大鼠滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定及定向分化

王兆飛 王炳 周淵 宋登新 何小文 曹云 王健

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院（上海201999）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是常見(jiàn)的慢性關(guān)節(jié)退行性疾病之一，是一種以慢性進(jìn)行性軟骨基質(zhì)丟失和不同程度的滑膜炎癥為特征的退行性病變［1］。由于OA患者的軟骨的自我修復(fù)能力有限，其治療仍然是一大臨床挑戰(zhàn)。目前修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的方法多樣。通過(guò)間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）誘導(dǎo)分化軟骨細(xì)胞來(lái)修復(fù)缺損的軟骨成為一種潛在的可供選擇的方法。已經(jīng)在許多成人組織中檢測(cè)到MSCs，包括骨髓、骨骼肌、脂肪組織、滑液和滑膜［2-3］。相比于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow-derived MSCs，BM-MSCs）和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose-derived MSCs，AD-MSCs），關(guān)節(jié)腔中含有大量的滑膜組織，內(nèi)含豐富的滑膜衍生的MSCs，即滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞（synovial MSCs，SYN-MSCs）。已有數(shù)篇報(bào)道描述SYN-MSCs 比BMMSCs具有更高的集落形成效率［4］。鑒于SYN-MSCs顯示出分化成軟骨細(xì)胞的巨大潛力，所以SYNMSCs 是修復(fù)受損軟骨的最佳候選者之一［3，5-6］。由于大鼠髓腔內(nèi)BM-MSCs 數(shù)量有限，而經(jīng)實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)后的創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物關(guān)節(jié)內(nèi)含有大量的滑膜衍生的MSCs（SYN-MSCs）［7］，故而與既往大量研究所采用的提取BM-MSCs 不同，本研究采用了提取創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎模型中關(guān)節(jié)內(nèi)的滑膜組織，并進(jìn)行體外培養(yǎng)、分離、純化，探究SYN-MSCs 的干細(xì)胞潛能（成骨、成軟骨、成脂能力），有助于促進(jìn)SYN-MSCs 修復(fù)軟骨缺損的臨床轉(zhuǎn)化提供相關(guān)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑Ⅰ型膠原酶（Sigma 公司，USA）產(chǎn)品；DMEM 培養(yǎng)液、Ham F-12 培養(yǎng)液（Gibco 公司，USA）；新生小牛血清（FBS）（杭州四季青生物工程材料研究所，China）；多克隆兔抗Ⅱ型膠原和蛋白多糖、山羊抗兔二抗（abcam 公司，UK）；細(xì)胞蛋白抽提試劑盒、Western Blotting 相關(guān)試劑、實(shí)時(shí)熒光定量RT-qPCR 相關(guān)試劑（Beyotime，China）；雄性SD 大鼠購(gòu)買于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，體質(zhì)量150～200 g。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立動(dòng)物實(shí)驗(yàn)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院北部中心實(shí)驗(yàn)室和動(dòng)物房完成，已經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。參照DESANDO 等［8］制作的前交叉韌帶切斷的膝關(guān)節(jié)OA 模型，使用切除前交叉韌帶的方法制作大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型。30 只雄性SD 大鼠予以10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔麻醉后，隨機(jī)選取15 只，仰臥于手術(shù)臺(tái)，取左側(cè)膝關(guān)節(jié)剃毛、消毒鋪巾后，于左膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)縱切口長(zhǎng)約2 cm，顯露膝關(guān)節(jié)，切斷前交叉韌帶，保留關(guān)節(jié)軟骨面。生理鹽水沖洗切口，使用3-0 縫線逐層關(guān)閉切口。另外15 只作為假手術(shù)對(duì)照，只切開左膝關(guān)節(jié)腔，不破壞交叉韌帶及半月板。同時(shí)使用頭孢拉定500 mg 腹腔注射，每日1 次，連續(xù)3 d。所有大鼠不固定傷肢，術(shù)后7 d 驅(qū)趕動(dòng)物，每日30 min，分2 次驅(qū)趕，驅(qū)趕動(dòng)物8 周后即可獲得明顯的OA 模型。

