慢性心力衰竭患者外周血腫瘤壞死因子-α mRNA轉錄和蛋白表達與信號通路PI3K/AKT活化的臨床研究

高曉麗 劉英華 張小坤 崔慎情 謝明 劉亞寧 王健兵 顧愛峰 于成娟

華北石油管理局總醫(yī)院心內科（河北任丘062550）

慢性心力衰竭（心衰）是各種心臟疾病發(fā)展的終末階段，是以左心室重塑、擴張為特點，是當前心血管疾病患者住院和死亡的主要病因［1-2］。雖然該病的診治技術有了顯著改進，但是其5年病死率仍與惡性腫瘤相仿，為此需要在臨床上探索新的治療靶點與方法［3］。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）在免疫激活系統(tǒng)中起重要作用，在心血管疾病中呈現(xiàn)過表達狀態(tài)［4-6］。TNF-α在轉錄與翻譯水平的異常表達都可以調節(jié)血管內皮細胞生長因子（VEGF）、成纖維細胞生長因子（FGF）表達［7-8］。PI3K/AKT為生物體內的常見信號通路，PI3K 能夠通過激活AKT 來達到誘發(fā)腫瘤細胞增殖、抑制其凋亡，當前在心血管疾病中的檢測應用也比較多［9-10］。本研究探討了慢性心衰患者外周血TNF-α mRNA 轉錄和蛋白表達與外周血PI3K、AKT 活化的相關性，首次明確外周血TNF-α與信號通路PI3K/AKT 活化的關系，希望為心衰的診斷、評價、治療提供思路與參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象心衰組：2015年2月至2018年4月選擇在我院心血管內科住院診治的心衰患者244 例，符合心衰的診斷標準（Framingham 標準，陣發(fā)性夜間呼吸困難，頸靜脈怒張，心臟擴大，急性肺水腫，靜脈壓＞16 cmH2O）［1，4］。其中男128例，女116 例；年齡22 ～78 歲，平均（63.22±2.19）歲；原發(fā)性疾?。簲U張性心肌病52 例，風濕性心臟病68例，高血壓性心臟病40 例，冠心病84 例；美國紐約心臟病協(xié)會（NYHA）心功能分級：Ⅰ級166 例，Ⅱ級34 例，Ⅲ級44 例；平均身體質量指數(shù)（22.84±1.48）kg/m2；平均病程（1.48±0.29）年。對照組：選取同期在我院門診健康體檢者244 例，其中男124 例，女120 例；年齡24 ～81 歲，平均（64.02±1.48）歲；平均身體質量指數(shù)（22.09±2.19）kg/m2。

排除標準：妊娠與哺乳期婦女；意識障礙患者；合并各種病原體感染、自身免疫性疾病、腫瘤患者；正在使用抗炎或免疫抑制劑的患者；先天性心臟病患者。

所有患者在自愿條件了簽署了知情同意書，本研究得到了醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.2 標本采集采集所有入選者清晨安靜狀態(tài)下空腹肘靜脈血10 mL，其中5 mL 進行肝素抗凝，離心（1 500 r/min）10 min，剩余5 mL 不進行抗凝，都置于-80 ℃冰箱凍存

1.3 檢測方法采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒測定外周血PI3K、AKT 的含量。外周血單個核細胞TNF-α表達檢測用免疫組化法，在血液標本中加入PBS 溶液1∶1 稀釋，加入淋巴細胞分離液上，2 000 r/min 離心20 min，中間懸浮單個核細胞，收集單個核細胞，提取細胞中的RNA 和蛋白質，用RT-PCR 測定TNF-α mRNA 的相對表達量，采用Western blot 測定TNF-α 蛋白的相對表達量。同時兩組在入院后采用心臟彩超測定左室射血分數(shù)（LVEF），記錄所有入選者的血脂、血糖等水平。

