孟魯司特鈉聯(lián)合維生素D 治療嬰幼兒喘息的療效及對肺功能和細(xì)胞因子的影響

馮日昇 郭燕軍

鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院（鄭州450000）

兒童喘息是常見的呼吸系統(tǒng)疾病，超過80%的哮喘起始于嬰幼兒。肺功能檢測是呼吸道疾病診斷和鑒別的重要方法，歐洲呼吸協(xié)會肺功能標(biāo)準(zhǔn)（ERS）和美國胸科協(xié)會肺功能標(biāo)準(zhǔn)（ATS）都推薦潮氣呼吸環(huán)分析作為嬰幼兒肺功能測試的主要內(nèi)容。在喘息發(fā)病過程中白三烯是一種重要的促炎因子，且有強(qiáng)效的致支氣管收縮作用［1］。孟魯司特鈉是白三烯受體拮抗劑，對喘息急性期發(fā)作、緩解癥狀起到治療作用［2］；近年來還發(fā)現(xiàn)，維生素D 與哮喘有高度相關(guān)性，對哮喘患兒服用適量的維生素D 能夠明顯改善哮喘癥狀。國內(nèi)外關(guān)于上述兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用治療喘息患兒的文獻(xiàn)報道較多［3］，但大多僅從有效性與安全性展開研究。本研究在此基礎(chǔ)上通過對喘息嬰幼兒進(jìn)行潮氣肺功能檢測，并比較孟魯司特鈉聯(lián)合維生素D 治療前后嬰幼兒肺功能、炎癥因子和免疫功能變化，以期探討嬰幼兒喘息與哮喘之間的關(guān)系，并做到對嬰幼兒哮喘的早期診斷、合理治療，提高嬰幼兒的健康水平。

1 對象與方法

1.1 研究對象選擇2016年1月至2018年6月于本院呼吸科住院治療的確診為嬰幼兒喘息的患兒640 例為研究對象，其診斷標(biāo)準(zhǔn)均符合嬰幼兒喘息標(biāo)準(zhǔn)［4］。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡＜3 歲；未接受ICS、孟魯司特鈉治療；反復(fù)喘息病史≥3 次。排除標(biāo)準(zhǔn)：1 周內(nèi)因喘息急救患兒；3 周內(nèi)發(fā)生過急性上呼吸道感染。本研究獲得本院倫理委員會同意且嬰幼兒監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。分組：（1）在640 例研究對象中有420 例喘息患兒進(jìn)行了喘息發(fā)作期和緩解期2 次潮氣肺功能檢查，將此420 例作為研究組。其中男270 例，女150 例，平均年齡（14.8 ± 5.2）個月，最小3 個月，最大2 歲7 個月。（2）將同期住院中無哮喘病史、家族哮喘病史、胸廓畸形、濕疹史的急性下呼吸道感染者作為對照組，共180 例，男108 例，女72 例，平均年齡（11.9 ± 5.2）個月。孟魯司特鈉治療：將160 例喘息嬰幼兒分為治療組和對照組。其中對照組給予孟魯司特鈉咀嚼片4 mg/d，每晚頓服；治療組在對照組基礎(chǔ)上口服維生素D 0.25 μg/d，時間均為12 周；治療組80 例，男50例，女30 例，平均年齡（12.8 ± 4.2）個月，最小5 個月，最大3 歲1 個月；對照組80 例，男52 例，女28例，平均年齡（11.6±3.5）個月，最小4 個月，最大3歲2 個月。

1.2 藥物、試劑及設(shè)備藥物和試劑：口服孟魯司特鈉咀嚼片（順爾寧，默沙東公司，規(guī)格4mg/片）；維生素D（α 骨化醇膠囊，昆明貝諾頓制藥有限公司）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒、ECL 顯色試劑盒（Thermo 公司）；PrimeScript RTMaster Mix Perfect Real Time 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR 熒光定量試劑盒（Takara 公司）設(shè)備：空氣壓縮泵（德國百瑞公司Pari，氣體流量6～8 L/min）霧化吸入給藥。德國Jaeger 公司生產(chǎn)的Master Screen 肺功能儀（分辨率＞0.1 mL，流速敏感度＞0.5 mL，死腔容量2 mL）進(jìn)行檢測。