1.2.2 SYN-MSCs 的分離、培養(yǎng)和純化無(wú)菌操作下剪取造模的SD 大鼠增生的滑膜組織，低溫儲(chǔ)存于DMEM 培養(yǎng)液中，于超凈工作臺(tái)內(nèi)PBS 沖洗3 次；仔細(xì)分離脂肪等非滑膜組織，將4 mL 濃度為0.4%Ⅰ型膠原酶加入到1～2 mm3大小的滑膜碎塊中。置于37.5 ℃CO2培養(yǎng)箱中消化4 h，經(jīng)120 目尼龍網(wǎng)（70 μm）過(guò)濾，收集細(xì)胞。使用DMEM 培養(yǎng)基于37.5 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄去未貼壁細(xì)胞，貼壁細(xì)胞即為原代滑膜細(xì)胞。用最佳密度接種挑單克隆法進(jìn)行純化，以103、104、105、106個(gè)細(xì)胞平鋪于60 cm2的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)14 d。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)和形態(tài)學(xué)特征，挑選合適密度下的單克隆進(jìn)行單獨(dú)擴(kuò)增培養(yǎng)，得到的即為原代滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞。獲得的細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，置37.5 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3 天換液1 次。細(xì)胞融合后以1：4 傳代，子代培養(yǎng)10～25 d。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)

1.3.1 動(dòng)物模型的鑒定大體外觀觀察；使用甲苯胺藍(lán)組織染色、二型膠原免疫組化、番紅O-固綠組織染色驗(yàn)證OA 模型。

1.3.2 SYN-MSCs 鑒定用0.25% Trypsin/EDTA消化第3代貼壁SYN-MSCs，離心后以D-PBS重懸并調(diào)整細(xì)胞密度約為2.4×106/mL（1 500 r/min，10 min）；將3 μL 含不同的熒光標(biāo)記單克隆抗體和相應(yīng)的同型對(duì)照抗體（CD-106PE、CD34-FITC、CD44-PE、CD45-PE、CD90-FITC、CD14-FITC、CD81-FITC、CD71-FITC、CD105-PE、CD29-FITC）加入到100 μL上述細(xì)胞懸液中振蕩混勻，于室溫條件下避光靜置30 min；每管加入2 mL 含1%NaN3的PBS 后混勻離心（1 000 r/min ，5 min），去上清并重懸細(xì)胞；將200 μL 含0.1%多聚甲醛的PBS 溶液加入上述重懸液中混勻固定，4 ℃冰箱放置，待流式細(xì)胞儀檢測(cè)。利用CellQuest 軟件分析陽(yáng)性細(xì)胞百分比。

1.3.3 SYN-MSCs 生長(zhǎng)及增殖活力的檢測(cè)SYNMSCs 培養(yǎng)至第3 代細(xì)胞，胰酶消化酶消化，D-PBS重懸并調(diào)整濃度至1 × 107/L，200 μL/孔接種于96孔板，從接種第1 天起，每日取3 個(gè)孔消化，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀在倒置相差顯微鏡下計(jì)數(shù)（每孔3 次取平均值），繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線并分析。根據(jù)生長(zhǎng)曲線對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期特點(diǎn)，參照DT=t×log2/（1ogNt-logN0）（其中t：培養(yǎng)時(shí)間的小時(shí)數(shù)；N0和Nt分別代表接種后及培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)后的細(xì)胞數(shù)）公式計(jì)算細(xì)胞數(shù)的倍增時(shí)間。隨后，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定450 nm 處每孔的吸光度值（A值，CCK-8 法），以時(shí)間變量與A450 值的關(guān)系，繪制細(xì)胞增殖活力曲線。

