CRP、葉酸代謝能力基因檢測(cè)與妊娠期糖尿病的相關(guān)性研究

劉曉敏，崔妙平，姚瓊，鐘賽鳳

邵陽(yáng)市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南 邵陽(yáng) 422000

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)是妊娠前糖代謝正常，妊娠期才出現(xiàn)的糖尿病，妊娠合并糖尿病孕婦中90%以上為GDM，對(duì)母兒危害較大[1]。目前已成為全國(guó)婦幼衛(wèi)生系統(tǒng)的一個(gè)沉重負(fù)擔(dān)，該病是在妊娠期首次發(fā)生和發(fā)現(xiàn)的糖尿病或出現(xiàn)的糖耐量受損、代謝紊亂，給母胎帶來(lái)諸多不良影響，并增加了母胎死亡率，對(duì)母胎遠(yuǎn)期影響大，有GDM病史的女性患糖尿病和心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)更高[2]。FIGO明確指出，目前在孕前、孕期及產(chǎn)后GDM的預(yù)防、診斷和管理，以及母兒近遠(yuǎn)期結(jié)局方面，還存在很大不足[3]，諸多學(xué)者從探索GDM的發(fā)病機(jī)制出發(fā)，以達(dá)到防治和管理GDM的目的。已有研究[4-5]認(rèn)為同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)在GDM的發(fā)病機(jī)制中起了重要作用，其機(jī)理主要為人體內(nèi)調(diào)控MTHFR、MTRR的基因發(fā)生變異，從而造成葉酸代謝與利用能力不足增加Hcy的濃度，此外有研究[6]已報(bào)道與炎癥反應(yīng)也有關(guān)，而關(guān)于炎癥因子在葉酸代謝能力障礙中是否發(fā)揮關(guān)鍵作用，此類國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)尚無(wú)報(bào)道，因此本研究擬檢測(cè)分析GDM患者葉酸代謝能力障礙與超敏C反應(yīng)蛋白(hypersensitive C-reactive protein,hs-CRP)之間的關(guān)系，為探明妊娠期糖尿病的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象選擇2018年于邵陽(yáng)市中心醫(yī)院接受產(chǎn)檢行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(oral glucose tolerance test,OGTT)試驗(yàn)及葉酸代謝能力基因檢測(cè)的孕婦，被確診為GDM的患者50例，孕24～28周，年齡(29.68±3.50)歲，排除妊娠前糖尿病、高血壓、肝腎疾病等病史。選擇同期在我院產(chǎn)檢時(shí)行OGTT試驗(yàn)及葉酸代謝能力基因檢測(cè)的正常孕婦50例作為觀察組，孕24～28周，年齡(28.75±2.09)歲。GDM診斷參照國(guó)際糖尿病與妊娠關(guān)系研究協(xié)會(huì)2011年發(fā)布的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)：空腹血糖≥5.1mmol/L，服用75g葡萄糖后1h血糖≥10.0mmol/L，2h血糖≥8.5 mmol/L，符合任意一項(xiàng)即診斷為GDM。

1.2 檢測(cè)方法

(1)基因檢測(cè)：采用PCR+SNE(單堿基延伸法)檢測(cè)各基因所列位，試劑購(gòu)自蘇州曠遠(yuǎn)生物分子技術(shù)有限公司，儀器購(gòu)自Life Technologies Holdings Pte Ltd公司。

(2)血糖檢測(cè)：受試對(duì)象禁食12h后次晨空腹采集靜脈血2mL用于檢測(cè)空腹血糖；服用75g葡萄糖后，分別于1h、2h采集靜脈血檢測(cè)血糖水平；所有檢測(cè)在抽血后1h內(nèi)完成。檢測(cè)儀器采用美國(guó)AU5800全自動(dòng)生化分析儀。血糖檢測(cè)采用己糖激酶法，試劑購(gòu)自湖南圣湘生物科技有限公司。

