卵巢早衰卵泡膜功能的研究進(jìn)展

張宇馳 盛 波 趙 聰 歷 凱 鄭 義 葛鵬玲

卵泡膜(follicular theca)是一層圍繞顆粒細(xì)胞的結(jié)締組織，由膜內(nèi)腔和膜外腔組成，膜內(nèi)腔含有分泌細(xì)胞，膜外腔由成纖維細(xì)胞組成。膜內(nèi)腔和膜外腔均含有血管組織、免疫細(xì)胞和基質(zhì)因子。卵泡膜為顆粒細(xì)胞層、卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞提供營養(yǎng)。故卵泡膜不僅對維持卵泡結(jié)構(gòu)的完整性至關(guān)重要，而且能產(chǎn)生關(guān)鍵的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)因子，如雄激素(包括睪酮和二氫睪酮)以及生長調(diào)節(jié)因子(包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白和轉(zhuǎn)化生長因子β)[1]。因此，研究卵泡膜功能對卵巢疾病的影響至關(guān)重要。近年來，新的分子細(xì)胞學(xué)方法以及老鼠模型已揭示卵泡膜對卵泡生長的影響以及對卵巢早衰(POF)疾病的影響。本文將對卵泡膜功能與POF疾病的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

一、卵泡膜功能的研究

1.卵泡膜形成的研究概況：1996年，Dong等[2]首次報道卵母細(xì)胞中的生長分化因子9(GDF9)參與調(diào)節(jié)卵泡膜形成，研究結(jié)果顯示，在卵母細(xì)胞缺失GDF9的突變小鼠中卵巢功能被破壞。該研究首先在缺失GDF9的小鼠中發(fā)現(xiàn)小鼠卵泡停留在原始卵泡階段，卵泡膜層不能發(fā)育。隨后，在含有GDF9突變的綿羊和人類中觀察到卵泡發(fā)育停滯[1]。以上研究結(jié)果首次證實(shí)從卵母細(xì)胞調(diào)節(jié)卵泡膜細(xì)胞層的功能和形成[2]。然而，GDF9是如何直接或間接介導(dǎo)該過程的機(jī)制尚不清楚。目前，有研究表明，GDF9可能是通過激活Hedgehog(HH)信號通路以及誘導(dǎo)BMP信號的抑制劑Gremlin介導(dǎo)卵泡膜形成過程[3]。此外，更有最新研究指出，原始卵泡和GDF9的表達(dá)受卵母細(xì)胞中特定因子的調(diào)節(jié)，這些因子包括FIGLA、LHX8、NOBOX、SOHLH1和SOHLH2以及NOTCH信號通路的組成部分JAG1和JAG2[4,5]。

Wijgerde等[6]的研究表明，在小鼠和牛卵巢中HH信號通路成分的表達(dá)可能影響局部細(xì)胞模式，該途徑的配體是Desert hedgehog(DHH)和Indian hedgehog(IHH)而非Sonic hedgehog(SHH)，并在生長卵泡的顆粒細(xì)胞中選擇性表達(dá)，同時激活HH細(xì)胞表面跨膜受體PATCHED1(PTCH1)和PATCHED2(PTCH2)，PTCH1、PTCH2存在于卵泡膜內(nèi)膜、間質(zhì)、成纖維細(xì)胞和血管周細(xì)胞中[7]。PTCH1/2的激活釋放抑制PTCH1/2的G蛋白樣受體Smoothened(SMO)從而導(dǎo)致下游轉(zhuǎn)錄因子GLI1和GLI2的激活，已有研究指出，GLI1和GLI2是膜前體細(xì)胞的潛在標(biāo)志物[3]。SMO的激活還可以誘導(dǎo)抑制因子(PTCH2)和Hedgehog相互作用蛋白(HHIP)在卵泡內(nèi)提供自分泌負(fù)調(diào)控作用[7]。因此，HH信號在局部水平被受到嚴(yán)格控制。更有研究顯示，GLI1也是人睪丸間質(zhì)前體細(xì)胞的標(biāo)志物[8]。