1.3.4 SYN-MSCs成軟骨誘導(dǎo)分化能力取第3代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SYN-MSCs，胰蛋白酶消化，混勻成5 × 104個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液，接種于12 孔板爬片上，每孔1 mL 細(xì)胞懸液，37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)；培養(yǎng)3 d 待細(xì)胞完全貼壁后，加入軟骨分化誘導(dǎo)液（低糖DMEM 中添加1% ITS+premix，1% 雙 抗100 mg/mL 鏈 霉 素、100 U/mL 青 霉 素，50 μg/mL 維生素C，40 μg/mL 脯氨酸，100 nmol/L地塞米松，10 ng/mL TGF-β3），誘導(dǎo)其向軟骨細(xì)胞定向分化。甲苯胺藍(lán)染色：已爬好細(xì)胞的玻片用PBS 浸洗3 次，每次3 min，用4%的多聚甲醛固定爬片15 min，PBS 浸洗玻片3 次，每次3 min，入預(yù)熱60 ℃1%的甲苯胺藍(lán)染液染色40 min，95%酒精快速分化，脫色，鏡檢至背景清楚為止，無(wú)水乙醇快速脫水，二甲苯透明，通風(fēng)櫥中風(fēng)干后中性樹膠封片，鏡檢。Ⅱ膠原免疫組化：將已爬好細(xì)胞的蓋玻片用PBS浸洗3次，每次1 min，用4%的多聚甲醛固定爬片15 min，PBS 浸洗玻片3 次，每次3 min；0.5% Triton X-100 室溫通透20 min，吸水紙吸掉玻片周圍多余液體，加一抗?jié)窈? ℃孵育過(guò)夜。加二抗室溫孵育20～30 min，Harris 蘇木素復(fù)染，程序脫水，中性樹膠滴封片，鏡檢拍照。

1.3.5 SYN-MSCs 成骨誘導(dǎo)分化能力胰蛋白酶消化體外培養(yǎng)的第3 代SYN-MSCs 后，接種于含基礎(chǔ)培養(yǎng)基的12 孔板內(nèi)，進(jìn)行體外成骨誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)；待單克隆樣生長(zhǎng)的貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)融合后，更換為誘導(dǎo)培養(yǎng)基（0.1 μmol/L 地塞米松，10 mmol/L β-甘油磷酸鈉，HG-DMEM/10%FBS，50 mg/L 維生素C）；適時(shí)分別行ALP 和茜素紅染色鑒定，并以RT-PCR 檢測(cè)成骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)。堿性磷酸酶染色：細(xì)胞固定后，洗滌3～5 次，每次3～5 min，加入染色工作液，室溫避光5～30 min 或更長(zhǎng)時(shí)間，直至顯色至預(yù)期深淺，除去工作液，蒸餾水洗1～2 次終止顯色反應(yīng)，細(xì)胞樣品顯色終止后，如有必要可用核固紅染色液染色，無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，通風(fēng)櫥中風(fēng)干后中性樹膠封片，鏡檢。茜素紅染色：在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的蓋玻片用PBS 浸洗3 次，每次1 min，4%的甲醛固定爬片15 min，PBS 浸洗玻片3 次，每次3 min，0.2%茜素紅染液染色5～30 min，PBS 沖洗，鏡下觀察。