1.4 統(tǒng)計學方法選擇SPSS 22.00 軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，對比為t檢驗；計數(shù)數(shù)據(jù)以率表示，對比行χ2分析，兩者相關性采用Spearman 相關分析，將具有統(tǒng)計學意義的單因素變量進行多因素Logistic 回歸分析，檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 一般資料對比兩組入選者的血脂、血糖等指標對比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組一般資料對比Tab.1 Comparison of two sets of general data ±s

表1 兩組一般資料對比Tab.1 Comparison of two sets of general data ±s

指標性別（男/女）年齡（歲）身體質量指數(shù)（kg/m2）TC（mmol/L）TG（mmol/L）HDL-C（mmol/L）LDL-C（mmol/L）FPG（mmol/L）心衰組（n=244）128/116 63.22±2.19 22.84±1.48 5.03±1.33 1.57±0.20 1.19±0.24 2.50±0.14 5.62±1.33對照組（n=244）124/120 64.02±1.48 22.09±2.19 5.13±0.66 1.61±0.95 1.22±0.42 2.53±0.98 5.45±1.59 t/χ2值0.066 0.533 0.602 0.244 0.142 0.109 0.089 0.244 P 值0.797 0.409 0.344 0.673 0.745 0.813 0.892 0.673

2.2 外周血PI3K、AKT 含量對比心衰組中外周血PI3K、AKT 含量都高于對照組（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組外周血PI3K、AKT 含量對比Tab.2 Comparison of the contents of PI3K and AKT in peripheral blood of two groups ±s

表2 兩組外周血PI3K、AKT 含量對比Tab.2 Comparison of the contents of PI3K and AKT in peripheral blood of two groups ±s

組別心衰組對照組t 值P 值例數(shù)244 244 PI3K（μmol/L）45.78±8.45 9.09±2.51 24.502＜0.001 AKT（μmol/L）4.92±1.39 2.19±0.44 9.144 0.002

2.3 外周血TNF-α mRNA 轉錄和蛋白表達對比心衰組中外周血單個核細胞中TNF-α的mRNA相對含量和蛋白含量均高于對照組（P＜0.05）。見表3、圖1。

2.4 LVEF對比心衰組的LVEF為（34.50±6.33）%，顯著低于對照組的（55.60 ± 2.49）%（t= 12.488，P＜0.001）。

表3 兩組外周血TNF-α mRNA 轉錄和蛋白表達對比Tab.3 Comparison of TNF-α mRNA transcription and protein expression in two groups of peripheral blood±s

表3 兩組外周血TNF-α mRNA 轉錄和蛋白表達對比Tab.3 Comparison of TNF-α mRNA transcription and protein expression in two groups of peripheral blood±s

組別心衰組對照組t 值P 值例數(shù)244 244 mRNA 相對含量3.22±0.47 1.57±0.31 7.866 0.009蛋白相對含量4.92±0.55 2.10±0.22 10.482 0.001

圖1 兩組外周血TNF-α蛋白表達對比Fig.1 Comparison of TNF-α protein expression in two groups of peripheral blood

2.5 相關性分析在心衰組中，Spearman 相關分析顯示外周血TNF-α mRNA、蛋白表達與PI3K、AKT 含量都呈正相關（P＜0.05）。見表4。

表4 心衰患者外周血TNF-αmRNA 轉錄和蛋白表達與PI3K、AKT 的相關性（n=244）Tab.4 Correlation of heart failure in patients with peripheral blood TNF-αmRNA and protein expression of PI3K and AKT

2.6 多因素分析在心衰組244例患者中，以LVEF為因變量，將一般資料、外周血指標等因素作自變量，多因素非條件Logistic 回歸分析顯示外周血TNF-α mRNA、蛋白表達與PI3K、AKT 含量都為影響LVEF 的獨立危險因素（P＜0.05）。見表5。

表5 影響心衰患者LVEF 的多因素分析（n=244）Tab.5 Multivariate analysis of LVEF in patients with heart failure

