磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和纖溶酶原激活物抑制劑1在腮腺多形性腺瘤中的表達(dá)及其意義

丁高峰 郭雷鳴 陸寓非

鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療科（鄭州450001）

腮腺瘤（pleomorphic adenoma，PA）約占所有涎腺腫瘤的60%，雖然是腮腺腫瘤中常見良性腫瘤，但是由于其沒有完整包膜、侵襲性生長、瘤細(xì)胞常侵犯包膜及周圍涎腺組織等特征［1］，近年來該腫瘤的發(fā)病率具有不斷上升趨勢［2］。PA作為混合瘤，當(dāng)手術(shù)切除不徹底時(shí)，PA 極易復(fù)發(fā)，且多次復(fù)發(fā)后可能產(chǎn)生惡變傾向［3-4］。因此，盡早明確該腫瘤手術(shù)的安全切除邊緣一直是研究的熱點(diǎn)，具有十分重要的研究價(jià)值和臨床指導(dǎo)意義。近年來的研究表明，在不同細(xì)胞類型和不同分化階段的該腫瘤中都出現(xiàn)了不同基因和蛋白表達(dá)變化的現(xiàn)象［5-6］。因此，研究并檢測蛋白表達(dá)含量的變化，可為了解患者病情的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)其早期病變并為手術(shù)切除提供準(zhǔn)確的判斷。

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinas，PCK），主要存在于細(xì)胞液中，是肝臟和腎臟糖異生（gluconeogenesis）的限速酶［7］。纖溶酶原激活物抑制劑-1（plaminogen activator inhibitor-1，PAI-1）具有纖溶功能，是尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA）的主要抑制劑，不僅在機(jī)體免疫、炎癥反應(yīng)和感染控制等方面具有著重要作用，同時(shí)可調(diào)節(jié)細(xì)胞因子水平和細(xì)胞運(yùn)動［8］。PAI-1 和PCK 目前已被證實(shí)與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，例如卵巢癌、乳腺癌、食管癌子宮內(nèi)膜癌等多種惡性實(shí)體腫瘤［9-11］。當(dāng)前，在臨床醫(yī)學(xué)上仍然主要通過術(shù)前術(shù)中肉眼觀察、影像學(xué)表現(xiàn)、以及冰凍切片結(jié)果來確定安全的手術(shù)切緣，但三者均存在不足，從而導(dǎo)致切除后腫瘤復(fù)發(fā)。因此，盡可能早的發(fā)現(xiàn)腫瘤并明確手術(shù)切緣具有十分重要的研究價(jià)值和臨床意義。PAI-1 和PCK 在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)等多個(gè)過程中都起著十分重要作用，但兩者在PA 的發(fā)生以及發(fā)展階段的表達(dá)水平和細(xì)胞類型是否發(fā)生變化尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)首次同時(shí)檢測腮腺PA、瘤旁組織及正常腮腺組織中PAI 和PCK 的表達(dá)量和細(xì)胞類型的變化，旨在探討二者與多形性腮腺瘤發(fā)生及其發(fā)展之間的關(guān)系，以期對臨床的治療及其預(yù)后提供相關(guān)指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料收集鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2012-2016年間病理診斷為腮腺多形性腺瘤（PA）38 例（0、0.5、1.0、1.5 和2.0 cm），其中男16 例，女22例?；颊吣挲g在41～65 歲不等。同時(shí)收集上述病例的瘤旁組織，距瘤體中心分別為0.5、1.0、1.5 和2.0 cm。10 例正常腮腺（其中男4 例，女6 例）為對照組。均經(jīng)10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm 厚連續(xù)切片，HE 染色后進(jìn)行組織學(xué)觀察，形態(tài)學(xué)上符合PA 的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)收集的實(shí)驗(yàn)組織用石蠟進(jìn)行常規(guī)包埋，連續(xù)切片（4 μm 厚），使用多聚賴氨酸防脫載玻片貼石蠟切片，切片脫蠟處理后進(jìn)行抗原熱修復(fù)，PBS 洗3 min × 3 次。組織切片在室溫下置于3%的H2O2水溶液中15 ～20 min 以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS 洗3 min × 3 次。在組織切片上滴加一定量的正常山羊血清室溫孵育20 min，封閉抗原非特異性結(jié)合位點(diǎn)后，甩去血清后直接1∶100 稀釋的PCK 和PAI-1（200 μg/mL）置于37 ℃孵育90 ～120 min，PBS洗3 min×3次。滴加二抗置于37 ℃反應(yīng)15 min，PBS 洗5 min × 3 次。加SP 反應(yīng)15 min，并用DAB 顯色，在顯微鏡下檢測顯色程度，水洗。蘇木素復(fù)染，水洗、封片。實(shí)驗(yàn)陽性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色為陽性信號，依據(jù)陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和染色強(qiáng)度進(jìn)行綜合評分。陽性細(xì)胞評分：切片中陽性細(xì)胞數(shù)＜1%為0 分；1%～5%為1 分；5%～25%為2 分；26%～60%為3 分；61%～100%為4 分。以陽性細(xì)胞染色強(qiáng)弱評分：基本未著色為0 分；著色較淺，略高于背景為1 分；著色淡黃為2 分；著色棕黃為3 分；著色棕褐色為4 分。兩項(xiàng)乘積≧2 為免疫反應(yīng)陽性，＜2分標(biāo)記為（*），2 ～3 分標(biāo)記為（+），4 ～6 分標(biāo)記為（++），6 分以上標(biāo)記為（+++）。細(xì)胞核蛋白表達(dá)率占總表達(dá)率＜1%標(biāo)記為（*），1% ～10%標(biāo)記為（+），＞10%標(biāo)記為（++）［1］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCK 和PAI-1 的表達(dá)分布實(shí)驗(yàn)顯示，PCK在正常腮腺樣本中均有表達(dá)，同時(shí)也表達(dá)在在全部瘤旁樣本，且PCK 的表達(dá)水平在正常腮腺組織和PA 組織，以及瘤旁組織各組樣本間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖1、2 中A～E）。PAI-1 在正常腮腺樣本有4 例表達(dá)，而在PA 組織及瘤旁組織中，除18 例距瘤體中心2.0 cm 的樣本外，其余均有PAI-1 的表達(dá)（圖1、2 中F～J）。PAI-1 在PA 組織中表達(dá)最高，其表達(dá)量隨著與瘤體中心距離的增加而逐漸降低，PAI-1 的表達(dá)在瘤體與正常組織間和2.0 cm 處瘤旁組織差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但其余瘤旁組織間（0.5、1.0 和1.5 cm）PAI-1表達(dá)差異不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。圖2 顯示在正常的腮腺組織中PAI-1 和PCK 主要在導(dǎo)管系統(tǒng)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中表達(dá)，而在PA 組織以及瘤旁組織中PAI-1 和PCK 主要細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，發(fā)生了顯著的核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象。

