基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對鎮(zhèn)喘保肺湯治療腎氣虛證支氣管哮喘人體尿液代謝組學分析*

余鵬飛 宋 紅

浙江中醫(yī)藥大學 浙江 杭州 310053

支氣管哮喘（以下簡稱哮喘）已經(jīng)成為當今世界上最為普遍的疾病之一，是由多種細胞(嗜酸粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞、平滑肌細胞、氣道上皮細胞等)和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病[1]。中醫(yī)學根據(jù)辨證論治將哮喘分成熱哮、冷哮、虛哮3個證型。從證候角度，每一個中醫(yī)證候是由許多因素組成的復雜性表型，使用單一的生理、生化指標來表達描述證候本質(zhì)，闡釋生理病理機制及疾病治療前后的變化存在局限性和片面性。近幾年迅速發(fā)展的系統(tǒng)生物學，以“解析生命過程的復雜性，利用整體性、系統(tǒng)性研究手段發(fā)現(xiàn)揭示生命活動本質(zhì)規(guī)律”為目標[2]，其中的代謝組學通過生化表達的終端性信息，最具備反映和解決證候問題的“組”“群”“譜”集成分析功能。

在哮喘的治療上，鎮(zhèn)喘保肺湯為本課題基于辨證論治用于治療腎氣虛證哮喘的經(jīng)驗用方，以此方為媒介，利用代謝組學方法研究中藥治療哮喘的多靶點作用機制，從而揭示系統(tǒng)內(nèi)部各組成成分及它們的相互作用和運行規(guī)律。在本次臨床試驗中，12例哮喘患者服藥前后和8名健康對照的尿液樣本通過液質(zhì)聯(lián)用分析，以評估與哮喘有關(guān)的終端信息，從而可能揭示哮喘的病理機制和腎氣虛證哮喘的證本質(zhì)。

1 臨床資料

中醫(yī)診斷參照《中醫(yī)病證診斷療效標準》中有關(guān)“虛哮”進行診斷。納入標準：①發(fā)作時喉中哮鳴有聲，呼吸困難，甚則張口抬肩，不能平臥，或者口唇指甲紫鉗；②呈反復發(fā)作性，常因氣候突變、飲食不當、情志失調(diào)、勞累等因素誘發(fā)，發(fā)作前多有鼻癢、噴嚏、咳嗽、胸悶等先兆；③有過敏史或家族史；④兩肺可聞及哮鳴音，或伴有濕羅音；⑤血嗜酸性粒細胞可增高；⑥痰液涂片檢查可見嗜酸細胞；⑦胸部X線檢查一般無特殊改變，久病可見肺氣腫征象；⑧年齡范圍在40～80歲之間，男女性別不限。

2 研究方法

2.1 試驗分組：對照組（A組）8例，腎氣虛證哮喘組治療前(B組）12例、腎氣虛證哮喘治療后(C組)12例。

2.2 治療方法：對照組不予以任何干預，納入標準的病人予以鎮(zhèn)喘保肺湯中藥湯劑口服治療，其組成為：人參、附子、五加皮各15g，三七12g，何首烏10g，沉香（研末）、冬蟲夏草各1g，蛤蚧（研末）1.5g。煎服，每日1劑，分早、晚2次服。共治療1月。

2.3 療效評定：治愈：哮喘控制，哮鳴音消失；好轉(zhuǎn)：哮喘緩解，或發(fā)作次數(shù)減少；未愈：癥狀無變化。

2.4 樣品的采集和處理：實驗前2h取出患者尿液樣品，室溫下解凍搖勻，取1.0ml尿液樣品于離心管中，12000r/min離心10min；取上清液200μl于2ml離心管中，加入150個單位的尿素酶，振蕩30s，在37℃，反應1.5h去除尿素；加入1.7ml甲醇、0.2mg/ml的十七酸60μl和0.2mg/ml的2-氯苯丙氨酸60μl，振蕩5min；10000r/min離心10min；取1.5ml上清液于玻璃管中，

50℃真空離心濃縮至干。加入60μl的甲氧胺，封蓋，振蕩30s，在37℃條件下反應2h啟蓋；加入60μl三氟乙酰胺(BSTFA)+1%三甲基氯硅烷(TMCS)，封蓋，振蕩30s；在37℃條件下反應90min，振蕩30s,即可。