最新對AMHR2-Cre小鼠研究中表明[6]：①SMO的過度激活導(dǎo)致HHIP被誘導(dǎo)，有力地證明SMO的激活能顯著誘導(dǎo)HH信號的負(fù)調(diào)控作用；②類固醇生成基因表達(dá)升高，包括通常在卵泡膜細(xì)胞中表達(dá)的基因(Cyp11a1和Cyp17a1)；③SMO的過度激活也導(dǎo)致生長卵泡膜中血管周圍平滑肌細(xì)胞的缺失。該研究團(tuán)隊還發(fā)現(xiàn)，小鼠早在出生后第8天就明顯缺乏α-平滑肌肌動蛋白(aSMA)，在整個毛囊發(fā)育過程中持續(xù)存在，并與排卵缺陷有關(guān)[9]。由此可知，胚胎卵巢中SMO的過度激活似乎增強(qiáng)了卵泡膜(和顆粒)的類固醇內(nèi)分泌功能，但抑制平滑肌細(xì)胞的功能。

更有研究表明，卵母細(xì)胞衍生因子GDF9調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞中DHH和IHH的表達(dá)，從而為GDF9的缺失擾亂卵泡膜細(xì)胞的募集、增殖、類固醇生成進(jìn)而影響卵泡生長提供了一個潛在的解釋[3]。

2.卵泡膜細(xì)胞的功能：研究顯示，類固醇生成因子1(SF-1)調(diào)節(jié)性腺和腎上腺中的類固醇生成基因[3]。該研究表明SF-1在卵泡膜的內(nèi)分泌細(xì)胞中具有重要的調(diào)控作用，SF-1敲除小鼠主要表現(xiàn)為不孕，性腺、垂體促性腺激素和腎上腺缺失?；谠擁椦芯康贸?，DHH和IHH參與調(diào)節(jié)卵泡膜上的內(nèi)分泌細(xì)胞包括腎上腺、卵泡膜細(xì)胞和Leydig細(xì)胞中的SF-1和類固醇生成酶Cyp11a1的表達(dá)來調(diào)節(jié)類固醇分化和合成。同時該實(shí)驗還發(fā)現(xiàn)AMHR2-Cre小鼠中SMO過表達(dá)使HH信號激活，從而導(dǎo)致出生第2天小鼠的卵巢中腎上腺樣細(xì)胞的Shh、Star和Cyp21a1表達(dá)出現(xiàn)異常，但不會對成年小鼠卵巢的類固醇合成有影響[6]。另一項研究表明，通過SF-1/Cre 途徑激活HH信號，導(dǎo)致胎鼠卵巢Leydig細(xì)胞表現(xiàn)異常及假兩性的畸形[10]。以上結(jié)果表明，卵泡膜細(xì)胞中HH信號的激活對類固醇合成的影響并非一成不變，它具有階段性和環(huán)境特異性。

Lee等的研究表明，當(dāng)SF-1基因中的類泛素化位點(diǎn)(K119、K194)突變?yōu)榫彼?K119R、K194R)時，在小鼠胚胎的睪丸和腎上腺中會出現(xiàn)HH信號的異常激活。具體地說，該研究結(jié)果顯示，誘導(dǎo)小鼠睪丸中通常非表達(dá)的SHH，將導(dǎo)致胚胎睪丸中特異性腎上腺基因(Akr1b7和Cyp21a1)和胚胎腎上腺中特異性睪丸基因(Sox9和Amhr2)的表達(dá)。同時，突變的胚胎睪丸中的Leydig細(xì)胞出現(xiàn)高表達(dá)的特異性基因(Lhcgr、Star、Cyp17a1和Insl3)和睪酮。致使睪丸發(fā)育異常，成年雄性小鼠不孕。盡管胚胎卵巢的類泛素化SF-1無顯著表達(dá)，并且在同一發(fā)育階段似乎不受突變型非類泛素化SF-1的影響，但雌性小鼠最終會表現(xiàn)不孕。如前所述，在AMHR2-Cre的小鼠胚胎卵巢中，SHH和CYP21A1被SMO過表達(dá)而激活，進(jìn)一步表明胚胎性腺中內(nèi)分泌前體細(xì)胞的重要性[6]。因此，有研究預(yù)測，在SF-1突變的卵巢細(xì)胞中SHH的異常表達(dá)將可能影響卵泡膜細(xì)胞基因的表達(dá)和后期發(fā)育的功能。