1.3 方法潮氣肺功能檢測方法：640 例喘息患兒在未治療前發(fā)作期均進(jìn)行潮氣肺功能檢測，對其中420 例喘息患兒在緩解后（平均時間為7～10 d）又進(jìn)行肺功能檢測。檢測前校正環(huán)境溫度、濕度及容量，清理嬰幼兒呼吸道分泌物。嬰幼兒自然深睡眠或口服10%水合氯醛（0.5 mL/kg）藥物催眠后，取仰臥位，將面罩罩嚴(yán)在嬰幼兒口鼻上，通過流速傳感器測定潮氣呼吸各參數(shù)。所有受試者檢測時均采用相同體位，每次記錄15～20 次潮氣呼吸，每人連續(xù)進(jìn)行5 次測試，最后由電腦自動計(jì)錄潮氣呼吸肺功能各項(xiàng)參數(shù)并計(jì)算其平均值。孟魯司特鈉治療方法：對入院后160 例喘息緩解期嬰幼兒進(jìn)行分組，其中對照組80 例，給予孟魯司特鈉咀嚼片（順爾寧，默沙東公司，規(guī)格4 mg/片），4 mg/d，每晚頓服；治療組80 例在對照組基礎(chǔ)上口服維生素D（α骨化醇膠囊，昆明貝諾頓制藥有限公司），0.25 μg/d。治療組和對照組治療4、12 周后，對臨床癥狀進(jìn)行評分（評分標(biāo)準(zhǔn)參考［5］），以及進(jìn)行潮氣呼吸肺功能檢測。而臨床療效判定標(biāo)準(zhǔn)如下［6］：治療時間為7 d，如果肺部體征和臨床癥狀明顯改善，則為顯效。如體征有所改善，則為有效，如體征未見改善甚至加重癥狀，則為無效。

1.4 標(biāo)本采集空腹采集對照組、治療組患兒靜脈血5 mL，EDTA 抗凝，提取外周血單個核細(xì)胞（PBMC）采用Ficoll 密度梯度離心法，分離出的PBMC 放置于冰箱內(nèi)待用。

1.5 觀察指標(biāo)（1）嬰幼兒潮氣呼吸肺功能檢測：吸呼比（Ti/Te）、每公斤潮氣量（VT）、呼吸頻率（RR）、達(dá)峰時間比（TPTEF/TE）、達(dá)峰容積比（VPEF/VE）；（2）孟魯司特鈉聯(lián)合維生素D 治療后臨床癥狀評分；（3）P13K、NF-κB 和STAT1 在PBMC中mRNA 和蛋白變化；（4）治療前后25-羥維生素D3、IgA 和血清堿性磷酸酶水平。

1.6 血清ALP、25-（OH）D3、IgA 測試方法取外周靜脈血于采血管中，離心，提取上清液，加入內(nèi)標(biāo)及沉淀劑后檢測。

1.7 RT-qPCR 檢測P13K、NF-κB 和STAT1 的mRNA 表達(dá)提取PBMC 中的總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，反應(yīng)條件如下：預(yù)變性95 ℃1 min，95 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，60 ℃延伸30 s，共循環(huán)40 次。實(shí)時熒光使用ABI PRISM 7500 Sequence Detector 檢測。引物由武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成，P13K 上游引物序列：5'- CAGCAGGCCCACGGACCAT-3'，下游引物：5'-GTCCCTTGTCTCTC CCTG-3'。NF-κB 上游引物序列：5'-GCGAGGGCCCACGGATACC -3'，下游引物：5'-GGG GTTT GTCTCTCTGGA-3'。STAT1上游引物序列：5'-TCCGAGGCCCACGGACCAT-3'，下游引物：5'-CCAGTTTAGGCGTCTCTCAAAG-3'。β-actin 蛋白為內(nèi)參，上游引物：5'-GGATCCCT CCAGAGCGAAAAT-3'，下游引物：5'-GTCATACTTCTGCTGTTGCATGG-3'。用系統(tǒng)軟件進(jìn)行結(jié)果分析：樣品的相對表達(dá)用2-ΔΔCt表示。