(3)CRP檢測(cè)：樣本均采用含促凝劑分離膠真空采血管采集股靜脈血4mL(排除溶血標(biāo)本)，所有標(biāo)本在采血后即刻以3000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10min，分離血清。使用進(jìn)行檢測(cè)，采用速率散射比濁法測(cè)定CRP水平。檢測(cè)儀器采用德國(guó)BN-II全自動(dòng)特種蛋白分析儀。CRP試劑購(gòu)自德國(guó)西門子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品有限公司。

1.3 基因結(jié)果判定根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，判斷葉酸代謝障礙風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)：①未發(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)組：3個(gè)位點(diǎn)均無(wú)突變，或MTHFR基因C677T或僅MTHFR基因A1298C；②低度風(fēng)險(xiǎn)：MTHFR基因C677T和A1298C，或僅MTHFR基因T677T或僅MTHFR基因C1298C或僅MTRR基因A66G；③中度風(fēng)險(xiǎn)：MTRR基因A66G伴MTHFR基因T677T或C1298C或僅MTRR基因G66G；④高度風(fēng)險(xiǎn)：MTRR基因G66G伴MTHFR基因T677T或C1298C。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以()表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組獨(dú)立樣本運(yùn)用采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析方法；計(jì)數(shù)資料組間比較采用Wilcoxon秩檢驗(yàn)。P＜0.05為比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GDM組與正常組中CRP的比較GDM組、對(duì)照組CRP水平分別為(17.82±1.69)、(6.15±1.34)μmol/L，GDM組CRP水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 GDM組與正常組中葉酸代謝障礙風(fēng)險(xiǎn)比較50例正常組中葉酸代謝障礙未發(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)組32例，葉酸代謝障礙低度風(fēng)險(xiǎn)組14例，葉酸代謝障礙中度風(fēng)險(xiǎn)組3例，葉酸代謝障礙高度風(fēng)險(xiǎn)組1例，50例GDM患者中葉酸代謝障礙未發(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)組20例，葉酸代謝障礙低度風(fēng)險(xiǎn)組22例，葉酸代謝障礙中度風(fēng)險(xiǎn)組5例，葉酸代謝障礙高度風(fēng)險(xiǎn)組3例。結(jié)果表明正常孕婦與GDM患者比較，GDM更容易出現(xiàn)葉酸代謝障礙，經(jīng)Wilcoxon秩檢驗(yàn)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 不同葉酸代謝能力GDM患者CRP水平的比較將50例GDM患者按照葉酸代謝能力不同，分為4組，分別為：未發(fā)現(xiàn)葉酸代謝障礙風(fēng)險(xiǎn)組、葉酸代謝障礙低度風(fēng)險(xiǎn)組、葉酸代謝障礙中度風(fēng)險(xiǎn)組、葉酸代謝障礙高度風(fēng)險(xiǎn)組，對(duì)各組中CRP水平進(jìn)行比較，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，結(jié)果顯示各組CRP水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，提示GDM患者中，各葉酸代謝能力障礙不同風(fēng)險(xiǎn)組中CRP水平無(wú)差別。