1.3.6 SYN-MSCs 成脂誘導(dǎo)分化能力取第3 代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SYN-MSCs 細(xì)胞，胰蛋白酶消化細(xì)胞，混勻成1 × 105個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液，接種于12 孔板爬片上，37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)；培養(yǎng)3 d 待細(xì)胞完全貼壁后，更換成含3-異丁基-1甲基黃嘿吟0.5 mmol/L，地塞米松1 μmol/L，胰島素5 mg/L，吲哚美辛200 μmol/L，胎牛血清10%的DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)，每3 天更換成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液并拍照，21 d 后進(jìn)行油紅O 染色。細(xì)胞爬片經(jīng)固定30 min 后，蒸餾水洗，60%異丙醇浸洗，油紅O染液染10 min，60%異丙醇分色至背景無(wú)色，蒸餾水洗，Mayer 蘇木素復(fù)染數(shù)分鐘，自來(lái)水洗（藍(lán)化）1～3 min，蒸餾水洗后水溶性封片劑封片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)和方差分析（LSD法），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠OA 造模鑒定術(shù)后8 周全部大鼠均進(jìn)入結(jié)果分析，未出現(xiàn)術(shù)區(qū)感染跡象。膝關(guān)節(jié)大體觀提示股骨髁及脛骨平臺(tái)干骺端有明顯骨贅形成，軟骨磨損缺失（圖1）。甲苯胺藍(lán)組織染色、二型膠原免疫組化、番紅O-固綠組織染色均顯示未鈣化的關(guān)節(jié)軟骨面不平整，軟骨層變薄，軟骨基質(zhì)丟失，蛋白聚糖（PG）含量顯著減少，Ⅱ型膠原發(fā)生明顯降解。證實(shí)了大鼠膝關(guān)節(jié)OA 模型的成功構(gòu)建（圖2）。

圖1 大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型的制作及大體觀Fig.1 General view of rat osteoarthritis model andmaking method

2.2 SYN-MSCs 的生長(zhǎng)及增殖能力SYN-MSCs生長(zhǎng)曲線為典型S 形（接種3 d 內(nèi)細(xì)胞處于停滯期、3～6 d 為對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期、8 d 生長(zhǎng)速度變緩進(jìn)入平臺(tái)期）。根據(jù)生長(zhǎng)曲線，代入公式可計(jì)算出細(xì)胞倍增時(shí)間為（30.2±2.4）h（圖3）。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)SYN-MSCs 表面抗原SYNMSCs 表面抗原鑒定結(jié)果表明：同一表面分子在細(xì)胞群中的表達(dá)一致率在99%以上。其中CD44、CD90、CD105、CD147 表達(dá)值分別為（99.63±0.21）%、（99.34±0.32）%、（99.68±0.30）%、（99.54±0.25）%，均呈陽(yáng)性表達(dá)（陽(yáng)性率＞99.9%）；CD34、CD45、CD117、CD31、STRO-1表達(dá)值分別為（6.48±1.75）%、（6.52 ± 2.28）%、（6.73 ± 1.68）%、（6.52 ± 2.43）%、（6.52±2.12）%，均呈陰性表達(dá)（＜10%）。

圖2 大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型的鑒定Fig.2 Verification of a rat model of osteoarthritis

圖3 SYN-MSCs 細(xì)胞增殖活力曲線Fig.3 Cell proliferation activity curve of SYN-MSCs

2.4 SYN-MSCs 成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化SYNMSCs 成軟骨誘導(dǎo)分化21 d 后，甲苯胺藍(lán)染色示有軟骨細(xì)胞特異性的細(xì)胞外基質(zhì)-糖胺聚糖成分，Ⅱ型膠原免疫組化結(jié)果呈現(xiàn)陽(yáng)性，可見(jiàn)染色后胞漿為棕褐色的陽(yáng)性細(xì)胞，說(shuō)明成軟骨誘導(dǎo)后，可表達(dá)軟骨的特異性蛋白Ⅱ型膠原（圖4B、C）。同時(shí)，對(duì)經(jīng)誘導(dǎo)后的滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞利用Real-time qPCR和Western Blot 檢測(cè)分化后細(xì)胞中Ⅱ型膠原和蛋白聚糖mRNA 的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞在經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)后表達(dá)了蛋白聚糖及Ⅱ型膠原，其表達(dá)水平（灰度值）與成熟軟骨細(xì)胞無(wú)明顯差異（圖5）。

