主要在歐洲流行。

NDM-1最早報道于2009年，1例由印度新德里返回瑞典的患者患有泌尿系感染，其尿液中發(fā)現(xiàn)了耐碳青霉烯的肺炎克雷伯菌菌株，該菌株攜帶NDM-1基因[19]，目前NCBI上報道了21個NDMs變異型。雖然NDM-1比IMP-1和VIM-1出現(xiàn)的較晚，但是其播散呈全球趨勢且不受地域限制，而且在假單胞菌屬、腸桿菌屬和不動桿菌屬等多種革蘭陰性菌中均發(fā)現(xiàn)了NDM-1[20]。新近研究顯示，NDM的臨床變異型在Zn2+濃度較低的情況下仍然具有生物活性[21-22]。

4 MBLs抑制劑

美國疾病控制與預(yù)防中心于2017年1月報道了1例感染了耐碳青霉烯腸桿菌的患者，該患者感染了產(chǎn)NDM-1的肺炎克雷伯菌。藥敏試驗顯示該細(xì)菌對26抗生素耐藥，包括氨基糖苷類抗生素及多黏菌素，而且對替加環(huán)素亦不敏感，最終該患者死于細(xì)菌感染[23]。

在所有引起院內(nèi)感染的致病菌中，對人類健康威脅最大的是被稱為ESKAPE的這一類病原體，即E(Enterococcusfaecium，屎腸球菌)、S(Staphylococcusaureus，金黃色葡萄球菌)、K(Klebsiellapneumoniae，肺炎克雷伯菌)、A(Acinetobacterbaumanii，鮑曼不動桿菌)、P(Pseudomonasaeruginosa，銅綠假單胞菌)及E(Enterobacter，腸桿菌)[24]。表達(dá)NDM-1的ESKAPE病原體可以抵抗具有“終極手段”之稱的碳青霉烯類藥物，消除此類素抗生素的抗菌活性[25]。表達(dá)MBLs的細(xì)菌感染已成為臨床中越來越突出的問題[26]，而且針對SBLs的抑制劑對MBLs無效[27]，目前臨床上沒有藥物可以治療表達(dá)MBLs的細(xì)菌引起的感染性疾病。因此，臨床上急需有效的抑制劑來解決MBLs介導(dǎo)的細(xì)菌耐藥問題。目前抑制劑研究的普遍策略是通過與MBLs活性位點的Zn2+發(fā)生作用，從而抑制MBLs的催化活性，進(jìn)而恢復(fù)β內(nèi)酰胺類抗生素的抗菌活性。鑒于B1亞群與臨床關(guān)系最為密切且尤以其中的IMPs、VIMs與NDMs突出，在此列舉一些與該類MBLs相關(guān)的抑制劑。

4.1金屬螯合劑 移除MBLs中的Zn2+可以抑制MBLs活性。乙二胺四乙酸及吡啶二羧酸即屬于該類抑制劑[16]。King等[28]報道了一種名為曲霉明A(aspergillomarasmine A，AMA)的抑制劑，該抑制劑來源于真菌的天然產(chǎn)物。體外實驗中，AMA可以有效抑制NDM-1及VIM-2的活性，與美羅培南聯(lián)合可以起到協(xié)同作用，提高美羅培南抗腸桿菌屬、假單胞菌屬和不動桿菌屬的抗菌活性。在產(chǎn)NDM-1的肺炎克雷伯菌感染的小鼠動物模型中，AMA也可以提高美羅培南的抗菌活性。后續(xù)的研究也證實了AMA通過移除NDM-1及VIM-2活性位點的金屬離子對其產(chǎn)生抑制作用[29]。由于人體內(nèi)有多種蛋白質(zhì)需要相應(yīng)的金屬離子來維持生物活性，應(yīng)用該類抑制劑的同時會不可避免地影響這些含有金屬離子的蛋白質(zhì)活性，進(jìn)而對人體造成損害，限制該類抑制劑的使用。

4.2含巰基抑制劑 在所有報道的MBLs抑制劑中，含有巰基的化合物數(shù)量最多，其中L-或D-卡托普利是最經(jīng)典的含巰基抑制劑。臨床中L-卡托普利是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的抑制劑，其通過結(jié)合血管緊張素轉(zhuǎn)換酶中的Zn2+起到緩解高血壓的作用[30]。Brem等[31]報道了卡托普利在體外實驗中可以抑制B1亞群的多種MBLs的活性。其中D-卡托普利對IMP-1、VIM-2、SPM-1及NDM-1的半數(shù)抑制濃度(inhibitory concentration at half-maximum，IC50)分別為7.2、0.072、261.8及20.1 μmol/L，D-卡托普利還可增強美羅培南對產(chǎn)VIM-2、VIM-4、IMP-4及NDM-1的細(xì)菌的抗菌活性。三維結(jié)構(gòu)展示L-卡托普利的巰基取代了NDM-1兩個Zn2+中間的氫氧化物，抑制了NDM-1活性。

Klingler等[32]報道了一系列巰基化合物，其中塞奧芬、二巰基丙醇、巰基丙酰甘氨酸可抑制NDM-1、VIM-1及IMP-7的活性(均IC50<100 μmol/L)。并且這些化合物與亞胺培南聯(lián)合應(yīng)用可提高后者對產(chǎn)NDM-1、VIM-2、IMP-7的大腸埃希菌實驗分離株及肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌病原分離株的抗菌活性。