3 討論

3.1 CRP與GDM相關(guān)性妊娠期糖尿病的發(fā)病機(jī)制與胰島素抵抗密切相關(guān)，而體內(nèi)的炎癥刺激因在胰島素抵抗過(guò)程中發(fā)揮重要作用，CRP是機(jī)體組織受到損傷刺激時(shí)，肝細(xì)胞合成的一種急性炎癥因子，當(dāng)機(jī)體胰島素抵抗增加，妊娠期糖尿病患者胰島素分泌不能隨之增加，使得CRP合成增強(qiáng)，慢性低度炎癥與大多數(shù)公認(rèn)的GDM危險(xiǎn)因素有關(guān)，炎性細(xì)胞因子可作為GDM疾病的篩查和診斷標(biāo)記物[7]。GDM患者同時(shí)補(bǔ)充鎂鋅鈣維生素D6周可以降低炎癥和氧化應(yīng)激的生物標(biāo)志物[8]。CRP引發(fā)GDM的具體發(fā)病機(jī)制有待進(jìn)一步研究，近來(lái)，腸道菌群與GDM的相互關(guān)系被廣泛關(guān)注，也有研究表明CRP在妊娠期糖尿病發(fā)病機(jī)制中，是因?yàn)槟c上皮細(xì)胞表達(dá)微生物相關(guān)分子模式受體(microbe-associated molecular pattern,MAMP)中主要成分Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR)介導(dǎo)蛋白炎癥反應(yīng)[9]，因此，在臨床上加強(qiáng)對(duì)CRP的動(dòng)態(tài)觀察，可一定程度上及時(shí)了解妊娠期糖代謝的早期變化，對(duì)病情的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸有一定的預(yù)測(cè)作用，國(guó)內(nèi)大部分研究報(bào)道GDM與CRP有關(guān)，蔣惠玲[10]認(rèn)為妊娠期糖尿病患者體內(nèi)存在著高水平的炎癥因子[白介素-6(interleukin 6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)]，朱慶霞[11]認(rèn)為GDM患者血清CRP水平高于正常人；觀察組血清CRP水平均高于對(duì)照組，HOMAIR低于對(duì)照組，血清CRP水平與TG呈正相關(guān)。提示GDM患者血清CRP水平升高。本研究資料表明：CRP在GDM組中的水平高于正常組，這說(shuō)明CRP在GDM發(fā)病機(jī)制中起到重要作用。與之相反，有研究[12]證明GDM組與正常孕婦組中CRP水平無(wú)明顯差異，CRP在妊娠期糖尿病的發(fā)病機(jī)制中受到其他因素的影響，如瘦素等相關(guān)基因、年齡、飲食、運(yùn)動(dòng)、抵抗力、其他炎癥介導(dǎo)因子等。因此，對(duì)CRP在GDM發(fā)病機(jī)制中是否發(fā)揮作用，目前研究結(jié)果尚不一致，有待進(jìn)一步探討CRP在GDM中的發(fā)病機(jī)制。

3.2 葉酸代謝能力障礙與GDM相關(guān)性孕期貧血、胎兒先天發(fā)育畸形等諸多妊娠并發(fā)癥與葉酸缺乏有關(guān)，葉酸代謝能力基因異常導(dǎo)致的葉酸代謝障礙尚未引起足夠重視，這是葉酸缺乏的重要原因，因此，從調(diào)節(jié)葉酸代謝基因角度尋找葉酸缺乏原因尤為重要。調(diào)節(jié)葉酸代謝的基因主要有MTRR與MTHFR，當(dāng)這兩種基因發(fā)生變異可能導(dǎo)致相應(yīng)酶活性降低或喪失，從而導(dǎo)致葉酸代謝與利用能力不足，使葉酸代謝障礙，并增加同型半胱氨酸(Hcy)濃度進(jìn)而引起相關(guān)并發(fā)癥，Hcy是一種含硫氨基酸，在體內(nèi)由蛋氨酸脫甲基代謝后生成，Hcy與胰島素抵抗相互影響在GDM發(fā)病機(jī)制中起到重要作用，且高Hcy與不良妊娠結(jié)局有相關(guān)性[13]，MTRR能催化甲鈷胺的再生，是甲硫氨酸合成酶(methionine synthetas,MTR)的輔助因子，對(duì)維持MTR活性至關(guān)重要。MTRR基因位于染色體5p15.2～15.3，包括15個(gè)外顯子，最常見(jiàn)的突變位點(diǎn)為A66G，該突變導(dǎo)致MTRR異亮氨酸被甲硫氨酸替代。編碼MTHFR的基因位于染色體1p36.3，包含11個(gè)外顯子，C667T和A1298C是該基因兩個(gè)最常見(jiàn)也是研究最多的突變位點(diǎn)。本研究通過(guò)檢測(cè)MTRR(A66G)、MTHFR(C677T)、MTHFR(A1298C)這三種基因型，進(jìn)一步從基因突變角度驗(yàn)證調(diào)節(jié)葉酸代謝能力基因突變?cè)贕DM的發(fā)病機(jī)制的影響，結(jié)果表明GDM組與正常組人群相比，葉酸代謝障礙高風(fēng)險(xiǎn)人數(shù)較正常組多(P＜0.05)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與管會(huì)苓、于天龍研究[14]一致，其研究表明MTHFR基因C677T位點(diǎn)基因型差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且有研究[15]發(fā)現(xiàn)GDM患者與正常妊娠者C677T基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)因調(diào)控葉酸代謝基因突變?cè)贕DM中重要作用，已有學(xué)者[16]表明可通過(guò)補(bǔ)充葉酸降低妊娠期糖尿病的發(fā)病率。