2.5 SYN-MSCs 成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化成骨誘導(dǎo)14 d 后，可見(jiàn)胞漿內(nèi)有不透光物質(zhì)的分泌和沉積，呈點(diǎn)片狀或放射狀，ALP 染色可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)灰黑色塊狀沉淀。成骨誘導(dǎo)21 d 后，茜素紅染色可見(jiàn)鈣鹽沉積陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)桔紅色（圖4D、E）。

2.6 SYN-MSCs 成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化21 d 后，細(xì)胞體積逐漸增大，由原來(lái)的梭形變成圓形，胞質(zhì)中有小的圓形、透亮的脂肪滴出現(xiàn)，排列呈環(huán)狀，且相互融合。油紅O 染色可見(jiàn)圓形的紅染脂肪滴融合成環(huán)狀包繞細(xì)胞核，細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色。說(shuō)明成脂誘導(dǎo)后，可表達(dá)脂肪細(xì)胞特有的脂肪滴（圖4F）。

3 討論

關(guān)節(jié)軟骨（透明軟骨）覆蓋關(guān)節(jié)的表面，由于其具有輕微的可壓縮性和彈性以及潤(rùn)滑作用，它可以為關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)提供減震和潤(rùn)滑［9］。透明軟骨是一種無(wú)血管組織，損傷后再生能力十分有限，主要由95%的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）和5%的稀疏分布的軟骨細(xì)胞組成［10］。該基質(zhì)主要由Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖（PG）組成，盡管軟骨細(xì)胞僅占透明軟骨組織的約5%，但它們是軟骨功能和體內(nèi)平衡的不可或缺的組成部分［11］。這些細(xì)胞是由MSCs 分化而來(lái)，MSCs 是存在于骨髓、脂肪組織、滑膜、滑液和圍產(chǎn)期組織中的成體多能細(xì)胞［12］。在過(guò)去的幾十年中，MSCs 已被廣泛研究用于軟骨修復(fù)。但最近研究表明，滑膜組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞（SYN-MSCs）在骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)滑膜及滑膜液中數(shù)量較正常人明顯增加［13-14］。有研究甚至發(fā)現(xiàn)，在人類及兔的膝關(guān)節(jié)交叉韌帶損傷后，滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量將顯著增加［15］。此外研究發(fā)現(xiàn)膝骨關(guān)節(jié)炎還與炎性狀態(tài)下滑膜細(xì)胞的增殖密切相關(guān)，滑膜細(xì)胞的增殖既是滑膜炎的結(jié)果也是滑膜炎加重的病因［14，16］。自SYN-MSCs 在2001年首次發(fā)現(xiàn)［17］，越來(lái)越多的研究者將目光轉(zhuǎn)移到SYN-MSCs。相比于其他來(lái)源的MSCs，SYN-MSCs具有更高的增殖能力和軟骨形成潛能，因此這些細(xì)胞被認(rèn)為是用于治療軟骨損傷的新希望。在增殖能力方面，脂肪來(lái)源的MSCs 在第7 代即喪失增殖力，而SYN-MSCs 增殖能力可保持10 代以上［18］。由此可見(jiàn)，滑膜是間充質(zhì)干細(xì)胞的最佳來(lái)源。

圖4 分離培養(yǎng)SYN-MSCs 并向成軟骨、成骨、成脂方向誘導(dǎo)分化Fig.4 SYN-MSCs induced differentiation in the cartilage，osteogenic and adipogenic directions

圖5 滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化后的Western Blot 結(jié)果Fig.5 Western Blot results of SYN-MSCs differentiated into cartilage