Hinchliffe等[33]報道了一系列含羥基的雙環(huán)噻唑烷化合物，該類化合物是青霉素的類似物并且含有巰基。研究以亞胺培南作為底物。其中名為L-CS319化合物對NDM-1表現(xiàn)為強競爭性抑制作用，抑制常數(shù)(Ki)為7 μmol/L、IC50為23 mmol/L。體外實驗中，L-CS319可以恢復(fù)亞胺培南對產(chǎn)NDM-1的肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌及雷氏普羅威登斯菌的抗菌活性。

4.3羅丹寧衍生物 羅丹寧是一類對青霉素結(jié)合蛋白、SBLs和MBLs均有抑制效果的抑制劑。Brem等[34]報道了羅丹寧與VIM-2形成的三維結(jié)構(gòu)，并發(fā)現(xiàn)羅丹寧的一種派生物可以連接VIM-2活性位點的兩個Zn2+。除SPM-1外，該派生物對于一系列B1亞群MBLs具有比羅丹寧更強的抑制能力。其對NDM-1、VIM-2及IMP-1的IC50分別為1.05、0.3和0.002 88 μmol/L。

與美羅培南聯(lián)合進(jìn)行的最小抑菌濃度研究顯示，對于表達(dá)IMP-1、IMP-4、VIM-4或NDM-1的肺炎克雷伯菌及大腸埃希菌臨床分離株，羅丹寧表現(xiàn)的抗菌活性更強。這一結(jié)果可能是不同細(xì)胞對兩種抑制劑的利用不同產(chǎn)生的結(jié)果。

4.4二羥酸衍生物 鄰苯二甲酸及順丁烯二酸的衍生物是常見的二羥酸類MBLs抑制劑。Hiraiwa等[35]報道的一系列鄰苯二甲酸衍生物，其中對IMP抑制效果最強的一種抑制劑的IC50為0.27 μmol/L。該種鄰苯二甲酸衍生物抑制劑可提高比阿培南對產(chǎn)IMP銅綠假單胞菌的抗菌活性。

Ishii等[36]報道的一種名為ME1071的順丁烯二酸衍生物可以抑制IMP-1及VIM-2的活性，其Ki值分別為0.4和120 μmol/L。該研究同時報道了ME1071可增強頭孢他啶及碳青霉烯類抗生素對產(chǎn)MBL的銅綠假單胞菌的抗菌活性。在小鼠肺炎模型中，Yamada等[37]發(fā)現(xiàn)ME1071可增強比阿培南治療產(chǎn)IMP銅綠假單胞菌的感染。

4.5硼酸鹽類 硼酸化物常作為SBLs的過渡態(tài)抑制劑，其通過與SBLs中的絲氨酸發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生仿四面體抑制SBLs活性。Brem等[38]報道的一系列環(huán)狀硼酸鹽不僅可以通過上述機制抑制SBLs的活性，還可以通過類似的機制抑制青霉素結(jié)合蛋白5及多數(shù)B1亞群MBLs的活性。其中一種硼酸鹽類抑制劑對IMP-1、VIM-2及NDM-1的IC50分別為1.44、0.003及0.029 μmol/L。體外實驗中該種抑制劑可提高美羅培南對產(chǎn)NDM-1肺炎克雷伯菌的抗菌活性。

該類抑制劑雖然可以抑制SBLs與B1亞群MBLs的活性，但其對B2亞群MBLs的抑制效果很差。

4.6其他 除上文提到的抑制劑外，MBLs的抑制劑還有聯(lián)苯氮雜類[39]、吡咯類衍生物[40]、磺酰類化合物[41]、磺胺衍生物[42]、異羥肟酸衍生物[43]及自然產(chǎn)物[44]等。在體外實驗中，這些有機分子均可以抑制一種或幾種MBLs，而且也可以提高β內(nèi)酰胺類對產(chǎn)MBLs致病菌的抗菌活性。另外，還有一些MBLs抑制劑通過其他作用機制對MBLs產(chǎn)生抑制作用，如包含精氨酸多肽的大分子抑制劑通過改變蛋白質(zhì)構(gòu)象達(dá)到對MBLs的抑制作用[45]，以及甲酰色酮通過共價結(jié)合方式對MBLs產(chǎn)生抑制作用[46]等。

5 展 望

表達(dá)MBL的致病菌引起的感染性疾病不斷增多，是亟待解決的臨床問題。從細(xì)菌耐藥的歷史來看，其總是伴隨著基因之間的水平傳遞以及地域性傳播。NDM-1的全球播散也印證了這一特點。這也是抗生素應(yīng)用所帶來的重大挑戰(zhàn)。在過去20多年中，有許多關(guān)于MBLs抑制劑的報道。一些研究報道了抑制劑的IC50和(或)Ki值，一些研究報道了三維結(jié)構(gòu)和(或)毒理研究，一些研究還涉及了動物實驗，但是目前的研究還停留在實驗室階段。MBLs種類眾多，而且大多數(shù)抑制劑并不能抑制所有的MBLs，MBLs介導(dǎo)的細(xì)菌耐藥使β內(nèi)酰胺類抗生素這一在臨床中應(yīng)用最為廣泛的藥物失去抗菌活性。研發(fā)可逆的、靶向選擇的、具有構(gòu)效關(guān)系的MBLs抑制劑，使其既可以抑制MBLs又能恢復(fù)β內(nèi)酰胺類抗生素活性，是解決這一挑戰(zhàn)的關(guān)鍵。