延胡索炮制前后多組分質(zhì)量控制方法的研究

宋洪偉，毛 睿，李麗紅，王 飄，竇志英，馬 琳

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

延胡索為罌粟科植物延胡索（Corydalis yanhusuoW.T.Wang）的干燥塊莖，是常用理氣止痛藥[1]。臨床常使用炮制品，用于治療胸肋脘腹疼痛、胸痹心痛。從延胡索中分離得到的生物堿類成分約有30種[2]。單一延胡索乙素很難全面控制藥材內(nèi)部質(zhì)量，相關(guān)的研究中僅對少數(shù)幾種成分利用HPLC法檢測[3-4]，其中，羅琛艷[5]用UPLC法對延胡索藥材中2種成分進(jìn)行檢測。HPLC多組分成分分析多有報道[6-10]。但該方法耗時長、效率低。因此，基于超高效液相色譜（UPLC）具有快速、分離度高的優(yōu)點[11-14]。實驗從多組分同時把控的角度，建立一種UPLC法同時測定延胡索藥材炮制前后8種生物堿含量的方法，該方法操作簡便快速，分離度好，為今后延胡索成分含量測定及質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的提升提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UPLC超高效液相色譜儀（安捷倫1290），超聲波清洗器KQ-250E（昆山市超聲洗器有限公司），數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市科析儀器有限公司），F(xiàn)A2004電子分析天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；FW100高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；離心機（北京時代北利離心機有限公司）。

1.2 試藥 四氫非洲防己堿（批號：W12N7Z24780），四氫黃連堿（批號：R18A6F2），非洲防己堿（批號：W30M7Z15501），鹽酸小檗堿（批號：Y21A7S13543）均購自上海源葉生物科技有限供公司，鹽酸巴馬汀（批號：110732-201611）購自中國食品藥品檢定研究院，延胡索乙素（批號：W05-5-8）、去氫紫堇堿（批號：W14-2-4）、原阿片堿（批號：W14-2-6）均購自Zhongxin Innova Laboratories，醋（天津市天立獨流老醋股份有限公司），乙腈（默克股份兩合公司），甲酸（Anaqua chemicals supply），甲醇（分析純/天津市化學(xué)試劑供銷公司），氨水（分析純/天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司），蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司），延胡索購于浙江省臺州市仙居縣朱溪鎮(zhèn)，經(jīng)本校中藥鑒定教研室馬琳教授鑒定為罌粟科植物延胡索（Corydalis yanhusuoW.T.Wang）的干燥塊莖。

2 實驗方法

2.1 延胡索樣品的制備 生品延胡索：按照2015版《中華人民共和國藥典》制備。醋煮延胡索：按照2015版《中華人民共和國藥典》制備。

2.2 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），乙腈（B）-0.2%甲酸水（A）溶液，流速：0.3mL/min，柱溫55℃，檢測波長280nm，進(jìn)樣量 1 μL；梯度洗脫 0～10 min，12%～14%B；10～14 min，14%～25%B；14～17 min，25%～40%B；17～20 min，40%～45%B；20～21 min，45%～12%B。見圖1。

圖1 對照品溶液及延胡索樣品UPLC色譜圖

2.3 對照品溶液的制備 精密稱定四氫非洲防己堿、原阿片堿、四氫黃連堿、非洲防己堿、延胡索乙素、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、去氫紫堇堿分別置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，得到濃度分別為 988、1002、990、988、1004、990、996、1 000 μg/mL的對照品溶液。

