細(xì)胞釋放的微粒的檢測(cè)方法研究進(jìn)展

楊薈圓 路 明 張迎媚

微粒(MPs)是各種血液細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞受刺激活化或凋亡而釋放到血液循環(huán)中的直徑0.1～1.0μm的小泡狀膜顆粒[1]。當(dāng)細(xì)胞活化或凋亡時(shí)，細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層不對(duì)稱性喪失，引起一系列的生物學(xué)變化，使細(xì)胞膜脫落形成MPs[2]。MPs不僅僅是簡(jiǎn)單的細(xì)胞脫落物，它攜帶有其來(lái)源細(xì)胞的一些基本物質(zhì)，主要包括脂類和蛋白質(zhì)，也包含mRNA、microRNA，但沒有細(xì)胞核結(jié)構(gòu)。各種細(xì)胞來(lái)源的MPs表面均攜帶有其母體細(xì)胞的特異表面抗原。MPs表面還有磷脂酰絲氨酸(PS)暴露，這一點(diǎn)與細(xì)胞不同。

MPs具有廣泛的生物學(xué)活性，其生物學(xué)特性在很大程度上取決于其蛋白質(zhì)和脂質(zhì)組成，而蛋白質(zhì)組成又取決于其來(lái)源的細(xì)胞和導(dǎo)致其產(chǎn)生的刺激因素[3]。例如，來(lái)自內(nèi)皮細(xì)胞的MPs (EMPs) 含有大量的代謝酶、參與細(xì)胞外滲的蛋白質(zhì)和細(xì)胞骨架相關(guān)的蛋白質(zhì)；血小板釋放的MPs (PMPs) 表面則富集整合素、p-選擇素等蛋白，而活化中性粒細(xì)胞來(lái)源的MPs中整合素Mac-1濃度較高[4]。MPs也可以作為細(xì)胞與細(xì)胞之間傳遞信號(hào)的媒介。MPs在炎癥、免疫、與癌癥相關(guān)的靜脈血栓栓塞 (VTE) 和血管等疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，對(duì)于這些疾病，檢測(cè) MPs性質(zhì)及水平有助于監(jiān)測(cè)病情、指導(dǎo)治療及判斷療效[5，6]。但是，由于MPs 極小，常規(guī)檢測(cè)方法的敏感度和分辨率常常不夠，使得 MPs 的檢測(cè)受到很大限制。

本文介紹了許多檢測(cè)MPs的方法，用來(lái)確定的MPs直徑、數(shù)量、形態(tài)學(xué)、細(xì)胞來(lái)源和生物學(xué)活性。這些分析MPs的方法各有其優(yōu)勢(shì)和不足，微粒檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)化在技術(shù)方面還面臨極大挑戰(zhàn)。本文從定性和定量分析兩方面對(duì)MPs一些常用的檢測(cè)方法做一簡(jiǎn)單介紹。

一、 定性分析方法

1.透射電子顯微鏡法(TEM)：TEM利用電子獲得樣本的二維圖像，它的特點(diǎn)是具有極高的分辨率(接近0.1nm)，可以用來(lái)評(píng)估MPs的直徑、膜的形態(tài)和組成[7]。使用膠體金標(biāo)記的抗體可以獲得關(guān)于MPs抗原成分的信息[8]。

該方法需要通過(guò)超離心技術(shù)使樣品中的MPs濃縮，因此不能對(duì)原樣本中MPs的數(shù)量進(jìn)行定量分析[9]；不能直接檢測(cè)血漿中的MPs，因?yàn)樗枰獙?duì)樣品進(jìn)行固定和脫水，而這一操作過(guò)程對(duì)MPs的直徑和形態(tài)有著直接的影響[10]。該方法樣本制備過(guò)程非常耗時(shí)，而且鏡下檢測(cè)也需要幾個(gè)小時(shí)。因此本方法主要用于對(duì)MPs的直接觀察或?qū)ζ渌麢z測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證。

