呼吸道感染嬰幼兒血清模式識(shí)別受體RIG-I和MDA-5表達(dá)的意義

蔣珍鳳 王恩智 童夏生

天然免疫是機(jī)體的第一道防御系統(tǒng)，在感染性和非感染性疾病中都起著重要作用[1-2]。病毒或微生物感染后，機(jī)體的天然免疫反應(yīng)會(huì)被激活，病原體相關(guān)分子模式通過不同的模式識(shí)別受體識(shí)別和清除病原微生物。模式識(shí)別受體包括Toll樣受體、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域受體和維甲酸誘導(dǎo)基因-I（RIG-I）樣受體等家族[3]。嬰幼兒期呼吸道感染最常見的疾病之一，大多由病毒感染引起，主要為呼吸道合胞病毒（RSV）和流感病毒。研究發(fā)現(xiàn)，模式識(shí)別受體與呼吸道病毒感染有關(guān)，但RIG-I樣受體家族RIG-I和黑素瘤分化關(guān)聯(lián)基因5（MDA-5），與嬰幼兒呼吸道病毒感染的相關(guān)性研究較少[4]。本研究通過觀察RSV感染的毛細(xì)支氣管炎和流感病毒感染的急性上呼吸道感染患兒血清RIG-I和MDA-5濃度的變化，探討模式識(shí)別受體在呼吸道感染的不同部位及不同種類病毒感染中的作用，為嬰幼兒呼吸道病毒感染的發(fā)病機(jī)制和可能的靶向治療提供理論依據(jù)。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2016年11月—2017年4月臺(tái)州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院的住院患兒90例，均符合毛細(xì)支氣管炎或急性上呼吸道感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。本研究取得患者家屬知情同意，經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)審核通過。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：符合毛細(xì)支氣管炎或急性上呼吸道感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)；毛細(xì)支氣管炎組血清RSV均呈陽性表達(dá)，急性上呼吸道感染組流感病毒均呈陽性表達(dá)（采用間接免疫熒光法檢測(cè)，試劑盒購自西班牙VIRCELL，S.L公司）；病程24～48h；毛細(xì)支氣管炎組住院時(shí)間為12～14d。排除標(biāo)準(zhǔn):合并有嚴(yán)重心、肝、腎等重大臟器疾??；甲狀腺疾病等免疫性疾病史；惡性腫瘤；2周內(nèi)有感染病史；最近2周內(nèi)使用過糖皮質(zhì)激素。

2 方法

2.1 標(biāo)本采集 采集患兒靜脈血各2mL，急性上呼吸道感染組和對(duì)照組在就診時(shí)采集，毛細(xì)支氣管炎組分別于患兒就診時(shí)（急性期）和治療后（恢復(fù)期）采集，標(biāo)本靜置2h后分離血清（3000r/min離心15min），置于-80℃冰箱貯存，集中檢測(cè)。

2.2 血清RIG-I和MDA-5蛋白檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法，檢測(cè)血清RIG-I和MDA-5的蛋白濃度。操作方法：試劑盒和96孔反應(yīng)板置于室溫，先后在反應(yīng)孔里加入標(biāo)品40μL、RIG-I和MDA-5抗體各10μL、混勻、置37℃溫育30min、洗滌、酶標(biāo)試劑50μL、顯色劑 A 50μL、顯色劑B 50μL、37℃避光顯色 15min、加終止液 50μL，全自動(dòng)酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的吸光度（OD值），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)各標(biāo)本吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的濃度。RIG-I和MDA-5試劑盒均購自Bio-Gram 公司（生產(chǎn)批號(hào) SU-B11924、SU-B10697），酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)血清RIG-I和MDA-5蛋白表達(dá)濃度（靈敏度：最低檢測(cè)濃度＜0.1ng/mL）。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，三組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，方差齊性者采用LSD法，方差不齊者采用Tamhame’s T2檢驗(yàn)，同組比較采用配對(duì)資料的t檢驗(yàn)，兩變量的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（雙側(cè)檢驗(yàn)）。

3 結(jié)果

3.1 三組研究對(duì)象一般資料比較 毛細(xì)支氣管炎（毛細(xì)支氣管炎組）46例，男22例，女24例；年齡0.5～3歲，平均（1.62±0.84）歲；急性上呼吸道感染（急性上呼吸道感染組）44例，男18例，女26例，年齡0.3～3歲，平均（1.54±0.88）歲。對(duì)照組 44例來自同期在溫嶺市衛(wèi)生進(jìn)修學(xué)校兒科門診健康體檢兒童，男23例，女 21例，年齡 0.3～3歲，平均（1.47±0.77）歲。三組患兒性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3.2 三組研究對(duì)象血清RIG-I和MDA-5表達(dá)水平比較 毛細(xì)支氣管炎組急性期和急性上呼吸道感染組血清RIG-I和MDA-5蛋白濃度均顯著高于對(duì)照組（P均＜0.01）；毛細(xì)支氣管炎組急性期血清RIG-I蛋白濃度顯著高于急性上呼吸道感染組（P＜0.05），兩組間MDA-5蛋白濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。毛細(xì)支氣管炎組恢復(fù)期血清RIG-I和MDA-5蛋白濃度均顯著低于急性期（P均＜0.01）。見表1。

表1 三組呼吸道感染嬰幼兒血清RIG-I和MDA-5蛋白濃度比較（ng/mL，±s）

表1 三組呼吸道感染嬰幼兒血清RIG-I和MDA-5蛋白濃度比較（ng/mL，±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.01；與急性上呼吸道感染組比較，△P＜0.05；與同組急性期比較，▲P＜0.01；RIG-I：維甲酸誘導(dǎo)基因-I；MDA-5：黑素瘤分化關(guān)聯(lián)基因5