值得注意的是SMO、PTCH1和GLI1在顆粒細(xì)胞中也有表達(dá)。盡管在顆粒細(xì)胞中有HH信號在卵泡發(fā)育過程中的作用研究，但尚未被徹底闡明。根據(jù)顆粒細(xì)胞中HH信號通路成分水平的增加致使Smad1/5和BMPR1的缺失，可得出在顆粒細(xì)胞中BMPR1的活性被抑制與HH信號通路有關(guān)。更有研究指出，在Foxl2敲除小鼠中DHH mRNA表達(dá)明顯增加HH信號通路，F(xiàn)oxl2是一個關(guān)鍵的顆粒細(xì)胞命運(yùn)決定因素，推測HH信號可能被Foxl2調(diào)控在顆粒細(xì)胞中。

二、卵巢早衰卵泡膜的功能變化

1. 卵泡膜GDF9表達(dá)異常導(dǎo)致卵巢早衰：盡管大多數(shù)卵巢早衰(POF)的病因仍然是特發(fā)性的和未知的，但很明顯，胚胎期和出生后的卵泡膜功能的破壞會導(dǎo)致異常的卵泡形成和生長。如前所述，小鼠卵母細(xì)胞衍生因子GDF9的缺失阻止了卵泡膜細(xì)胞層的組織，導(dǎo)致卵泡生長停滯、POF和不孕[2]。已有報道指出，人類GDF9基因的突變與POF相關(guān)，該研究表明GDF9對女性卵巢功能至關(guān)重要。根據(jù)GDF9在卵泡發(fā)育早期卵泡膜細(xì)胞募集和功能中的關(guān)鍵作用，可以通過調(diào)節(jié)GDF9表達(dá)水平或是使GDF9活性因子被破壞亦或發(fā)生基因突變都將會導(dǎo)致POF的發(fā)生。GDF9基因異常導(dǎo)致POF的原因之一是已有研究表明，在卵母細(xì)胞中表達(dá)的新生卵巢同源(NOBOX)蛋白被敲除后，GDF9的表達(dá)被抑制導(dǎo)致卵泡生長停滯[4]。此外，GDF9基因是NOBOX的直接靶基因。GDF9啟動子區(qū)域與NOBOX的結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合，從而使GDF9基因上游改變，導(dǎo)致GDF9的異常表達(dá)，最終POF發(fā)生[11]。

2. 卵泡膜基因突變導(dǎo)致POF：BMP15和GDF9一樣，在卵母細(xì)胞中表達(dá)，并影響卵泡發(fā)育[12]。然而，與GDF9的功能不同，BMP15的缺失可增加生育能力，BMP15基因是GDF9異二聚體通過BMPR2和ALK6的共同受體組成的獨(dú)特受體復(fù)合物，并表現(xiàn)出更強(qiáng)的活性[12]。已有研究顯示，BMP15的突變與POF有關(guān)，BMP15啟動子的一個突變似乎增加了由垂體同源體1(PITX1)介導(dǎo)的BMP15轉(zhuǎn)錄，PITX1是一種在卵母細(xì)胞中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。BMP15的過表達(dá)降低了顆粒細(xì)胞促卵泡生長激素受體(FSHR)的表達(dá)，導(dǎo)致卵泡消亡[13]。但BMP15和BMPR2的突變是否與卵泡膜功能被破壞有關(guān)尚待研究確定。