2.激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)(LSCM)：LSCM是熒光顯微鏡的一個(gè)現(xiàn)代變異體，在激光掃描共聚焦顯微鏡中，使用激光做光源，與熒光顯微鏡比較，提高了圖像的分辨率；計(jì)算機(jī)代替了人眼或者照相機(jī)進(jìn)行觀察、攝像，得到的圖像是數(shù)字化的，提高了圖像的清晰度；光電倍增管的應(yīng)用，提高了檢測(cè)的敏感度。LSCM檢測(cè)前，先超速離心分離得到MPs，用PS的特異結(jié)合蛋白Annexin V固定MPs以阻止其布朗運(yùn)動(dòng)，然后用熒光素偶聯(lián)的抗體對(duì)MPs表面特異抗原進(jìn)行標(biāo)記[11]。此方法檢測(cè)結(jié)果取決于針對(duì)目標(biāo)抗原的抗體的特異性和親和力，以及MPs表面抗原的密度。LSCM技術(shù)還能夠獲得MPs的直徑、形態(tài)和結(jié)構(gòu)信息[12]。該方法的不足是耗時(shí)長(zhǎng)(每個(gè)樣品需要分析幾個(gè)小時(shí))，而且不能對(duì)血漿中的MPs直接進(jìn)行檢測(cè)。

3.原子力顯微鏡檢測(cè)(AFM)：AFM是一種可以用來(lái)研究固體材料表面結(jié)構(gòu)的分析儀器。它通過(guò)檢測(cè)待測(cè)樣品表面和一個(gè)微力敏感元件之間的極微弱的原子間相互作用力來(lái)研究待測(cè)樣本的表面結(jié)構(gòu)及性質(zhì)。將一對(duì)對(duì)微力極端敏感的微懸臂一端固定，另一端的微小針尖接近樣品，這時(shí)針尖將與樣品表面相互作用，作用力將使得微懸臂發(fā)生形變或運(yùn)動(dòng)狀態(tài)發(fā)生變化。掃描樣品時(shí)，利用傳感器檢測(cè)這些變化，就可以獲得作用力分布信息，從而以納米級(jí)分辨率獲得待測(cè)樣品表面形貌結(jié)構(gòu)信息及表面粗糙度信息。AFM可以檢測(cè)單個(gè)MP，形成檢測(cè)樣品的三維圖像[13]。

該方法要求測(cè)量前將MPs從血漿或其他樣品中分離出來(lái)、濃縮，并使之緊密結(jié)合固定到載體平面上，這會(huì)影響MPs的形態(tài)和數(shù)量，也無(wú)法測(cè)得MP的直徑。云母是一種絕緣礦物，涂于載體平面表面，特異抗體再涂于云母表面，與MPs樣本孵育后，攜帶相應(yīng)抗原的MPs即可緊密結(jié)合到載體平面上。該方法的優(yōu)點(diǎn)是能提供真正的檢測(cè)樣品的三維表面圖；可以直接在液體環(huán)境中檢測(cè)MPs，使MPs維持在生理狀態(tài)。盡管AFM允許檢測(cè)MPs并確定其表型，但不能獲得關(guān)于MPs功能特性的信息；成像范圍太?。缓臅r(shí)費(fèi)力(檢測(cè)一個(gè)樣本約需2h)。

二、定量分析方法

1.光學(xué)顯微鏡技術(shù)：光學(xué)顯微鏡的最高分辨率為200nm，比普通顯微鏡高50倍，可以看到檢測(cè)樣品的亞顯微結(jié)構(gòu)，特別適合用來(lái)觀察微小的顆粒。光學(xué)顯微鏡結(jié)合圖像分析軟件可以對(duì)MPs進(jìn)行定量分析，但很費(fèi)時(shí)(分析10000 個(gè)MPs需要幾個(gè)小時(shí))，并且這種方法不能提供關(guān)于MPs的細(xì)胞起源、抗原成分等方面的信息。