3.3 不同葉酸代謝能力GDM患者中CRP水平的比較國(guó)內(nèi)外研究對(duì)調(diào)節(jié)葉酸代謝能力基因突變與GDM的關(guān)系報(bào)道比較少，且結(jié)果有爭(zhēng)議，本研究已表明GDM與葉酸代謝能力障礙有關(guān)，提示調(diào)節(jié)葉酸代謝能力基因突變與GDM的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，這與國(guó)外Khan IA等[17]不一致，其研究認(rèn)為GDM組與非GDM組C677T多態(tài)性等位基因和基因型頻率無(wú)顯著差異(P=0.8892)。國(guó)內(nèi)張艷華等[18]也認(rèn)為MTHFR(A1298C)可能不是妊娠糖尿病發(fā)生的易感因素之一。葉酸代謝能力基因突變對(duì)GDM發(fā)病機(jī)制的作用，可能受到其他遺傳基因的影響，如國(guó)外有研究[2]表明，TCF7L2 rs7903146變異增加GDM患病風(fēng)險(xiǎn)。MTNR1B變異與GDM易感性顯著相關(guān)。另外可能受到機(jī)體炎癥介導(dǎo)因子、及外界因素影響，如孕婦周圍環(huán)境、飲食習(xí)慣、運(yùn)動(dòng)有關(guān)，因此，本研究進(jìn)一步探討葉酸代謝調(diào)節(jié)基因突變是否與GDM患者機(jī)體CRP水平有關(guān)，有助于補(bǔ)充GDM患者基因突變學(xué)說(shuō)，本研究將葉酸代謝障礙未發(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)、低度風(fēng)險(xiǎn)、中度風(fēng)險(xiǎn)、高度風(fēng)險(xiǎn)組中CRP的水平進(jìn)行比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，據(jù)此可推測(cè)CRP與葉酸代謝基因突變關(guān)聯(lián)不大，葉酸代謝基因突變對(duì)GDM發(fā)病機(jī)制的影響可能受到其他多種因素的綜合影響，有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

GDM患者中CRP水平高于正常孕婦，葉酸代謝能力障礙風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別與GDM患病機(jī)制相關(guān)，葉酸代謝能力障礙在GDM的發(fā)病機(jī)制中與CRP水平無(wú)明顯相關(guān)性，本研究結(jié)果表明CRP、葉酸代謝能力障礙在GDM發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要作用，并對(duì)CRP與調(diào)節(jié)葉酸代謝基因突變之間是否相關(guān)作了初步研究，葉酸代謝能力障礙對(duì)GDM的發(fā)病機(jī)制中可能受到機(jī)體內(nèi)外因素的影響，包括其他炎癥介導(dǎo)因子、血液流動(dòng)學(xué)、其他遺傳基因突變、環(huán)境因素、飲食結(jié)構(gòu)、生活方式等多因素的影響，這對(duì)GDM遺傳基因突變病因?qū)W說(shuō)提供了較新的見(jiàn)解，并可能有助于識(shí)別新的GDM診斷或治療方向，在一定程度上為GDM的早期識(shí)別、防治提供一定的理論依據(jù)。