基于高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于孕期無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查人群的結(jié)果分析

余宏盛 胡晞江

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院（武漢市婦幼保健院）優(yōu)生遺傳科（武漢430016）

無(wú)創(chuàng)DNA 產(chǎn)前檢測(cè)（non-invasive prenatal test- ing，NIPT）通過采集孕婦外周血來(lái)提取DNA 并結(jié)合生物信息學(xué)的分析應(yīng)用于胎兒染色體非整倍體的篩查已有了較長(zhǎng)的時(shí)間歷程［1］，早期多應(yīng)用PCR 技術(shù)檢測(cè)孕婦外周血胎兒游離DNA 的含量，檢測(cè)能力有限，近年來(lái)發(fā)展較為迅速的高通量測(cè)序技術(shù)逐漸應(yīng)用于臨床NIPT［1］，不僅可實(shí)現(xiàn)胎兒3 對(duì)常見（21、18、13）染色體非整倍體的篩查，同時(shí)能對(duì)其他染色體的非整倍體及微缺失/重復(fù)做出判斷［2］，提高了胎兒染色體病的異常檢出率。本文應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)本院的2 256 例孕婦進(jìn)行NIPT 檢測(cè)，并通過產(chǎn)前診斷及對(duì)妊娠結(jié)局進(jìn)行隨訪來(lái)評(píng)判高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于NIPT 的可行性與準(zhǔn)確性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象回顧性分析2016年3月至2017年4月在遺傳與優(yōu)生科就診的并自愿選擇接受NIPT的2 256 例單胎孕婦為研究對(duì)象，孕周為12 ～21周，年齡17 ～48 歲，平均（33.39 ± 5.24）歲。排除惡性腫瘤，中度肥胖（BMI＞40），近期（1年以內(nèi)）進(jìn)行過輸血治療、移植手術(shù)的孕婦。

1.2 研究方法

1.2.1 NIPT 檢測(cè)采集孕婦外周血10 mL，提取游離DNA，標(biāo)本的高通量測(cè)序檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析主要由深圳華大基因有限公司提供。步驟嚴(yán)格按照操作手冊(cè)進(jìn)行。逐步按照（1）外周血DNA 的提??；（2）文庫(kù)構(gòu)建；（3）上機(jī)測(cè)序；（4）數(shù)據(jù)處理與分析完成報(bào)告的生成。

1.2.2 產(chǎn)前診斷染色體檢測(cè)對(duì)17 ～22 孕周的妊娠婦女，在超聲引導(dǎo)下，抽取胎兒羊水30 mL，其中20 mL 作細(xì)胞培養(yǎng)，另10 mL 備用于單核苷酸多態(tài)性微陣列（single nucleotide polymorphism microarray，SNP-array）檢測(cè)，對(duì)有微缺失/重復(fù)的標(biāo)本行SNP-array 檢測(cè)。（1）染色體核型分析：將20 mL 羊水接種于2 個(gè)羊水細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)7～11 d，收獲細(xì)胞，進(jìn)行制片和G顯帶后，在油鏡下計(jì)數(shù)25 個(gè)分裂象，使用Genetix工作站（美國(guó)Genetix 公司產(chǎn)品）進(jìn)行采圖分析5～6 個(gè)核型，進(jìn)行染色體核型診斷，核型分析命名按照《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制》（ISCN2005）進(jìn)行描述；（2）SNP-array 檢測(cè)：采用Affymetrix Cytoscan 750K Array 芯片（美國(guó)Affymetrix 公司產(chǎn)品）檢測(cè)，該芯片包含750 000 個(gè)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)，步驟嚴(yán)格按照操作手冊(cè)進(jìn)行。

1.2.3 跟蹤隨訪NIPT 檢測(cè)陰性標(biāo)本通過電話跟蹤隨訪圍生期及出生后的臨床表現(xiàn)，根據(jù)產(chǎn)前診斷結(jié)果以及隨訪結(jié)果計(jì)算高通量測(cè)序方法應(yīng)用于NIPT 的臨床敏感度、特異度等指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 無(wú)創(chuàng)DNA 篩查結(jié)果2 256 例樣本進(jìn)行無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查中，因樣本DNA 含量不夠需要進(jìn)行重采血或重建庫(kù)者5例。經(jīng)重采血或重建庫(kù)后，均檢測(cè)成功，檢測(cè)成功率100%，一次檢測(cè)成功率為99.77%（2 251/2 256）。2 256 例樣本中，共檢出35 例異常樣本，其中檢出21 三體高風(fēng)險(xiǎn)者13 例，檢出率為0.58%（13/2 256）；18 三體高風(fēng)險(xiǎn)者1 例，檢出率為0.04%（1/2 256）；13 三體高風(fēng)險(xiǎn)者1 例，檢出率為0.04%（1/2 256）；無(wú)創(chuàng)提示性染色體高風(fēng)險(xiǎn)15 例，檢出率為0.67%（15/2 256），其中性染色體數(shù)目偏少9 例，性染色體數(shù)目偏多5 例，性染色體結(jié)構(gòu)高風(fēng)險(xiǎn)1 例；檢出其他染色體高風(fēng)險(xiǎn)5 例，檢出率為0.22%（5/2 256）。分別是14號(hào)染色體重復(fù)，10 號(hào)染色體缺失，6 號(hào)染色體重復(fù)，5 號(hào)染色體缺失以及3 號(hào)染色體存在缺失（表1）。