2.熒光顯微鏡技術(shù)：是將熒光與顯微鏡技術(shù)相結(jié)合的一種檢測(cè)技術(shù)，也是一種很有前途的MPs檢測(cè)技術(shù)。其利用熒光素標(biāo)記的抗體檢測(cè)微粒表面特異的抗原，從而對(duì)微粒的特定屬性進(jìn)行定量分析。這種方法同樣耗時(shí)較長(zhǎng)(每個(gè)樣本平均檢測(cè)時(shí)間約為1h)，并且不能測(cè)量MPs的直徑。隨著光學(xué)成像技術(shù)的不斷進(jìn)步，熒光顯微鏡是一種很有前景的MPs檢測(cè)技術(shù)，例如借助FITC-annexin V標(biāo)記PS，熒光顯微鏡可以動(dòng)態(tài)觀察MPs自細(xì)胞膜脫落、形成的過(guò)程[14]。但是，由于納米級(jí)MPs的快速布朗運(yùn)動(dòng)的存在，限制了該技術(shù)敏感度的提高[11]。

3.流式細(xì)胞術(shù)：流式細(xì)胞術(shù)是最常用的鑒定MPs、并對(duì)其進(jìn)行定量分析的方法[15]。該方法檢測(cè)MP獲得兩部分參數(shù)：散射光強(qiáng)度和熒光強(qiáng)度(熒光偶聯(lián)于抗體上并進(jìn)一步結(jié)合到特異的目標(biāo)抗原上)。前向角散射光(FSC)強(qiáng)度反映細(xì)胞/MPs的直徑，而側(cè)向角散射光(SSC)強(qiáng)度提供待測(cè)細(xì)胞/MPs內(nèi)顆粒結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度的信息[11]。使用已知大小的熒光素標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)微球，通過(guò)比較MPs與標(biāo)準(zhǔn)微球的FSC強(qiáng)度，可以確定MPs群[16]。使用已知濃度的熒光素標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)微球，將其添加到特定體積的MPs樣品中，通過(guò)計(jì)算檢測(cè)到的MPs與標(biāo)準(zhǔn)微球的數(shù)量比，可以確定樣品中MPs的濃度[17]。用針對(duì)細(xì)胞特異抗原的熒光標(biāo)記的抗體對(duì)MPs進(jìn)行染色，可以評(píng)估MPs的細(xì)胞來(lái)源。此外，使用熒光素標(biāo)記的Annexin V，可以驗(yàn)證MPs的磷脂分布特性，即MPs表面有PS的暴露[18]。

流式細(xì)胞術(shù)的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是可以采用熒光素雙標(biāo)甚至多標(biāo)法測(cè)定MPs的起源。流式細(xì)胞術(shù)的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是每秒可以分析成千上萬(wàn)個(gè)MPs[19]。流式細(xì)胞術(shù)不需要檢測(cè)前從待測(cè)樣本中分離MPs，因此能很好地保留MPs的形態(tài)學(xué)特征，并防止MPs數(shù)量的丟失。然而，流式細(xì)胞術(shù)也有一些局限性：它沒有提供細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面的詳細(xì)信息；受儀器分辨率的限制，絕大多數(shù)流式細(xì)胞儀不能檢測(cè)0.1～0.4μm直徑的MPs；小的MPs聚集成團(tuán)，會(huì)被記為一個(gè)MPs；實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差；檢測(cè)結(jié)果受儀器的類型、設(shè)置、數(shù)據(jù)分析者的能力以及樣品的制備和儲(chǔ)存方法等影響較大[20]；雖然使用表面抗原特異抗體可以檢測(cè)MPs起源，但當(dāng)MPs表面抗原的量少，同時(shí)伴有抗原抗體的結(jié)合能力相對(duì)弱時(shí)，特異性熒光強(qiáng)度較低，MPs可能不能被檢出。