2.5 數(shù)據(jù)處理：液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測后，得到經(jīng)質(zhì)譜分析儀器自帶軟件導出原始數(shù)據(jù)（質(zhì)荷比對應的峰強度）Excel文件，對數(shù)據(jù)進行歸一化處理，使用SMICA-P軟件進行分析，對該數(shù)據(jù)矩陣進行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)建模分析。根據(jù)OPLS-DA模型的 VIP（Variable Importance in the Projection）值，并結(jié)合t-test的P值來尋找差異性表達代謝物。差異性代謝物的定性方法為：搜索在線數(shù)據(jù)庫（Metlin）（比較質(zhì)譜的質(zhì)荷比m/z或者精確分子質(zhì)量Mass）并通過檢索在線數(shù)據(jù)庫（KEGG、HMDB、LIPID、Metlin）定性可能的差異性代謝物。然后，對差異性代謝物進行代謝通路分析。

3 結(jié)果

3.1 PCA分析：試驗結(jié)束后統(tǒng)計，C組最后采集的樣本量為8例；A組為8例，B組為12例。從圖1中可以看出，A組與B組相比較，B組的代謝組已經(jīng)偏離了正常狀態(tài)，兩組間具有顯著差異；B組與C組相比較，也具有差異。

圖1 A組與B組、B組與C組的PCA得分圖（ESI+）

圖2 A組與B組、B組與C組的OPLS-DA得分圖（ESI+）

表1 正模式下B-C兩組的差異性代謝物

3.2 OPLS-DA分析：在尋找代謝差異物的過程中，為了將樣本與研究目的不相關(guān)的非誘導性生物學差異及樣本處理及分析過程中的技術(shù)性偏差的變異區(qū)別開來，我們進一步應用OPLS-DA分析，A組和B組在正模式下得到1個主成分和3個正交成分，R2X=0.528，R2Y=0.998，Q2=0.83；B組和C組在正模式下得到1個主成分 和 5個 正 交成分 ，R2X=0.808，R2Y=0.999，Q2=0.989。模型的參數(shù)R2Y表示模型的解釋率，Q2表示模型的預測率。其得分圖如圖2所示：其中用于判別模型質(zhì)量好壞的R2Y和Q2值均大于0.4，表示模型可靠。從圖中也可看出，在第一預測的主成分（t[1]）方向上具有很好的區(qū)分聚類趨勢，該模型只有一個預測主成分能夠代表腎氣虛證哮喘所造成的人體尿液代謝組的改變。

3.3 組間差異性代謝產(chǎn)物的挖掘及鑒定：采用OPLS-DA模型的VIP值（閾值＞1），并結(jié)合t-test的P值（P＜0.05）來尋找差異性代謝物。差異性代謝物的定性方法為：搜索在線數(shù)據(jù)庫（Metlin）（比較質(zhì)譜的質(zhì)荷比m/z或者精確分子質(zhì)量Mass）。數(shù)據(jù)見表1、表2。

表2 正模式下A-B兩組的差異性代謝物

數(shù)據(jù)顯示，與正常組相比，哮喘患者的尿液中L-纈 氨酸、L-酪氨酸、吲哚乳酸、膽堿、3-吲哚乙酸、己酸、四氫可的松、十六烷二酸、4-吡哆酸、醋酸等物質(zhì)明顯增加，溶血磷脂酰乙醇胺、L-脯氨酸、孕烯醇酮、雄酮、辛酸、煙酰甘氨酸、二十碳五烯酸、雄甾酮葡萄糖醛酸苷、氫化肉桂酸、睪酮葡萄糖醛酸苷、癸二酸、煙酸等物質(zhì)明顯減少。服用鎮(zhèn)喘保肺湯后，哮喘患者與用藥前相比尿液中N-異戊酰甘氨酸、麥芽糖、甲基丙二酸、腺苷、前列腺素E2、異丁酸等物質(zhì)明顯增加；1-甲基組氨酸、水楊酸、3-甲基硫代丙酸、牛磺酸、L-酪氨酸、4-吡哆酸、2-羥基己二酸、肌酸、N1-乙酰亞精胺、1-甲基腺苷、N6，N6，N6-三甲基-L-賴氨酸明顯減少。L-酪氨酸和4-吡哆酸在哮喘患者身上高于正常組，服藥后降低。