量取上述四氫非洲防己堿對照品溶液0.5 mL，原阿片堿對照品溶液0.2 mL，四氫黃連堿對照品溶液1.5 mL，非洲防己堿對照品溶液0.1 mL，延胡索乙素對照品溶液0.5 mL，鹽酸小檗堿對照品溶液0.1 mL，鹽酸巴馬汀對照品溶液0.2 mL，去氫紫堇堿對照品溶液0.5 mL，加甲醇定容至10 mL容量瓶中，配成濃度分別為 49.4、20.0、148.5、9.9L、50.2、9.9、19.9、50.0 μg/mL 的混合對照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備 精密稱取延胡索樣品粉末約0.500 g，置平底燒瓶中，精密加入濃氨試液-甲醇（1∶20）混合溶液 50mL，稱定質(zhì)量，冷浸 1 h 后加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用濃氨試液-甲醇（1∶20）混合溶液補足失重，搖勻，4 000 r/min 離心15 min，精密量取上清液25 mL，蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 分別精密移取四氫非洲防己堿、原阿片堿、四氫黃連堿、非洲防己堿、延胡索乙素、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、去氫紫堇堿儲備液適量，用甲醇稀釋一系列濃度的對照品溶液，四氫非洲防己堿的濃度分別為 98.8、49.4、19.8、9.9、4.0、2.0、0.8、0.4 μg/mL，原阿片堿的濃度分別為 100.2、50.1、20.0、10.0、4.0、2.0、0.8、0.4 μg/mL，四氫黃連堿的濃度分別為 247.5、123.8、49.5、24.8、9.9、5.0、2.0、1.0 μg/mL，非洲防己堿濃度為 49.4、24.7、9.9、4.9、2.0、1.0、0.4、0.2 μg/mL，延胡索乙素濃度為 251.0、125.5、50.2、25.1、10.0、5.0、2.0、1.0 μg/mL，鹽酸小檗堿濃度為 49.5、24.8、9.9、5.0、2.0、1.0、0.4、0.2 μg/mL，鹽酸巴馬汀濃度分別為 99.6、49.8、19.9、10、4.0、2.0、0.8、0.4 μg/mL，去氫紫堇堿濃度分別為 250.0、125.0、50.0、25.0、10.0、5.0、2.0、1.0 μg/mL，進(jìn)樣量 1 μL，測定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程見表1。

表1 生物堿的線性關(guān)系考察結(jié)果

2.5.2 精密度實驗 取“2.3”項下混標(biāo)溶液，在色譜條件“2.2”下，連續(xù)進(jìn)樣6針，測定8個生物堿的峰面積并計算RSD。結(jié)果顯示四氫非洲防己堿、原阿片堿、四氫黃連堿、非洲防己堿、延胡索乙素、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、去氫紫堇堿8種生物堿RSD分別為1.00%、1.92%、0.73%、1.66%、0.95%、1.75%、1.05%、0.80%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性實驗 取同一供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件在 0、2、4、8、12、24 h 分別進(jìn)樣，記錄峰面積并計算RSD。結(jié)果顯示四氫非洲防己堿、原阿片堿、四氫黃連堿、非洲防己堿、延胡索乙素、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、去氫紫堇堿8種生物堿RSD分別為1.85%、1.83%、1.86%、1.49%、1.60%、1.28%、1.38%、0.29%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 重復(fù)性實驗 精密稱取同一個樣品6份，按“2.4”提取處理方法制備供試品溶液，在“2.2”項下色譜條件進(jìn)行分析，測定峰面積，計算各對照品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果顯示四氫非洲防己堿、原阿片堿、四氫黃連堿、非洲防己堿、延胡索乙素、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、去氫紫堇堿8種生物堿RSD分別為1.52%、1.64%、1.05%、0.81%、1.66%、1.79%、1.94%、1.42%，表明重復(fù)性良好。

2.5.5 加樣回收實驗 精密稱取6份已測知含量的供試品各約0.25 g，如下表加入四氫非洲防己堿、原阿片堿、四氫黃連堿、非洲防己堿、延胡索乙素、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、去氫紫堇堿，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，按2.2項下色譜條件下分析。結(jié)果見表2。