組別對(duì)照組急性上呼吸道感染組毛細(xì)支氣管炎組急性期恢復(fù)期F值P RIG-I 5.43±1.77 12.37±4.16*MDA-5 7.42±2.07 15.50±4.29*14.60±4.05△*9.94±4.14▲82.63＜0.01 18.19±6.95*12.98±5.54▲58.30＜0.01

3.3 相關(guān)性分析 RIG-I和MDA-5表達(dá)呈顯著直線正相關(guān)（r=0.52，n=134，P＜0.01）。

4 討論

細(xì)胞內(nèi)的模式識(shí)別受體由RIG-I樣受體蛋白家族組成，主要成員為RIG-I和MDA-5，兩者在形態(tài)學(xué)上具有高度同源性，包括2個(gè)N-末端半胱氨酸蛋白酶募集反應(yīng)結(jié)構(gòu)域和解螺旋酶結(jié)構(gòu)域和C-未端抑制結(jié)構(gòu)域，并通過共同的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)觸發(fā)機(jī)體的天然免疫反應(yīng)[6]。在細(xì)胞質(zhì)中，RIG-I具有5′端成族的三磷酸鹽的結(jié)構(gòu)，而MDA-5活性結(jié)構(gòu)是具有較長(zhǎng)的雙鏈RNA，在外源性的RNA誘導(dǎo)下發(fā)生一連串的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括干擾素β和核轉(zhuǎn)錄因子κB，產(chǎn)生I型干擾素和促進(jìn)天然免疫反應(yīng)[6]。通常，RIG-I樣受體蛋白家族分享檢測(cè)病毒感染的分子信號(hào)結(jié)構(gòu)，目前已證實(shí)家族成員間在抗病毒的過程中具有協(xié)同作用[7]。RIG-I信號(hào)由自身細(xì)小的核糖核酸酶分解產(chǎn)物所激活，識(shí)別相對(duì)較短的雙鏈RNA（小于1kb），MDA5 識(shí)別長(zhǎng)的雙鏈 RNA（大于 2kb）。由于RIG-I和MDA-5是屬于細(xì)胞質(zhì)的解螺旋酶類，具有認(rèn)識(shí)特殊的非自身的抗病毒RNA標(biāo)記物，能通過線粒體銜接蛋白信號(hào)通路促發(fā)抗病毒的免疫反應(yīng)，起到抗病毒作用，達(dá)到控制和清除病原體，減輕炎癥反應(yīng)、預(yù)防免疫介導(dǎo)的組織損傷的作用[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)，血清RIG-I蛋白的濃度在毛細(xì)支氣管炎組急性期高于急性上呼吸道感染組且高于對(duì)照組（P＜0.01），提示模式識(shí)別受體RIG-I在病毒感染后提升，不同的感染部位或不同病毒其表達(dá)水平也不一樣，支持RIG-I通過提升其表達(dá)水平起到清除病原體的作用。在毛細(xì)支氣管炎組，隨著病情的恢復(fù)RIG-I水平也隨之下降，提示在疾病的不同階段RIG-I的表達(dá)也不同，表明它與病情相關(guān)。相似的結(jié)果也見于其他的研究，在流感A型病毒感染后，肺組織RIG-1 mRNA的表達(dá)水平下降，認(rèn)為肺組織損傷、凋亡和水通道的改變與RIG-信號(hào)通路有關(guān)[9]。在RSV感染小鼠后，肺組織RIG-I和MDA-5蛋白表達(dá)水平也增加，與肺組織蛋白酶類表達(dá)增加相關(guān)[10]。病毒感染的鼻炎患者鼻部上皮細(xì)胞的Toll樣受體、RIG-I和MDA-5的表達(dá)增強(qiáng)，共同參與識(shí)別和清除由于病毒入侵引起的炎癥反應(yīng)，其表達(dá)水平與病毒誘導(dǎo)的鼻黏膜炎癥加重有關(guān)，其機(jī)制可能是促進(jìn)鼻黏膜分泌增加IFN-β[11]。

本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，毛細(xì)支氣管炎組急性期和急性上呼吸道感染組血清MDA-5蛋白的濃度均高于對(duì)照組（P＜0.01），提示MDA-5也隨病毒感染后提升，支持MDA-5能通過提升其表達(dá)水平起到清除病原體的作用。在毛細(xì)支氣管炎組急性期和急性上呼吸道感染組MDA-5蛋白的濃度無差別，提示MDA-5對(duì)RSV和流感病毒的感染反應(yīng)沒有特異性。在毛細(xì)支氣管炎組恢復(fù)期，MDA-5蛋白的濃度低于急性期，支持MDA-5水平與病情相關(guān)，隨著病情的恢復(fù)也隨著下降。MDA-5表達(dá)水平變化也見于其他的報(bào)道。在小鼠鼻內(nèi)接種流感病毒A型后3天，病毒感染的癥狀加重，鼻黏膜RIG-I和MDA-5的mRNA和蛋白濃度顯著增加[12]。通過相關(guān)分析，RIG-I和MDA-5表達(dá)呈顯著直線正相關(guān)（P＜0.01），提示模式識(shí)別受體之間具有協(xié)同作用，共同參與病毒感染的炎癥機(jī)制。

綜上所述，在呼吸道感染嬰幼兒血清模式識(shí)別受體RIG-I和MDA-5表達(dá)增加，可能共同參與清除病毒感染，其表達(dá)水平隨著病情恢復(fù)而相應(yīng)下降。[本研究受浙江省溫嶺市科技局基金資助項(xiàng)目（No.2015-1-58）支持。第一作者蔣珍鳳現(xiàn)單位為溫嶺市中醫(yī)院兒科。]