斑禿患者外周血Th9細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)及意義

趙穎 盛友漁 胡瑞銘 趙俊 芮文龍 齊思思 楊勤萍

復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科 復(fù)旦大學(xué)皮膚病研究所，上海 200040

通常認(rèn)為斑禿是一種T細(xì)胞介導(dǎo)的累及毛囊的器官特異性自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制涉及遺傳學(xué)、自身免疫學(xué)、精神因素和微量元素缺乏等［1-2］，但其確切病因及分子機(jī)制尚不明確。Th9細(xì)胞是近年來新發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞，以分泌白細(xì)胞介素9（IL-9）為特點(diǎn)，參與多種疾?。[瘤、自身免疫性疾病以及病原體介導(dǎo)的免疫相關(guān)疾病）的發(fā)病，發(fā)揮免疫應(yīng)答及免疫調(diào)節(jié)作用［3］。斑禿皮損病理顯示有大量淋巴細(xì)胞浸潤，以CD4+T細(xì)胞為主［4］。既往也有T細(xì)胞失衡參與斑禿發(fā)病的報(bào)道［5］。本研究通過檢測(cè)斑禿患者外周血中Th9細(xì)胞比例、IL-9及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子的水平，探討其在斑禿發(fā)病中的臨床意義。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象與分組

選取2017年5-12月就診于復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科門診的74例斑禿患者作為斑禿組，男30例，女44例，年齡14～69（39.30±1.59）歲。其中重癥40例，輕癥34例；活動(dòng)期56例，穩(wěn)定期18例；病程＜6個(gè)月51例，＞6個(gè)月23例。57例本院健康體檢者作為對(duì)照組，排除重大系統(tǒng)性疾病及感染性、腫瘤性、自身免疫性及過敏性疾病，男22例，女35例，年齡18～64（38.63±1.67）歲。兩組性別、年齡構(gòu)成差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

斑禿組納入標(biāo)準(zhǔn)：①性別不限；②年齡16～70歲；③根據(jù)臨床表現(xiàn)符合斑禿診斷，即皮損表現(xiàn)為圓形或橢圓形、邊界清楚的非瘢痕性脫發(fā)斑片。排除標(biāo)準(zhǔn)：①由其他疾病引起的脫發(fā)，如拔毛癖、瘢痕性脫發(fā)、頭癬、休止期脫發(fā)、梅毒性脫發(fā)等；②合并其他嚴(yán)重的系統(tǒng)性疾病，如嚴(yán)重高血壓、糖尿病、心臟病、腎功能不全、精神疾病史等；③合并感染性、腫瘤性、自身免疫性及過敏性疾病，如銀屑病、自身免疫性甲狀腺炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、特應(yīng)性皮炎及哮喘等；④1個(gè)月內(nèi)曾系統(tǒng)性使用免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素、羥氯喹等；⑤妊娠及哺乳期婦女。

74例斑禿患者根據(jù)病情嚴(yán)重程度又分為2組：脫發(fā)面積≤49%者為輕癥組，＞49%者為重癥組。根據(jù)Olsen的脫發(fā)嚴(yán)重度（SALT）評(píng)分［6］分為S1～S5級(jí)，其中S1級(jí)21人，S2級(jí)13人，S3級(jí)20人，S4級(jí)13人，S5級(jí)7人。根據(jù)患者病程，分為＜6個(gè)月組，＞6個(gè)月組。根據(jù)疾病活動(dòng)性分為活動(dòng)期和穩(wěn)定期：在脫發(fā)斑片邊緣施力牽拉約50～60根頭發(fā)，重復(fù)數(shù)次，若脫發(fā)根數(shù)超過10%判定為牽拉試驗(yàn)陽性，表示病情呈活動(dòng)性；反之陰性，代表病情穩(wěn)定［7］。本研究方案符合世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)2000年版赫爾辛基宣言，并獲得華山醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批件號(hào)：（2011）臨審第（278）號(hào)。所有研究對(duì)象均充分了解試驗(yàn)內(nèi)容，并簽署知情同意書。