最近全外顯子測序在POF家族中的應(yīng)用已經(jīng)確定了一系列的新基因，這些新基因也可能像GDF9和NOBOX一樣，涉及卵母細(xì)胞的丟失或改變卵泡膜功能以及隨后的卵泡消亡。許多新發(fā)現(xiàn)的基因與減數(shù)分裂和DNA損傷反應(yīng)有關(guān)。與減數(shù)分裂功能障礙相關(guān)的新基因包括STAG3、HFM1、MCM8、SGO2和NUP107[14～18]。筆者推測未來幾年，將會發(fā)現(xiàn)更多的新基因。

DNA損傷反應(yīng)基因突變導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定也將最終導(dǎo)致POF。這些基因包括NBN、WRN和RECQ14基因的突變[19～21]。但上述基因在卵泡膜細(xì)胞生物學(xué)中的作用尚無研究報道，但它們可能會對卵泡膜功能產(chǎn)生有害影響，因為如上所述，卵母細(xì)胞中表達(dá)的任何基因的破壞都可能導(dǎo)致卵泡膜細(xì)胞的功能異常，從而導(dǎo)致卵泡發(fā)育障礙及卵巢早衰疾病的發(fā)生。

最新研究表明，卵巢細(xì)胞中IHH和DHH的破壞或SMO的過度表達(dá)與卵泡膜細(xì)胞發(fā)育和功能異常有關(guān)。然而，Tsuji等[22]研究表明在女性中，HH信號通路基因的突變與POF可能無關(guān)。盡管許多基因在小鼠體內(nèi)的破壞已經(jīng)揭示了它們在早期卵泡發(fā)育和生育中的關(guān)鍵作用，但人類的類似基因突變尚未觀察到(上文所述的除外)。另有研究指出，LH受體上LHCGR和INSL3的突變會影響卵泡膜細(xì)胞的功能和生育能力。ADAMTS19和IGFR2的基因突變與POF有關(guān)。由于ADAMTS19只在胚胎卵巢表達(dá)，而不在睪丸中表達(dá)，因此Adamts19將受到更多關(guān)注。

三、展 望

卵巢早衰(POF)是導(dǎo)致女性不孕的重要原因之一，研究顯示，POF在育齡婦女中的發(fā)生率為1%～3%，其伴隨出現(xiàn)的圍絕經(jīng)期生理和心理變化以及因性激素缺乏而引起的神經(jīng)、代謝、心血管系統(tǒng)異常和骨質(zhì)疏松等表現(xiàn)嚴(yán)重影響女性的正常生活和工作[23]。近年來，該疾病趨近于年輕化并且發(fā)生率呈逐年上升趨勢，患者的發(fā)病原因不僅與遺傳、免疫等因素有關(guān)，有些藥物或卵巢手術(shù)也可能會引起POF的發(fā)生，甚至工作壓力大、長期焦慮或抑郁等會給女性精神上造成極大的危害，以致出現(xiàn)月經(jīng)不調(diào)、內(nèi)分泌紊亂等癥狀，從而影響到卵巢的正常功能。

卵巢早衰發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，涉及卵巢中基因、激素水平及信號通路多種因素，引起卵巢功能障礙。近年來關(guān)于卵巢卵泡膜功能異常導(dǎo)致POF的研究取得一定進(jìn)展。卵泡膜是一個復(fù)雜的動態(tài)組織，由膜內(nèi)分泌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管成分、免疫細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)組成。這些細(xì)胞和基質(zhì)分子以及垂體通過提供激素、營養(yǎng)和結(jié)構(gòu)來調(diào)節(jié)毛囊的生長；反過來，它們又受到來自顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞的因子的調(diào)節(jié)[24]。因此，關(guān)注卵巢卵泡膜功能變化對卵巢早衰等性腺疾病的發(fā)病機(jī)制研究尤為重要。目前卵巢早衰卵泡膜功能研究仍較少，需開展更深入的研究與探索。