目前正在進(jìn)行大量的臨床研究，以檢查自體滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞的移植是否能夠使膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)中的軟骨和半月板再生［1，12，19］。研究［20］表明，關(guān)節(jié)內(nèi)注射SYN-MSCs 促進(jìn)兔軟骨缺損模型中的軟骨再生，關(guān)節(jié)內(nèi)注射SYN-MSCs 有助于大鼠半月板缺損模型中的半月板再生。SYN-MSCs 與半月板纖維軟骨細(xì)胞（me-CH）的共培養(yǎng)可以支持me-CH 的基質(zhì)產(chǎn)生，從而減少了半月板重建所需的me-CH的數(shù)量［21］。筆者推測(cè)滑膜組織可能充當(dāng)干細(xì)胞的儲(chǔ)庫(kù)，其在軟骨缺損發(fā)生后遷移至該部位以參與修復(fù)反應(yīng)。使用SYN-MSCs 的再生技術(shù)已被認(rèn)為是用于軟骨組織修復(fù)的新療法。然而，目前還不清楚SYN-MSCs 軟骨分化的具體機(jī)制。盡管人們對(duì)SYN-MSCs 的體內(nèi)外增殖能力、多項(xiàng)分化潛能等方面進(jìn)行了一系列的研究，但是在SYN-MSCs 本身生理學(xué)、免疫學(xué)等基本功能的研究方向上仍缺乏大量不足。SYN-MSCs 相對(duì)于其他組織來(lái)源的MSCs 在成軟骨分化方面具有組織特異性優(yōu)勢(shì)，為實(shí)現(xiàn)SYN-MSCs 修復(fù)退行性骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨修復(fù)的臨床轉(zhuǎn)化，因此當(dāng)前研究主要集中于SYNMSCs 成軟骨分化方向上，但SYN-MSCs 軟骨產(chǎn)物還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠完善。為達(dá)到軟骨的完全再生，在開發(fā)SYN-MSCs 臨床轉(zhuǎn)化過(guò)程中，必須找到特異性的將MSCs 分離鑒別出來(lái)的細(xì)胞表面標(biāo)記分子和能夠模擬人體自然生長(zhǎng)環(huán)境的生長(zhǎng)因子以及確保再生表面與自然組織正常協(xié)同運(yùn)作的生物摩擦等。

在這項(xiàng)研究中，筆者通過(guò)切除大鼠前交叉韌帶，模擬人類運(yùn)動(dòng)性關(guān)節(jié)損傷導(dǎo)致的OA。此類OA 模型關(guān)節(jié)軟骨受損明顯，符合OA 自然發(fā)病過(guò)程。通過(guò)誘導(dǎo)后的大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)富含大量滑膜組織，大大提高了滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞的含量。筆者通過(guò)不同條件下誘導(dǎo)SYN-MSCs 分別進(jìn)行成脂、成骨、成軟骨分化，從細(xì)胞特異性染色、RT-PCR 檢測(cè)細(xì)胞特異性基因表達(dá)等方面對(duì)SYN-MSCs 的分化能力鑒定，結(jié)果均表明SYN-MSCs 具有向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞分化的能力。通過(guò)炎癥因子TGF-β3 誘導(dǎo)SYN-MSCs 成軟骨分化［22］，實(shí)驗(yàn)表明，SYN-MSCs 大量成軟骨分化，并表達(dá)軟骨細(xì)胞特征性Ⅱ型膠原和蛋白聚糖，這可能是SYN-MSCs成軟骨分化的分子機(jī)制的闡明。

綜上所述，筆者從大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中成功分離培養(yǎng)出了滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞，并成功誘導(dǎo)其多向分化。驗(yàn)證了滑膜來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞在大鼠創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎模型中含量豐富，并且易于提取及多向誘導(dǎo)分化，將為后續(xù)進(jìn)一步研究滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞的在體軟骨修復(fù)等相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床的最終應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。筆者相信，SYN-MSCs 作為一種擁有巨大開發(fā)潛力的種子細(xì)胞，必將在組織工程、基因治療和再生醫(yī)學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，SYN-MSCs 將是治療軟骨破壞性疾病的良好選擇。另外，人類滑膜是MSCs 的可及來(lái)源。在關(guān)節(jié)鏡和膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)過(guò)程中，它們通常在OA 患者中被移除，這為將來(lái)的臨床應(yīng)用提供了優(yōu)異的供應(yīng)優(yōu)勢(shì)。