我們將上述差異代謝物的名稱進行通路歸屬，并在線分析（MetaboAnalyst），并結(jié)合P＜0.05，F(xiàn)DR≠1，A組與B組的數(shù)據(jù)在類固醇激素生物合成（Steroid hormone biosynthesis）的通路上匹配到4/99。由于在線數(shù)據(jù)庫的局限性，B組與C組的數(shù)據(jù)沒有符合要求，但其差異代謝物的通路可能主要涉及氨基酸代謝、維生素B6的代謝、氮代謝、?；撬岷蛠喤；撬岽x、硫胺素代謝等。

4 討論

酪氨酸是一種非必需氨基酸，是機體多種生成物的原料，酪氨酸在體內(nèi)可通過不同代謝途徑轉(zhuǎn)化為多種生理物質(zhì)，如多巴胺、腎上腺素、甲狀腺素、黑色素及罌粟(鴉片)的罌粟堿。這些物質(zhì)與神經(jīng)傳導和代謝調(diào)節(jié)控制關(guān)系密切。而酪氨酸激酶抑制劑可能影響氣道炎癥和重塑，作為治療哮喘的新藥也正在動物模型和早期臨床試驗中進行測試[4]。這提示酪氨酸或其合成的上游物質(zhì)減少，可能與治療哮喘的作用機制有關(guān)。另外，F(xiàn)ogarty A[5]等在臨床病例對照中發(fā)現(xiàn)而精氨酸、苯丙氨酸和色氨酸可能對哮喘有不良影響。而在苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成通路中（圖3），苯丙氨酸在苯丙氨酸羥化酶的作用下轉(zhuǎn)變成酪氨酸，從而酪氨酸增加，這與我們在哮喘患者中檢測到的酪氨酸增加，服藥后降低的變化結(jié)果吻合。因而鎮(zhèn)喘保肺湯很可能是通過抑制酪氨酸的合成從而控制哮喘的發(fā)作。

圖3 苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成通路（部分）

在肝臟中，吡哆醛在醛氧化酶作用下不可逆地轉(zhuǎn)化為4-吡哆酸，4-吡哆酸也是維生素B6的最終排泄產(chǎn)物[6-7]。最新研究結(jié)果表明，循環(huán)的吡哆醛-5'-磷酸（PLP）與肺癌風險有關(guān)。PAr指數(shù)定義為4-吡哆酸/（吡哆醛+PLP）的比率，反映了炎癥期間維生素B6分解代謝增加。PAr已被定義為前瞻性隊列研究中肺癌風險的標志[8]?；颊叻面?zhèn)喘保肺湯之后4-吡哆酸的降低提示該方使炎癥得到了控制，維生素B6的分解代謝降低。但是這一結(jié)論只是側(cè)面應證了鎮(zhèn)喘保肺湯控制肺部炎癥的療效指標，提示了該方對肝臟代謝的影響顯著，仍然不足以闡明鎮(zhèn)喘保肺湯的作用機制。

通過上述研究結(jié)果的分析，筆者認為，在下一步對鎮(zhèn)喘保肺湯作用機制的研究工作中，重視其在肝臟代謝中的相關(guān)作用機制，有可能是我們闡明作用機制的關(guān)鍵所在。

5 參考文獻

[1]Johnston S L,Pattemore P K,Sanderson G,et al.Community study of role of viral infections in exacerbations of asthma in 9-11 year old children[J].Bmj,1995,310(6989)：1225-1229.

[2]李健杰,高鈺琪.生物醫(yī)學整合系統(tǒng)化研究與發(fā)展[J].世界科技研究與發(fā)展,2017,39(6)：491-496.

[3]傅淑艷,徐志瑛.支氣管哮喘治法探討[J].浙江中醫(yī)雜志,2000,35(8)：38.

[4]OlinJT,WechslerME.Asthma：Pathogenesisand novel drugs for treatment[J].Bmj,2014,349：g5517.

[5]Fogarty A,Broadfield E,Lewis S,et al.Amino acids andasthma：Acase-controlstudy[J].Eur Respir J,2004,23(4)：565-568.

[6]Galluzzi L,Vacchelli E,Michels J,et al.Effects of vitamin b6 metabolism on oncogenesis,tumor progression and therapeutic responses[J].Oncogene,2013,32(42)：4995-5004.

[7]Ueland P M,Ulvik A,Rios-Avila L,et al.Direct and functional biomarkers of vitamin b6 status[J].Annu Rev Nutr,2015（35）：33-70.

[8]Zuo H,Ueland P M,Midttun O,et al.Results from the european prospective investigation into cancer and nutrition link vitamin b6 catabolism and lung cancer risk[J].Cancer Res,2018,78(1)：302-308.