長鏈非編碼RNA人母系表達基因3在腫瘤發(fā)生中作用的研究進展

丁佳寧，馬進原，朱全剛，

(1.上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院藥學研究室，上海 200437；2.上海市皮膚病醫(yī)院藥劑科，上海 200443)

人類基因組測序鑒定發(fā)現(xiàn)，在人類基因組的30億個堿基對中，僅有約2%的堿基對編碼蛋白質(zhì)，即人類體細胞的180 000個轉錄本中，僅20 000個編碼蛋白質(zhì)，其余則為非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)[1-2]。非編碼RNA可分為管家RNA、短鏈非編碼RNA(sncRNA)和長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)等亞型。目前，14 880個lncRNA已被ENCORE項目所確定，許多的lncRNA有自身的啟動子，多存在于哺乳動物中，而越來越多的研究證明，lncRNA在細胞分化、遷移和凋亡中能夠發(fā)生分子交換，并通過改變基因表達模式使細胞狀態(tài)發(fā)生改變[3-4]。第一個lncRNA——lncRNAH19，由Brannan等發(fā)現(xiàn)[5]。lncRNA起初被認為是基因組轉錄的“噪音”，不具備生物學功能，但越來越多的研究表明，其參與了X染色體沉默、基因組印記以及染色質(zhì)修飾、轉錄激活、轉錄干擾、核內(nèi)運輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過程。lncRNA表達或功能異常與人類疾病的發(fā)生密切相關，包括腫瘤[6]、1型糖尿病[7]、心血管疾病[8]和退行性神經(jīng)疾病等[9]。研究亦證實lncRNA參與了多種腫瘤信號通路，如Notch、mTOR、NF-Kb和Wnt[10-11]。它們影響和調(diào)節(jié)著細胞周期及細胞的凋亡、增殖、侵襲和轉移，并參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。lncRNA可以是抑癌基因，也可以是致癌基因。如lncRNA GAS8-AS1過表達能抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞的增殖[12]，而沉默Linc00673可抑制肝癌細胞的增殖、浸潤和上皮間質(zhì)轉化(EMT)[13]。2003年，Zhang等首次發(fā)現(xiàn)lncRNA MEG3是垂體瘤的一個潛在的腫瘤抑制因子，之后研究者又在其他腫瘤上對其進行了研究，使人母系表達基因3(maternally expressed gene 3，MEG3)在腫瘤中的作用和機制得到了更好地闡明。本文總結了MEG3的功能及其在腫瘤發(fā)生中作用的研究進展。

1 lncRNA MEG3的功能

MEG3是一種母系印記基因編碼的lncRNAs，它是小鼠母系印記基因Gtl2的人類同系物，首次識別于小鼠12號染色體末端，長度為35 000的單拷貝印記基因，是首個被發(fā)現(xiàn)的有腫瘤抑制功能的長鏈非編碼RNA[14]。

母系表達基因MEG3與父系表達基因DLK1可構成DLK1-MEG3印記域，它們分別位于人染色體14q32.3和鼠染色體12。其轉錄缺乏明顯的開放閱讀框，位于蛋白編碼基因DLK1的100 000處，啟動子易發(fā)生差異甲基化，且轉錄方向與DLK1一致。此印記域包含兩個差異甲基化區(qū)域(DMRs)，分別是IG-DMR和MEG3-DMR。MEG3-DMR的甲基化模式取決于IG-DMR，表明它們之間存在等級相互作用和明顯的特性[15]。

MEG3在多數(shù)正常組織中均有表達，如在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、唾液腺、胰腺和腎臟上皮細胞的發(fā)育過程中表達水平較高，其在成年小鼠腎上腺、腦垂體和大腦中也有表達，然而在人類腫瘤(如非小細胞肺癌、胃癌、子宮頸癌等)中異常低表達或不表達[16]。過表達的MEG3能抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡，說明MEG3可能是一個抑癌基因。研究表明其發(fā)揮抑癌作用與DNA甲基化、cAMP途徑[17]、p53基因表達[18]、Rb途徑[19]以及影響血管生成[20]有關。MEG3的表達受表觀遺傳調(diào)控，在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)CpG異常甲基化。此外，基因拷貝數(shù)缺失被認為是腫瘤發(fā)生的另一機制。MEG3缺失一方面能夠上調(diào)父系表達基因，另一方面可以下調(diào)其下游基因和抑癌基因miRNAs的表達水平，但這一觀點仍存在爭議[21]。