4.基于阻抗的流式細(xì)胞術(shù)：該技術(shù)的工作原理也是目前普遍使用的血細(xì)胞分析儀的工作原理，又稱庫(kù)爾特原理。無(wú)論是血細(xì)胞還是MPs，都是電的不良導(dǎo)體。將待測(cè)樣本用電解液稀釋，懸浮于電解質(zhì)溶液中的顆粒被抽吸而通過(guò)兩側(cè)置有兩枚電極的小孔的周邊。當(dāng)控制通過(guò)該小孔電流時(shí)，小孔周邊會(huì)產(chǎn)生一個(gè)電感應(yīng)區(qū)，隨著每個(gè)顆粒通過(guò)該電感應(yīng)區(qū)，顆粒會(huì)置換出電感應(yīng)區(qū)內(nèi)等體積的導(dǎo)電液體，瞬間增加了該電感應(yīng)區(qū)的電阻。這種電阻的變化經(jīng)過(guò)一個(gè)放大器會(huì)產(chǎn)生一種成比例的電脈沖，儀器能夠?qū)﹄娒}沖進(jìn)行精確的測(cè)量。這種脈沖的強(qiáng)度與產(chǎn)生它的顆粒的大小呈正比，因此就可以在幾秒鐘內(nèi)對(duì)液體中的顆粒進(jìn)行識(shí)別和計(jì)數(shù)。該技術(shù)的檢出下限為300nm，因此直徑<300nm的MPs不能檢出。該方法不能提供MPs的形態(tài)、細(xì)胞來(lái)源、功能等方面信息。

5.免疫印跡法(Western blot法)：MPs用裂解液裂解后，用聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白質(zhì)，然后將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體硝基纖維素膜或聚偏氟乙烯膜上，用針對(duì)特定抗原的一抗標(biāo)記，再用針對(duì)一抗的帶有標(biāo)志物的二抗孵育，最后標(biāo)志物顯色，結(jié)合特定圖像分析軟件，即可定量MPs中特定抗原的表達(dá)量[21，22]。

Western blot法分析需要大量MPs，這限制了該方法應(yīng)用于血漿MPs的檢測(cè)；另外，該法允許研究MPs的蛋白表達(dá)，但不能提供關(guān)于MPs直徑和數(shù)量的信息。

6.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)：ELISA是利用抗原抗體特異結(jié)合特性對(duì)樣本中特異蛋白進(jìn)行定量分析的一種簡(jiǎn)便易行的檢測(cè)方法。該方法重復(fù)性好，可用來(lái)定量分析MPs表面的抗原，也可以通過(guò)定量MPs表面攜帶的PS的量間接地定量MPs的數(shù)量[23]。包被于96孔板上的Annexin V或針對(duì)MPs表面特異抗原的抗體(捕獲抗體)，與血漿中MPs特異性結(jié)合后，用針對(duì)MPs表面特異抗原、與熒光素偶聯(lián)的抗體(檢測(cè)抗體)檢測(cè)被捕獲MPs的表面抗原的表達(dá)量；用與熒光素偶聯(lián)的Annexin V代替檢測(cè)抗體，可以檢測(cè)出MPs表面PS的總量，從而間接測(cè)定MPs的數(shù)量。

ELISA檢測(cè)MPs的優(yōu)點(diǎn)為可以同時(shí)檢測(cè)很多樣本，是一種高通量檢測(cè)方法；沒有MPs直徑限制；能定量評(píng)估MPs數(shù)量。該方法也有一些缺點(diǎn)：僅能檢測(cè)可溶性抗原；不能提供MPs直徑的信息；存在Annexin V非特異性結(jié)合，使該方法的應(yīng)用受到限制[24]。另外，該方法需要使用新鮮的血漿，因?yàn)閮鋈跁?huì)引起MPs表面PS的數(shù)量增加。

7.用于定量MPs表面特定生物活性分子的功能實(shí)驗(yàn)：本法是基于MPs的某些特定生物學(xué)功能對(duì)MPs特定性征進(jìn)行定量分析。例如，PS具有促凝血活性，而MPs表面暴露有PS，因此，采用MPs促凝活性/促凝血酶生成活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，就可以間接測(cè)定MPs數(shù)量[2,25]。再如，MP-TF活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定MP-TF依賴的凝血因子Xa的生成量，可以確定MPs表面攜帶的活性TF的量[26，27]。由于MPs表面攜帶的、有特定生物學(xué)活性、適合分析的分子種類很少，此類檢測(cè)方法數(shù)量十分有限。

功能實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，可以同時(shí)分析很多樣本，檢測(cè)的是樣本中全部MPs的功能，不受MPs直徑和來(lái)源的限制。該方法的不足是它們不能評(píng)估樣本中MPs的直徑及數(shù)量。