2.2 PCK 和PAI-1 表達(dá)與腮腺PA 發(fā)生的相關(guān)性統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果如表1 所示PAI-1 在腮腺PA組織中全部表達(dá)，其陽性表達(dá)的樣本數(shù)隨著與瘤體距離的增加而降低，同時(shí)其陽性表達(dá)強(qiáng)度也隨之降低；PCK 在正常組織，瘤旁組織和腮腺PA 組織中均有表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度未見明顯的增加。PAI-1的表達(dá)在瘤體與正常組織間和2.0 cm 處瘤旁組織差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；PCK 在各組樣本間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

PAI 在正常組織中的細(xì)胞核中未見表達(dá)，在PA 和瘤旁組織（0.5、1.0、1.5、2.0 cm）的細(xì)胞核表達(dá)率分別為65.79%、60.52%、57.89%、42.10%、21.05%；PCK 在正常組織中的細(xì)胞核中同樣未見表達(dá)，在PA 和瘤旁組織（0.5、1.0、1.5、2.0 cm）的細(xì)胞核表達(dá)率分別為52.63%、63.15%、34.21%、28.95%、7.89%（表2）。由分析結(jié)果可知PCK 和PAI-1 蛋白從正常組織、瘤旁組織到PA 組織中，細(xì)胞核的陽性表達(dá)不僅表達(dá)率升高，且表達(dá)強(qiáng)度也增加。

圖1 免疫組織化學(xué)示PCK 和PAI-1 在不同腮腺組織中的表達(dá)（×100）Fig.1 Expression of PCK and PAI-1in different parotid tissues by immunohistochemistry

圖2 免疫組織化學(xué)示PCK 和PAI-1 在不同腮腺組織中的表達(dá)（×200）Fig.2 Expression of PCK and PAI-1in different parotid tissues by immunohistochemistry

表1 PAI-1 和PCK 在正常腮腺、腮腺多形性腺瘤（PA）及瘤旁組織中的表達(dá)分布Tab.1 Expression of PCK and PAI-1in thetissues of PA，adjacent tumor，and normal parotid glands 例

表2 PAI-1 和PCK 在正常腮腺、腮腺多形性腺瘤（PA）及瘤旁組織細(xì)胞核中的表達(dá)分布Tab.2 Expression of PCK and PAI-1in the nucleus of PA tissues，adjacent tumor tissues，and normal parotid glands tissues 例