2 lncRNA MEG3與腫瘤

隨著MEG3在垂體瘤中的研究，使得其與腫瘤的關系逐漸受到關注。目前已有多篇研究分別報道了MEG3在非功能性垂體腺瘤[16,22-24]、腦膜癌[25]、肝癌[26]、肺癌[19]、胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌瘤[27]和前列腺癌[26-28]等多個腫瘤中的作用。

2.1 MEG3與非功能性垂體腺瘤

Zhang等于2003年首次發(fā)現(xiàn)MEG3參與了腫瘤的發(fā)生。首先，他們克隆了一個cDNA，它是來自MEG3(一個未知功能的母系表達基因)的一個新型的轉錄本，并研究了MEG3 cDNA亞型MEG3a的分子克隆、表達水平以及抗增殖作用。為了確定腫瘤形成的發(fā)病機制，他們通過cDNA代表性差異分析法比較發(fā)現(xiàn)MEG3 cDNA片段在正常人垂體組織中表達較高，而在臨床非功能性垂體腺瘤中表達較低或缺失。之后通過Northern印跡雜交和RT-PCR進一步研究證實MEG3在非功能性垂體腺瘤和多種人癌細胞中都不表達。此外，研究還發(fā)現(xiàn)MEG3可通過異位表達抑制人癌細胞HeLa、MCF-7和H4的增殖?；蚪M分析表明MEG3位于染色體14q32.3位點，此位點已被報道存在抑癌基因，并參與了腦膜癌的發(fā)病機制。這些數(shù)據(jù)表明MEG3可能是一個新型的抑癌基因，它在人垂體腺瘤的發(fā)展中起重要作用[16]。

Cheunsuchon等對MEG3抑制垂體腺瘤增殖的機制做了更深入的研究，人類臨床無功能垂體腺瘤(NFAs)中MEG3選擇性表達缺失，但是此位點上其他基因的表達情況還未見報道。RT-PCR評估了44例人垂體腺瘤(臨床無功能垂體腺瘤25例、促腎上腺皮質(zhì)激素腺瘤7例、生長激素腺瘤7例、催乳素腺瘤5例)和10例正常的垂體中DLK1-MEG3位點上24個基因的表達水平。流式細胞術分析了5個能抑制癌細胞增殖的miRNAs，發(fā)現(xiàn)其表達均很低。研究發(fā)現(xiàn)18個基因，包括DLK1-MEG3位點上的13個miRNAs的表達水平都明顯下調(diào)。促腎上腺皮質(zhì)激素腺瘤和催乳素腺瘤中分別有9個和7個miRNAs明顯下調(diào)，而7個生長激素腺瘤中沒有。另外，miR-134轉染PDFS細胞后，其G2/M期受到阻滯。這些數(shù)據(jù)表明NFAs中DLK1-MEG3位點發(fā)生了沉默，且miRNAs能抑制PDFS細胞增殖，即人NFAs中DLK1-MEG3位點起著腫瘤抑制的作用[23]。

Chunharojrith等還發(fā)現(xiàn)MEG3能明顯抑制裸鼠體內(nèi)移植瘤的生長，并阻滯細胞周期G1期。此外，p53基因失活完全阻礙了MEG3的腫瘤抑制作用，這表明MEG3的腫瘤抑制作用是由p53介導的[24]。

2.2 MEG3與腦膜瘤

腦膜瘤是最常見的惡性腫瘤，占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的15%～25%。早期人們認為腫瘤的發(fā)生是由于染色體22上NF2基因的失活，但是原因尚未明確。染色體14q32異常與腦膜瘤的發(fā)生和發(fā)展有關，因此猜想該位點可能存在腫瘤抑制基因。

Zhang等對正常蛛網(wǎng)膜組織和不同分級的腦膜瘤組織通過RT-PCR檢測MEG3的表達，發(fā)現(xiàn)MEG3在正常蛛網(wǎng)膜組織和細胞中高表達，但在大多數(shù)腦膜癌組織和細胞中不表達，且MEG3表達水平與腫瘤分級有密切關系?；蚪MDNA甲基化分析提示，MEG3基因啟動子、增強子和印記控制區(qū)甲基化程度亦與腫瘤分級顯著相關。功能上，溴化脫氧尿苷摻入法和集落形成實驗提示MEG3可抑制腦膜瘤細胞DNA的合成和增殖，而無啟動子的MEG3和DLKL不能。且MEG3等位基因缺失，高級別腫瘤患病率增加。此外，MEG3能夠刺激癌細胞中p53介導的轉錄。這些數(shù)據(jù)表明lncRNA MEG3可能是一個抑癌基因[25]。