3 討論

心衰的機制目前尚未完全清楚，炎癥相關的細胞因子異常、神經(jīng)內分泌障礙等在心衰的病理生理和發(fā)病機制中起著重要作用。單獨的TNF-α極不穩(wěn)定，會很快被分解為無活性單體［11］。但是在心衰時，TNF-α的平衡機制被打破，可導致血液中TNF-α顯著增多。研究表明TNF-α可促進心肌細胞蛋白的合成，抑制心肌細胞收縮力，促進細胞凋和心肌肥厚，從而促進心衰的進展［12］。TNFα也可導致心肌內NO 增多，也可降低肌鈣蛋白對鈣離子的敏感性，最終導致心肌收縮力降低。本研究顯示心衰組中外周血單個核細胞中TNF-α的mRNA 相對含量和蛋白含量均高于對照組（P＜0.05），表明心衰患者伴隨有TNF-α在轉錄與翻譯水平的高表達狀況。還有研究發(fā)現(xiàn)TNF-α灌注會引起左室明顯擴大，導致左室舒張末容積增加，并使心肌順應性受損［13］。

PI3K 與AKT 均屬于PI3K/Akt 信號通路中的蛋白因子，該通路近些年是心血管疾病研究的熱門通路，已被證實在多種心血管疾病外周血中存在表達失調現(xiàn)象［14］。PI3K 在星形細胞瘤中存在兩種激活方式，一是與具有磷酸化酪氨酸殘基的生長因子受體或連接蛋白相互作用，進而引發(fā)二聚體結構改變；二是直接活化自身，產(chǎn)生PIP3，PIP3 與細胞內的Akt 和PDK1 相結合，進而促使Akt 蛋白磷酸化［15］。Akt 是PI3K 形成途徑中的重要因子，活化的Akt 能夠磷酸化多種細胞激酶，從而起到調節(jié)細胞凋亡及蛋白質形成等過程的作用［16］。

炎性細胞因子可通過一系列調控機制調節(jié)心血管功能，從而參與心衰的進展［17］。TNF-α參與了神經(jīng)內分泌一細胞因子系統(tǒng)的激活和心室重塑的過程。PI3K/Akt 信號通路是誘導淋巴細胞凋亡的關鍵機制，能通過caspase 級聯(lián)放大反應來調節(jié)心肌細胞凋亡［18］。本研究Spearman 相關分析顯示心衰患者外周血TNF-α mRNA、蛋白表達與PI3K、AKT 含量都呈正相關（P＜0.05）。PI3K/Akt 信號通路活化與心衰的心臟炎癥反應和心肌纖維化有關，脂多糖對人外周血單個核細胞TNF-α合成的誘導與PI3K/Akt 信號通路激活有關，說明PI3K/Akt 信號通路B 對心衰的炎性反應起著重要的調控作用［19］。

LVEF 是左室搏出量與舒張末期容積的比值，也是反映心衰患者病情的主要指標［20］。本研究顯示心衰組的LVEF 顯著低于對照組（P＜0.05），多因素非條件Logistic 回歸分析顯示外周血TNF-α mRNA、蛋白表達與PI3K、AKT 含量都為影響LVEF的獨立危險因素（P＜0.05）。還有研究選擇心衰患者為LVEF ≤45%，NF-κB 與LVEF 成負相關，可以評價心衰的嚴重程度［21-22］。TNF-α與心肌細胞凋亡和細胞外基質重構密切相關，TNF-α使心肌肥厚的機制可能通過影響ROS 激活p38MAPK、NF-κB 而增強部分促心肌肥厚基因的表達。不過本研究也有一定的不足，心衰時外周血的分子生物學變化涉及多個方面，僅從本研究方面闡述心衰的分子生物學機制是不全面的，還需要進一步分析。

總之，慢性心衰時PI3K、AKT、TNF-α 等因子表達水平顯著升高，可互相影響從而參與心衰的發(fā)生與發(fā)展。