1.8 免疫印跡檢測P13K、NF-κB 和STAT1 的蛋白表達(dá)提取PBMC 中的總蛋白，用BCA 試劑盒檢測總蛋白濃度。然后上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，放入含5%脫脂奶粉的TBST 進(jìn)行封閉，37 ℃保溫箱90min；在裝有一抗封閉液的雜交袋中過夜，采用TBST 液洗膜5 次，每次8 min；加二抗封閉液封閉PVDF 膜，37 ℃孵育2 h 后曝光，觀察結(jié)果。采用Lab Works 4.5 分析系統(tǒng)軟件（美國UVP 公司）對Western 條帶進(jìn)行定量分析，結(jié)果目的蛋白的相對表達(dá)水平=目的蛋白條帶/內(nèi)參GAPDH 條帶的OD比值表示。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 16.0 軟件數(shù)據(jù)處理，所用數(shù)據(jù)均采用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)、q檢驗(yàn)。采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療前嬰幼兒潮氣呼吸肺功能檢測嬰幼兒喘息發(fā)作期的RR 比對照組明顯加快，而發(fā)作期VT/kg、TPTEF/TE 和VPEF/VE 也低于對照組，差異均有顯著性（P＜0.05）；嬰幼兒緩解期與發(fā)作期相比RR 下降，VT/kg、TPTEF/TE 和VPEF/VE 明顯上升，差異均有顯著性（P＜0.05）；嬰幼兒緩解期的VT/kg與對照組相比較，差異無顯著性（P＜0.05）。見表1。

表1 治療前喘息發(fā)作期、緩解期與對照組肺功能指標(biāo)比較Tab.1 Comparison of pulmonary function indexes between the pant onset period，remission stage and the control group before treatment ±s

表1 治療前喘息發(fā)作期、緩解期與對照組肺功能指標(biāo)比較Tab.1 Comparison of pulmonary function indexes between the pant onset period，remission stage and the control group before treatment ±s

注：與對照組比較，*P＜0.05；緩解期與對照組比，#P＜0.05

檢測指標(biāo)發(fā)作期（1）緩解期（2）對照組（3）F值Q（1）：（3）（1）：（2）（2）：（3）例數(shù)640 420 180 RR（次/min）43.5±9.2*36.6±8.9*31.7±12.1 16.722 20.21 11.25 8.62 Ti/Te（%）60.4±2.8*68.7±4.7*77.2±7.3 13.224 25.34 13.33 10.26 VT/kg（mL/kg）6.1±1.5*7.1±1.3#8.1±1.9 8.261 3.64 1.78 1.78 TPTEF/Te（%）18.1±3.5*19.8±3.2*38.2±3.3 15.774 19.02 7.11 11.02 VPEF/Ve（%）20.7±3.4*22.9±2.5*36.6±3.9 10.225 11.21 3.57 7.01

2.2 孟魯司特鈉聯(lián)合維生素D 治療后組間患兒臨床療效比較本研究療效結(jié)果如表2 所示，其中治療組治療總有效率為91.3%，對照組為75%，試驗(yàn)組與對照組（χ2= 10.11）相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 孟魯司特鈉聯(lián)合維生素D 治療前后療效對比Tab.2 Comparison of the efficacy of montelukast sodium combined with vitamin D after treatment

2.3 孟魯司特鈉聯(lián)合維生素D 治療后臨床癥狀評分孟魯司特鈉聯(lián)合維生素D 治療4、12 周后嬰幼兒活動后咳嗽/喘息、喘息、咳嗽與基礎(chǔ)值比較，兩者差異均有顯著性（P＜0.05），見表3。

2.4 兩組患兒治療前后ALP、25-（OH）D3、IgA 水平比較與對照組及治療前相比，治療組患兒治療后ALP、25-（OH）D3、IgA 水平明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

2.5 P13K、NF-κB 和STAT1 在PBMC 中mRNA檢測結(jié)果治療組的P13K、NF-κB 和STAT1 的mRNA 相對表達(dá)量分別為（0.65 ± 0.22）、（1.3 ±0.4）和（1.2 ± 0.32）均低于對照組（3.01 ± 1.12）、（2.7 ± 0.8）和（3.2 ± 0.75），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