2.2 產(chǎn)前診斷結(jié)果35 例無(wú)創(chuàng)提示異?；颊咧?，3 例直接引產(chǎn)，其中2 例經(jīng)SNP-array 檢測(cè)均為21三體胎兒，1 例家屬拒絕病檢，經(jīng)隨訪得知胎兒超聲提示胎兒多發(fā)畸形。另32 例孕婦進(jìn)一步行羊水穿刺進(jìn)行細(xì)胞核型和（或）SNP-array 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中10 例為21 三體，1 例18 三體，5 例存在性染色體異常以及1 例3 號(hào)染色體短臂存在缺失，另15 例經(jīng)細(xì)胞核型及SNP-array 檢測(cè)均未發(fā)現(xiàn)異常。

2.3 無(wú)創(chuàng)與產(chǎn)前診斷結(jié)果的符合情況35 例無(wú)創(chuàng)提示異常的樣本中有1 例直接引產(chǎn)并拒絕做進(jìn)一步檢測(cè)，無(wú)創(chuàng)提示21 三體高風(fēng)險(xiǎn)的樣本中有12 例經(jīng)細(xì)胞核型和（或）SNP-array 證實(shí)為21-三體，1 例為假陽(yáng)性，陽(yáng)性符合率為92.85%（12/13）；1 例18 三體高風(fēng)險(xiǎn)與細(xì)胞核型結(jié)果一致，陽(yáng)性符合率為100%；15 例性染色體存在異常中只有5 例經(jīng)細(xì)胞核型或SNP-array 結(jié)果證實(shí)為異常，陽(yáng)性符合率為33.33%（5/15），5 例性染色體異?；颊咧杏? 例是無(wú)創(chuàng)提示性染色體數(shù)目偏多，2 例提示性染色體數(shù)目偏少以及1 例性染色體結(jié)構(gòu)異常的標(biāo)本，性染色體異常的符合率分別為性染色體數(shù)目偏多40%（2/5），性染色體數(shù)目偏少22.22%（2/9），性染色體結(jié)果異常100%（1/1）；另5 例其他染色體提示存在異常的樣本經(jīng)細(xì)胞核型或SNP-array 結(jié)果證實(shí)只有1 例為異常，陽(yáng)性符合率為20%（1/5）。2 221 例無(wú)創(chuàng)提示低風(fēng)險(xiǎn)的孕婦經(jīng)跟蹤隨訪1年均未出現(xiàn)新生兒異常。

2.4 隨訪結(jié)果對(duì)2 221 例無(wú)創(chuàng)低風(fēng)險(xiǎn)孕婦進(jìn)行跟蹤隨訪，截止至2018年6月未發(fā)現(xiàn)已出生的新生兒異常。18 例（含12 例21-三體，1 例18-三體，5 例性染色體異常）常見染色體非整倍體經(jīng)產(chǎn)前診斷證實(shí)為異常的孕婦均知情選擇流產(chǎn)，另1 例無(wú)創(chuàng)提示胎兒3 號(hào)染色體存在缺失經(jīng)SNP-array 檢測(cè)為3 號(hào)染色體3p26.3p26.1 區(qū)段存在7.6 Mb 片段的缺失，內(nèi)含ITPR1（147265）等14 個(gè)OMIM 基因。并追蹤胎兒父母雙方SNP-array 結(jié)果發(fā)現(xiàn)胎兒染色體異常遺傳自母親（表型正常），經(jīng)遺傳咨詢選擇繼續(xù)妊娠。

表1 35 例無(wú)創(chuàng)提示異常孕婦產(chǎn)前診斷結(jié)果Tab.1 Prenatal diagnosis of 35 cases with abnormal results of NIPT