2.3 PCK 和PAI-1 蛋白在PA 中表達(dá)的相關(guān)性分析利用SPSS 中spearman 線性相關(guān)系數(shù)對PCK 和PAI-1 蛋白在腮腺PA 中的表達(dá)相關(guān)性進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示兩者在腮腺PA 組織中表達(dá)之間的相關(guān)性系數(shù)r= 0.325、顯著性值P= 0.675；兩者在腮腺PA 細(xì)胞核的表達(dá)分布之間的相關(guān)性系數(shù)r= 0.023、顯著性值P= 0.985，其中P值均大于0.05，所以兩者表達(dá)相關(guān)性系數(shù)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即兩者在PA 組織中和細(xì)胞核中的表達(dá)分布均無相關(guān)性。

3 討論

PAI-1 是尿激酶型纖溶酶原激活物（urokinase type plasminogen activator，uPA）的主要抑制劑，可以通過蛋白水解以及非蛋白水解兩種機(jī)制在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮重要的作用［12-13］。PAI-1 也可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，如胃癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等，與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移相關(guān)，是惡性腫瘤的不良預(yù)后因素［14-15］。WITZEL 等［16］研究表明在乳腺癌患者組織中PAI-1的表達(dá)水平顯著增加，其表達(dá)水平對乳腺癌具有重要的預(yù)測價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)PAI-1 在PA 中高表達(dá)，越接近正常組織表達(dá)量越低或者不表達(dá)，證實(shí)PAI-1 從腮腺良性病變到惡性發(fā)展的過程中均發(fā)揮促進(jìn)作用；出現(xiàn)該結(jié)果的原因可能是由于高表達(dá)的PAI-1 能夠促進(jìn)IPA-uPAR 的細(xì)胞內(nèi)吞降解，還可以干擾uPAR 與細(xì)胞表面黏附因子ECM成分的結(jié)合，使細(xì)胞粘附力降低，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移［12］。因此，PAI-1 表達(dá)水平的升高可作為腮腺瘤變以及癌變過程中的監(jiān)測指標(biāo)之一。

在腫瘤的發(fā)生過程中蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位變化起著十分重要的作用，目前探討研究蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位的變化已成為腫瘤治療研究的熱點(diǎn)之一［17-18］。本實(shí)驗(yàn)中，PAI-1 和PCK 在正常腮腺組織導(dǎo)管系統(tǒng)的胞漿和胞膜穩(wěn)定表達(dá)；而在PA 組織中PAI-1 和PCK 不僅在胞漿和胞膜中表達(dá)，同時(shí)在腫瘤細(xì)胞核中大量表達(dá)，說明從正常腮腺組織，瘤旁組織到PA 組織，PAI-1 和PCK 的表達(dá)都發(fā)生了從胞漿到胞核的轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，兩者的核轉(zhuǎn)位能夠激活多種蛋白酶，促進(jìn)ECM 基底膜的降解，構(gòu)建適合腫瘤細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移的微環(huán)境在癌細(xì)胞侵襲過程中發(fā)揮重要作用［3，17］，本結(jié)果表明PAI-1 和PCK 在細(xì)胞核中的富集可能與PA 發(fā)生相關(guān)。

此外，本實(shí)驗(yàn)顯示在PA 中PCK 和PAI-1 的陽性表達(dá)率沒有相關(guān)性（P＞0.05），且細(xì)胞核的陽性表達(dá)率也無相關(guān)性（P＞0.05），故本研究認(rèn)為PCK與PAI-1 盡管在PA 發(fā)生過程中均具有一定的促進(jìn)作用，但二者之間并未見有顯著的協(xié)同關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)未對引起兩者變化的具體機(jī)制進(jìn)行深入的探討研究，下一步將繼續(xù)針對兩者變化的分子機(jī)制進(jìn)行詳細(xì)的研究。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示PAI-1 在從正常腮腺組織、瘤旁組織到腮腺PA 組織中，表達(dá)陽性率不僅有增高的趨勢，且發(fā)生細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)位，提示PAI-1 可能參與了PA 的發(fā)生過程；PCK 雖然在表達(dá)量上差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是亦發(fā)生了細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)位，表明PCK 對PA 發(fā)生有一定的相關(guān)作用。本研究可能對PA 臨床手術(shù)起到良好的理論實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)意義，因此PAI-1 和PCK 亞細(xì)胞定位變化對于腮腺多形性腺瘤的發(fā)生可能具有重要意義，同時(shí)PAI-1 可作為一個(gè)界定該腫瘤早期發(fā)生發(fā)展以及臨床界定手術(shù)安全邊緣的候選分子指標(biāo)之一。