2.6 統(tǒng)計方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和方差分析。

表2 加樣回收率實驗結(jié)果

3 樣品含量測定

精密稱取延胡索生品及其炮制品0.500 g，按“2.4”項下方法制備樣品，按“2.2”項下色譜條件進(jìn)行含量測定，計算各成分含量。結(jié)果見表3。

4 討論

近年來，隨著毛細(xì)管電泳技術(shù)[15]、LC-MS質(zhì)譜聯(lián)用[16]等技術(shù)的成熟及運用，生物堿的分析方法有了較多的突破，但具體應(yīng)用在延胡索中的并不太多，目前分析延胡索中生物堿最主要分析方法還是HPLC。多數(shù)學(xué)者均針對延胡索中延胡索乙素、去氫紫堇堿、四氫黃連堿、小檗堿、巴馬汀進(jìn)行比較研究，而趙新娟[9]等建立了HPLC法測定延胡索中7種異喹啉類生物堿的方法，分析時間為45 min，流動相為乙腈（B）-0.1%醋酸水（三乙胺調(diào)pH至5.0）（A），柱溫30℃。UPLC法具有快捷高效的特點，因此，我們采用UPLC法建立了同時測定延胡索中8種生物堿的方法，分析時間為20 min，縮短了分析時間，提高了分析效率。流動相用量也較HPLC大大減少，減輕了有機試劑的回收的負(fù)擔(dān)和成本?；诔咝б合嗌V作為一種高效、精確的分析技術(shù)[17]，目前已經(jīng)應(yīng)用到多種領(lǐng)域[18-19]。該方法從線性、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性以及加樣回收等指標(biāo)都有較好的對應(yīng)關(guān)系，能夠客觀、全面評價延胡索生品及其炮制品多種生物堿質(zhì)量，幾種成分的含量較高，也是延胡索生物堿中的主要成分。為完善延胡索藥材質(zhì)量控制提供新技術(shù)方法以及科學(xué)依據(jù)。

表3 樣品中8種生物堿含量mg/g

流動相中的pH和溫度對生物堿的分離度、保留時間影響比較大。在洗脫條件中考察了乙腈-氨水系統(tǒng)，分別加入氨水考察 pH 值（pH3、3.5、4、5），發(fā)現(xiàn)色譜峰拖尾以及基線漂移較嚴(yán)重，隨后考察了乙腈-甲酸水系統(tǒng)，分別加入不同濃度的甲酸（0.05%、0.1%、0.15%、0.2%），發(fā)現(xiàn)隨著酸度濃度增加到0.2%時各組分的峰形及分離度有顯著提高。色譜柱溫度考察了 20℃、25℃、30℃、35℃、45℃、55℃，柱溫越高有利于減小柱壓，保護(hù)色譜柱，同時縮短分析時間，最后選取乙腈-0.2%甲酸水，柱溫55℃進(jìn)行分析，通過進(jìn)一步梯度優(yōu)化，可將各組分有效的分離。另外，對波長選擇時進(jìn)行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)在280 nm處，8種生物堿成分吸收和峰形較好且基線比較穩(wěn)定，故選擇280 nm作為檢測波長。

延胡索的主要生物堿活性成分為叔胺堿、季胺堿[20-21]。其中四氫非洲防己堿、原阿片堿四氫黃連堿、延胡索乙素屬于幾乎不溶或難溶于水的叔胺堿；非洲防己堿、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、去氫紫堇堿屬于比較易溶于水的季胺堿。由實驗結(jié)果可知，延胡索叔胺堿經(jīng)過醋煮炮制后含量比延胡索生品高，由于炮制所用輔料食醋能與延胡索中生物堿結(jié)合成鹽而增大溶解度，所以提高了生物堿的溶出率[22]；延胡索季胺堿經(jīng)醋煮炮制后含量比延胡索生品低，可能由于易溶于水的季胺堿經(jīng)醋煮炮制后，生物堿成分分解或破壞。其中，四氫黃連堿含量在炮制前后無顯著性差異。2015年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定的延胡索質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)一般以延胡索乙素的含量為重要指標(biāo)且不低于0.05%，按此標(biāo)準(zhǔn)，所有樣品均符合規(guī)定。延胡索的鎮(zhèn)痛活性是其所含的多種生物堿共同作用的結(jié)果，只對延胡索乙素含量進(jìn)行控制是不夠的，需要盡可能多地表征其他不同生物堿的含量[23]。多種生物堿指標(biāo)全面評價延胡索藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)還有待進(jìn)一步研究。