3 討論

隨著我國(guó)“二孩”政策的調(diào)整以及優(yōu)生優(yōu)育知識(shí)的宣傳普及，越來(lái)越多的孕婦開始愿意接受產(chǎn)前篩查與產(chǎn)前診斷。目前我國(guó)多數(shù)機(jī)構(gòu)仍在應(yīng)用傳統(tǒng)血清學(xué)模式篩查胎兒染色體異常［3-4］，盡管傳統(tǒng)的血清學(xué)篩查技術(shù)有多種模式并能在一定程度上降低胎兒出生缺陷率，但仍然存在較高的漏檢率和假陽(yáng)性率［2，5］。自2016年國(guó)家關(guān)于無(wú)創(chuàng)的意見提出后，無(wú)創(chuàng)已開始在多個(gè)省份多家醫(yī)院臨床進(jìn)行推廣，NIPT 因其具有無(wú)創(chuàng)性、靈敏度、特異度高以及孕周檢測(cè)范圍廣等特點(diǎn)被越來(lái)越多的孕婦選擇接受。高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于NIPT 可實(shí)行大規(guī)模、快速等的優(yōu)點(diǎn)［6］。

本文對(duì)2 256例孕婦進(jìn)行無(wú)創(chuàng)篩查，盡管有5例因樣本DNA 含量不夠，未能一次檢測(cè)成功，可能原因?yàn)樵袐D孕周偏小或采血過程中血量不夠，但后期經(jīng)重采血或重建庫(kù)后均能檢出?；诟咄繙y(cè)序的無(wú)創(chuàng)技術(shù)應(yīng)用于2 256 例孕婦檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，無(wú)創(chuàng)DNA 產(chǎn)前檢測(cè)對(duì)常見的染色體非整倍體21-三體、18-三體、13-三體的檢出率分別為0.58%，0.04%和0.04%，與細(xì)胞核型分析技術(shù)檢出的21、18、13 非整倍體的符合率分別為92.85%，100%和100%，出現(xiàn)21-三體假陽(yáng)性可能的原因?yàn)樘ケP嵌合體，本研究對(duì)常見染色體（21、18、13）非整倍體的檢出率以及陽(yáng)性符合率與前期研究結(jié)果相似［7-8］，無(wú)創(chuàng)作為一種血清學(xué)篩查模式應(yīng)用于21、18、13-三體的篩查的準(zhǔn)確性仍然較高。

本文中，無(wú)創(chuàng)提示性染色體異常者檢出15 例，檢出率為0.67%，只有5 例經(jīng)產(chǎn)前診斷確認(rèn)為性染色體異常，陽(yáng)性符合率僅為33.33%，明顯低于常見染色體的陽(yáng)性符合率，與吳莉等［9］的研究結(jié)果相似。造成性染色體假陽(yáng)性率偏高的原因較多，包括孕齡、BMI、胎盤嵌合、母體X 染色體拷貝數(shù)變異、X 和Y 染色體的高度同源以及X 染色體GC 含量偏移等［10-11］，孕婦經(jīng)遺傳咨詢均自愿選擇終止妊娠。有研究［12］顯示，NIPT 對(duì)于檢測(cè)性染色體非整倍體改變時(shí)，X 單體具有較高的假陽(yáng)性率或母體發(fā)生異常的DNA 干擾高通量測(cè)序的準(zhǔn)確性。值得注意的是，無(wú)創(chuàng)提示性染色體數(shù)目異常風(fēng)險(xiǎn)中，性染色體數(shù)目偏多的陽(yáng)性符合率（40%）高于性染色體數(shù)目偏少（22.22%）。本文中無(wú)創(chuàng)檢出5 例其他染色體異常，但僅有1 例與后期產(chǎn)前診斷結(jié)果一致，陽(yáng)性符合率為20%（1/5），1 例3 號(hào)染色體存在缺失的風(fēng)險(xiǎn)，并經(jīng)后續(xù)染色體基因芯片技術(shù)確認(rèn)為3 號(hào)染色體短臂存在7.6 Mb 的缺失。無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查對(duì)其他染色體異常與細(xì)胞核型結(jié)果陽(yáng)性符合率偏低的原因也受多個(gè)因素的影響，如胎兒DNA濃度，胎兒胎盤嵌合，母體自身拷貝數(shù)異常等［13］。另由于本文樣本量較少，對(duì)于無(wú)創(chuàng)在染色體微缺失/微重復(fù)和性染色體的檢出能力仍有待進(jìn)一步提升和技術(shù)優(yōu)化。

綜上所述，NIPT 技術(shù)對(duì)常見染色體（21、18、13）非整倍體的檢測(cè)與產(chǎn)前診斷結(jié)果有較高的符合率，作為一種篩查模式較傳統(tǒng)的篩查模式具有其明顯的優(yōu)勢(shì)，但在性染色體以及其他染色體異常檢出的可信度仍然需要進(jìn)一步探索，在實(shí)際臨床診療中，需要和孕婦進(jìn)行充分說(shuō)明其局限性，對(duì)篩查陽(yáng)性的病例，均需要進(jìn)行進(jìn)一步的行產(chǎn)前診斷。