2.3 MEG3與肝癌

通過微陣列分析了惡性肝細胞中23 000個lncRNA，顯示有712(約占3%)個lncRNAs表達水平下調(diào)，其中，MEG3表達下調(diào)至1/210。Braconi等通過RT-PCR發(fā)現(xiàn)，與正常肝細胞相比，MEG3在4種人肝癌細胞株(HepG2、Huh-7、PLC-PRF/5、hep-3B)中的表達明顯減少。RNA原位雜交結果顯示MEG3在無腫瘤正常肝中表達很高，而在肝癌組織中不表達或低表達。肝癌細胞中過表達的MEG3能抑制癌細胞增殖，誘導癌細胞凋亡。甲基化特異性PCR顯示MEG3啟動子發(fā)生甲基化，采用甲基化抑制劑或DNA甲基轉移酶處理癌細胞后MEG3的表達升高。由于miRNA-29a可以調(diào)節(jié)DNMT1/3，他們通過評估m(xù)iRNA-29的表達來研究miRNA-29和MEG3的依賴性調(diào)節(jié)。過表達的miRNA-29a增加MEG3的表達水平。GTL2是MEG3的小鼠同源物，在肝細胞特異性miRNA-29a/b1基因敲除小鼠的肝組織中表達下調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明miRNA-29低表達導致的lncRNA MEG3甲基特異性調(diào)節(jié)可能有助于肝癌的生長，這突出顯示了兩種非編碼RNA的相互關系，miRNA、lncRNA和基因表達的表觀遺傳調(diào)控[26]。

2.4 MEG3與肺癌

超甲基化已被證明能夠導致基因表達缺失，Kruer等證明了MEG3的表達通過Rb通路被調(diào)節(jié)，并與細胞增殖密切相關。微陣列分析了離體基因缺失小鼠和野生型小鼠的胚胎成纖維細胞的3個Rb家族(TKO)，Gtl2/MEG3的表達顯示出明顯的基因沉默，并且Gtl2/MEG3過表達能夠抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡。帕博昔布是CDK4/6抑制劑，作用于A549和SK-MES-1細胞后，MEG3的表達呈劑量依賴性增加，但是pRb/p107敲除則會削弱此效果。此外，在2種肺癌細胞中，pRb的磷酸化不足突變體的表達能夠增加MEG3的水平。采用帕博昔布處理pRb磷酸化不足突變體細胞能降低pRb相關的DNA甲基轉移酶1(DNMT1)的表達，與此同時，DNMT1降低能導致MEG3表達升高。帕博昔布導致MEG3位點基因甲基化下調(diào)，其作用類似于5-氮雜-2-脫氧胞苷。對于藥物誘導MEG3表達的A549和SK-MES-1細胞，反義寡脫氧核苷酸沉默可以部分逆轉帕博昔布介導的細胞增殖抑制，而TCGA數(shù)據(jù)庫揭示了RB通路干擾的肺癌細胞中MEG3的表達減低。這些數(shù)據(jù)表明pRb-DNMT1通路的干擾導致MEG3表達降低，從而導致癌細胞的增殖[19]。

Lu等通過MTT法和克隆形成試驗發(fā)現(xiàn)，過表達的MEG3對非小細胞肺癌細胞SPC-A1、A549的增殖有明顯的抑制作用，Hoechst染色法和流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)MEG3能促進細胞凋亡；一般來說，泛素-蛋白酶途徑的快速降解會導致p53蛋白水平下降，p53蛋白的泛素化主要是由MDM2(E3泛素連接酶)介導的。通過蛋白印跡法檢測轉染后SPC-A1細胞的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)MDM2蛋白水平下降，p53蛋白水平上調(diào)，但p21Cip1(p53蛋白靶基因)蛋白水平無明顯變化，表明通過下調(diào)MDM2蛋白水平，MEG3能激活p53蛋白表達，但并不能刺激p21Cip1表達[28]。