到目前為止，流式細(xì)胞術(shù)與功能實(shí)驗(yàn)在MPs檢測(cè)方面獲得的數(shù)據(jù)不多，但兩種方法測(cè)定的結(jié)果一致性差?？紤]到流式細(xì)胞術(shù)不能檢測(cè)直徑<400nm的MPs，而血漿中直徑<200nm的MPs在凝血過(guò)程中的作用不可忽視，那么從功能實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)中得到的結(jié)果不一致是可以理解的。

三、MPs檢測(cè)方法的選擇

從上述介紹可以看出，每種檢測(cè)方法有其各自獨(dú)特的用途、優(yōu)勢(shì)和不足，充分了解每種檢測(cè)技術(shù)是選擇適合的檢測(cè)方法的前提。針對(duì)不同的研究目的，結(jié)合不同的實(shí)驗(yàn)室實(shí)際條件，可以選擇不同的檢測(cè)方法，來(lái)獲得研究者所需要的信息。比如，很多實(shí)驗(yàn)常常需要同時(shí)獲得關(guān)于MPs數(shù)量與來(lái)源方面的信息。經(jīng)上面分析可知，流式細(xì)胞術(shù)、ELISA都是可以選擇的能同時(shí)獲得這兩方面信息的方法。例如Sarlon-Bartoli等[16]在分析白細(xì)胞來(lái)源MPs的血漿水平與頸動(dòng)脈高度狹窄患者的不穩(wěn)定斑塊的相關(guān)性的研究中用高敏感度流式細(xì)胞儀測(cè)定血漿中不同MPs的細(xì)胞來(lái)源及數(shù)量。有研究者使用ELISA法對(duì)腦梗死慢性期患者血漿中的血小板來(lái)源MPs的水平進(jìn)行了定量分析。還有一種技術(shù)，該技術(shù)的原理是將ELISA與定量MPs表面PS的功能實(shí)驗(yàn)兩種檢測(cè)方法結(jié)合起來(lái)，也能達(dá)到同時(shí)獲得這兩方面信息的目的。Delabranche等即使用了這一技術(shù)對(duì)血漿中不同細(xì)胞來(lái)源的MPs在感染性休克引發(fā)的DIC中的數(shù)量變化情況進(jìn)行了動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。另外，還可以將定性與定量分析方法聯(lián)合應(yīng)用，利用每種分析方法的優(yōu)勢(shì)，來(lái)彌補(bǔ)另一分析方法的不足。比如研究者采用透射電鏡和流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)對(duì)急性呼吸窘迫綜合征大鼠血漿中不同細(xì)胞來(lái)源的微粒進(jìn)行了定性、定量分析。再如Hughes等將正常人血小板置于肝素誘發(fā)的血小板減少癥患者血漿中，并加入肝素激活血小板，然后聯(lián)合使用電子顯微鏡、共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)，對(duì)血小板釋放微粒情況進(jìn)行定性、定量分析。

四、展 望

人血漿中循環(huán)MPs的發(fā)現(xiàn)具有重大意義，深入研究MPs的機(jī)制，可為臨床許多疾病包括心血管疾病、凝血相關(guān)疾病以及一些惡性疾病的診斷、病情評(píng)估、療效判定提供依據(jù)。近年來(lái)，關(guān)于MPs的分析方法多種多樣，但都存在一定的局限性，由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)方法，MPs研究需要進(jìn)一步發(fā)展，用重復(fù)性好的方法測(cè)量MPs仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。目前流式細(xì)胞術(shù)似乎是研究MPs的最佳技術(shù)，因?yàn)樗哂卸鄥?shù)分析的可能性，它不僅提供定量信息，而且提供定性信息，盡管有許多限制，它仍然是檢測(cè)和分析MVs最常用的技術(shù)。隨著技術(shù)的進(jìn)步，硬件設(shè)施分辨率的逐漸提高，方法學(xué)的進(jìn)一步完善和發(fā)展，MPs的檢測(cè)方法將會(huì)越來(lái)越標(biāo)準(zhǔn)化，這將會(huì)有效促進(jìn)MPs在生理和病理情況下發(fā)揮作用的研究，也會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)MPs在臨床疾病的診斷和治療中的應(yīng)用。