表3 治療組4、12 周后臨床癥狀情況Tab.3 Clinical symptoms after 4 weeks and 12 weeks in the treatment group ±s

表3 治療組4、12 周后臨床癥狀情況Tab.3 Clinical symptoms after 4 weeks and 12 weeks in the treatment group ±s

癥狀評分活動后咳嗽/喘息喘息咳嗽基礎(chǔ)值1.71±0.41 1.78±0.75 1.62±0.69 4 周后1.19±0.35 1.30±0.62 1.12±0.59 t/H 7.486 8 7.003 2 6.891 2 P 值＜0.05＜0.05＜0.05 12 周后0.71±0.16 0.96±0.56 0.84±0.69 t/H 8.6131 9.1326 9.2841 P 值＜0.05＜0.05＜0.05

表4 兩組患兒治療前后ALP、25-（OH）D3、IgA 水平比較Tab.4 Comparison of ALP，25-（OH）D3 and IgA levels between the two groups before and after treatment n=80

圖1 RT-qPCR 檢測P13K、NF-κB 和STAT1 mRNA 結(jié)果與對照組比較，*P ＜0.05Fig.1 The results of P13K，NF-κB and STAT1 mRNA detected by RT-qPCR Compared with the control group，*P ＜0.05

2.6 P13K、NF-κB 和STAT1 在PBMC 中蛋白免疫印跡（Western blot）檢測結(jié)果P13K、NF-κB 和STAT1 蛋白在治療組中的相對表達(dá)強(qiáng)度分別為（0.35 ± 0.12）、（0.28 ± 0.04）和（0.37 ± 0.05），明顯低于在對照組中的相對表達(dá)強(qiáng)度（0.55 ± 0.04）、（0.42±0.05）和（0.44±0.03），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.32，P＜0.05）、（t=2.47，P＜0.05）、（t=6.24，P＜0.05）,見圖2。

2.7 孟魯司特鈉聯(lián)合維生素D 治療喘息嬰幼兒應(yīng)用效果評價治療12 周后，治療組與對照組的PTEF、TPTEF/TE、VPEF/VE 均明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表5。

3 討論

圖2 P13K、NF-κB 和STAT1 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測結(jié)果Fig.2 Results of P13K，NF-κB and STAT1 by Western blot detection

表5 治療組和對照組治療前后潮氣肺功能檢測變化Tab.5 Changes of tidal and pulmonary function in treatment group and control group before and after treatment ±s

表5 治療組和對照組治療前后潮氣肺功能檢測變化Tab.5 Changes of tidal and pulmonary function in treatment group and control group before and after treatment ±s

注：治療組治療前后，*P ＜0.05，對照組觀察前后，#P ＜0.05

PTEF（mL/s）VT/kg（mL/kg）TPTEF/TE VPEF/VE治療組治療前94.5±30.1*6.5±1.4 0.17±0.05*0.21±0.07*治療后121.3±29.4*8.0±1.1 0.30±0.11*0.31±0.10*對照組治療前94.4±25.3#7.1±2.2 0.18±0.07#0.20±0.08#治療后110.1±31.2#7.5±3.6 0.26±0.08#0.28±0.06#