2.5 MEG3與胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌瘤

Modali等發(fā)現(xiàn)，胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(PNETs)中MEN1基因編碼的menin蛋白雙等位基因的失活與多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤Ⅰ型(MEN1)綜合征相關是公認的，但是menin缺失/失活是否引發(fā)腫瘤的發(fā)生尚未知曉。研究發(fā)現(xiàn)menin通過MEG3啟動子CRE位點上發(fā)生的組蛋白-H3賴氨酸-4甲基化和CpG低甲基化激活了MEG3，使轉錄因子cAMP反應元件結合蛋白與之結合。MIN6細胞(胰島素分泌小鼠PNET細胞系)中MEG3的過表達能抑制細胞增殖，阻滯細胞周期，據(jù)此認為PNET細胞中MEG3有抑癌活性?；蛭㈥嚵蟹治鎏崾綧IN6鼠胰島細胞中MEG3的過表達下調(diào)了原癌基因c-MET(肝細胞生長因子受體)的表達，并明顯抑制了細胞遷移/侵襲。與正常細胞相比，鼠或人MEN1相關的PNETs中 MEG3表達下調(diào)，而c-MET表達上調(diào)。因此，通過將抑癌基因MEG3和抑制原癌基因c-MET的手段結合，能夠誘導menin蛋白的腫瘤抑制因子活性。MEG3和c-MET的表達在人散發(fā)性胰島素瘤中被改變，MEG3啟動子CRE位點超甲基化下調(diào)了MEG3的表達。這些數(shù)據(jù)也為β細胞功能維持相關增殖的機制闡明提供了新的視角。此外，DNA去甲基化藥物能抑制MIN6鼠胰島素細胞增殖，并激活MEG3的表達。這些數(shù)據(jù)表明通過lncRNA MEG3的表觀激活和c-MET的失活有望治療胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌瘤和胰島素瘤[27]。

2.6 MEG3與前列腺癌

Ribarska等通過微陣列分析了前列腺良性組織和腫瘤組織中12種印記基因HYMAI，PLAGL1/ZAC1，CDKN1C，MEG3，PEG3，PEG10，SGCE，PPP1R9A，NDN，SNRPN/SNURF，INPP5F和GNAS的表達，發(fā)現(xiàn)它們存在明顯的統(tǒng)計學差異(P<0.05)。其中有9個基因(HYMAI,PLAGL1/ZAC1，SGCE，PEG10,INPP5F,CDKN1C，MEG3，NDN和PEG3)表達水平下調(diào)，PPP1R9A和GNAS表達上調(diào)，而SNRPN/SNURF在良性組織和腫瘤組織表達都較高，這可能是由基因特定轉錄變異體的差異表達引起的[29]。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)前列腺癌腫瘤組織中MEG3表達較低，DMRs分析前列腺良性組織和腫瘤組織中CpGs平均甲基化水平無顯著性差異，ZAC1 DMR,KvDMR，7q21 DMR2，MEG3 DMR和NDN DMR甲基化程度達35%～70%。MEG3 DMR CpG2甲基化和MEG3的表達水平有較強的相關性(ρ=0.535，P<0.001)[30]。

Luo等RT-PCR檢測了21個前列腺癌患者腫瘤組織和癌旁組織中MEG3的表達水平，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中MEG3的表達水平顯著下調(diào)，此外，他們還評估了MEG3的表達與臨床病理參數(shù)的相關性，發(fā)現(xiàn)兩者并無顯著關系。過表達的MEG3能下調(diào)細胞周期調(diào)控蛋白Cyclin D1，并阻滯細胞周期G0/G1期，從而抑制前列腺癌細胞的增殖。為了探討體內(nèi)MEG3水平上調(diào)是否能抑制腫瘤的形成，將穩(wěn)轉質(zhì)粒pCDNA MEG3和空載的PC3細胞分別皮下注射到裸鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)MEG3組裸鼠腫瘤體積和體重均偏小。與免疫印跡結果相似，免疫組化分析顯示Bax上調(diào)，Cyclin D1和Bcl-2下調(diào)，且pCDNA MEG3組中caspase3活性增強。這些結果提示上調(diào)MEG3的表達能顯著抑制體內(nèi)前列腺癌細胞的生長，并延緩腫瘤的生長進程。他們的研究提出MEG3在前列腺癌的分子病因學中發(fā)揮著重要作用，這表明MEG3在前列腺癌治療中有著潛在的作用[31]。

3 小結

已有研究表明，MEG3是一個重要的抑癌基因，其在大多數(shù)腫瘤中表達下調(diào)，并與整體預后相關。其主要機制包括：①染色體14q32是一個腫瘤抑制基因位點，其等位基因的丟失與實體瘤和血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)病有關，而MEG3位于14q32位點；②在多種正常組織中表達，但在惡性腫瘤組織中低表達或表達缺失；③CpG甲基化導致MEG3表達沉默；④MEG3表達與腫瘤生長抑制相關；⑤MEG3與p53/MDM2的相互調(diào)節(jié)維持著細胞增殖。父系和母系表達基因DLK1/MEG3保持著動態(tài)平衡，而在實體瘤和血液系統(tǒng)惡性腫瘤中，這種平衡遭到破壞。此外，MEG3可能與MAPK信號通路相互作用從而抑制細胞增殖。

總之，lncRNA MEG3是一種極具應用前景的抑癌基因，但其在細胞生物學中的重要性以及其在腫瘤發(fā)生過程中的作用途徑仍有待進一步研究。