由于兒童呼吸道解剖、生理和免疫方面與成年人區(qū)別較大，因此臨床診斷嬰幼兒哮喘比較困難，目前還沒有完善的診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］。而潮氣肺功能檢測能反映兒童發(fā)病時的肺功能情況，并且是一種無需特殊配合且在平靜呼吸狀態(tài)下進(jìn)行，因此很適合嬰幼兒，可用于評價小兒哮喘發(fā)作和支氣管肺炎時肺功能情況。目前研究表明，潮氣呼吸流速-容量環(huán)（TBFV）顯示流速隨容量的變化，可直接反映出肺功能是否正常，是否存在著阻塞和（或）限制性病變［8］。其中小氣道阻塞程度可以通過VPEF/Ve、TPTEF/Te 兩個重要指標(biāo)反映［9］，阻塞越重，比值越低。這又以TPTEF/Te 最為重要［10-11］。本研究對反復(fù)喘息嬰幼兒發(fā)作期和緩解期進(jìn)行潮氣肺功能檢測，從表1 結(jié)果來看，發(fā)作期、緩解期的VT、TPTEF/TE、VPEF/VE 與對照組相比明顯下降（P＜0.05），發(fā)作期下降最多，這說明VT、TPTEF/TE、VPEF/VE 的減低與氣道炎癥嚴(yán)重程度可能相關(guān)；通過表2 顯示，治療組嬰幼兒臨床療效高于對照組（P＜0.05），而治療后4、12 周時，臨床癥狀如表3 結(jié)果：治療組的咳嗽/喘息、喘息、咳嗽與基礎(chǔ)值相比較顯著下降（P＜0.05）。同時，治療組患兒治療后ALP、25-（OH）D3、IgA 水平較對照組及治療前明顯上升（P＜0.05）；而表5 顯示，治療組與對照組的PTEF（mL/s）、TPTEF/TE、VPEF/VE 均明顯提高（P＜0.05），但治療組改善幅度比對照組更大，這說明孟魯司特鈉聯(lián)合維生素D 對嬰幼兒喘息能更有效降低其氣道炎癥，緩解喘息癥狀。文獻(xiàn)報道P13K/AKT信號通路在氣道重塑和支氣管平滑肌增殖中起著重要作用［12］，在T 細(xì)胞受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中CD28 和T 細(xì)胞能誘導(dǎo)共刺激分子產(chǎn)生，通過P13K 激活A(yù)KT，調(diào)節(jié)Th 細(xì)胞分化，使NFκB、IL-4 等升高，產(chǎn)生哮喘。研究證實(shí)NF-κB 能夠與相關(guān)基因特異性結(jié)合，參與生長因子、趨化因子、炎性因子等表達(dá)調(diào)控，且在受到外界刺激后NF-κB可能過度表達(dá)或抑制，促進(jìn)過敏性哮喘、過敏性鼻炎等炎癥疾病發(fā)生［13］。文獻(xiàn)還報道［18］哮喘患者呼吸道上皮細(xì)胞中STAT1 存在異?；罨瓦^度表達(dá)現(xiàn)象，增加ICAM1 表達(dá)，促進(jìn)NO 合成，加重哮喘炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中，對照組P13K、NF-κB 和STAT1 mRNA 和蛋白的表達(dá)水平與治療組相比明顯升高，這說明哮喘患兒P13K、NF-κB、STAT1 信號通路被激活，參與了哮喘的發(fā)生、發(fā)展。

近年來研究證實(shí)，免疫系統(tǒng)功能失調(diào)可能會導(dǎo)致嬰幼兒喘息性疾病的發(fā)生。一般認(rèn)為維生素D 具有免疫修復(fù)和調(diào)節(jié)鈣磷代謝的功效，可通過其活性形式與氣道特異性受體結(jié)合，增強(qiáng)抗菌肽hCAP-18 表達(dá)水平［14］，對氣道的炎癥反應(yīng)能夠有效緩解，同時降低氣道損傷，最終降低喘息發(fā)生幾率。而孟魯司特鈉是新一代白三烯受體拮抗劑，可作用于呼吸道炎癥因子，競爭性拮抗白三烯D4，同時還可以減少炎癥細(xì)胞浸潤，降低呼吸道高反應(yīng)性，改善肺功能［15-16］。研究選擇孟魯司特鈉聯(lián)合維生素D 作為治療措施，在治療組4、12 周時嬰幼兒咳嗽、喘息、活動后咳嗽/喘息、潮氣肺功能等指標(biāo)與基礎(chǔ)值相比差異有顯著性（P＜0.05），這說明孟魯司特鈉聯(lián)合維生素D 療效明確，有助于減輕喘息、咳嗽及肺部哮鳴音等癥狀，能夠用于治療肺外組織的炎性病變。

綜上所述，孟魯司特鈉和維生素D 聯(lián)合應(yīng)用能夠有效緩解嬰幼兒喘息的臨床癥狀，改善肺功能和實(shí)驗(yàn)室檢測指標(biāo)，值得臨床推廣使用；同時觀察出STAT1、NF-κB 和P13K 參與了哮喘的病理過程，阻斷上述因子的表達(dá)則可能阻止哮喘的發(fā)生、發(fā)展，這為哮喘的治療和研究提供了新的思路。