二、方法及試劑

1.主要試劑與儀器：流式細(xì)胞儀（美國BD公司），酶標(biāo)儀（美國Thermo公司），F(xiàn)icoll-Paque PLUS淋巴細(xì)胞分離液（美國GE公司），ELISA試劑盒（上海威奧生物科技有限公司），IL-9-PE、人CD4-FITC抗體、IL-17A-PerCP-Cy5.5（美國BD公司）。

2.ELISA檢測(cè)外周血細(xì)胞因子水平：取受試者外周血3 ml，離心取上清液用于IL-9、IL-4、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）、γ干擾素（IFN-γ）檢測(cè)。參照ELISA試劑盒說明操作，用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)量吸光度（A值），根據(jù)樣品A值計(jì)算相應(yīng)細(xì)胞因子含量。

3.Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）：取肝素鈉抗凝外周血4 ml，用磷酸鹽緩沖液（PBS）等倍稀釋，混勻。取4 ml淋巴細(xì)胞分離液置于15 ml離心管中，管壁傾斜45度，將稀釋全血緩慢滴入淋巴細(xì)胞分離液的液面上，800×g離心20 min。吸取中間懸浮的白色云霧狀細(xì)胞層為PBMC，PBS洗滌PBMC，400×g離心7 min，棄上清液。PBS再洗滌1次，300×g離心10 min，收集細(xì)胞，-80℃保存。

4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+IL-9+細(xì)胞比例：復(fù)蘇、收集PBMC（1×106～5×106個(gè)細(xì)胞），用RPMI 1640重懸至1 ml，加入6孔培養(yǎng)板，再分別加入含20%胎牛血清的RPMI 1640 1 ml，每孔加入細(xì)胞刺激劑4μl，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4.5 h。吸出細(xì)胞懸液到離心管中，350×g離心5 min，去上清液，加1 ml PBS重懸；再次350×g離心5 min，去上清液，加1 ml PBS重懸后備用；取100μl細(xì)胞加入EP管中，同時(shí)加入表面抗體FITC-CD4，4℃避光孵育15 min；1 ml PBS重懸，350×g離心5 min，去上清液，加1 ml固定液，避光放置50 min；加入1 ml破膜液，350×g離心5 min，去上清液；再次加入1 ml破膜液，350×g離心5 min，去上清液；胞內(nèi)抗體染色（IL-9抗體和IL-17A抗體）15 min；1 ml破膜液重懸，350×g離心5 min，去上清液，300μl破膜液重懸，上機(jī)檢測(cè)，細(xì)胞收集10 000個(gè)，中速收集，定義CD4+IL-9+IL-17-細(xì)胞為Th9細(xì)胞。

5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)IL-9及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子mRNA的表達(dá)：收集PBMC，每5×106細(xì)胞加入1 ml Trizol充分吹打混勻，加入200μl氯仿提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA。參照Gene Bank數(shù)據(jù)庫中目的基因PU.1及IL-9序列，用NCBI Primer-blast設(shè)計(jì)引物，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。PU.1上游引物序列：5′-CCAGCTCAGATGAGGAGG AG-3′，下游引物序列：5′-CAGGTCCAACAGGAACTGGT-3′；IL-9上游引物：5′-CCTCTGAC AACTGCACCAGA-3′，下游引物序列：5′-CATGGCTGTTCAC AGGAAAA-3′；內(nèi)參基因β肌動(dòng)蛋白上游引物序列：5′-GCAGAAGGAGATCA CTGCCCT-3′，下游引物序列：5′-GCTGATCCACAT CTGCTGGAA-3′。PCR反應(yīng)體系（10μl）：H2O 1.5μl，2×SYBGEEN PCR mix 5μl，上下游引物（10 nmol/L）各0.5μl，cDNA 2.5μl。反應(yīng)條件：95℃2 min，95℃5 s，60℃10 s，共45個(gè)循環(huán)，繪制熔解曲線。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)RT-PCR的擴(kuò)增曲線和熔解曲線，記錄CT值進(jìn)行PCR定量分析，采用2-△△Ct法分析目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。

三、統(tǒng)計(jì)分析

Excel 2017錄入數(shù)據(jù)，SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，Graphpad prism 6軟件繪制統(tǒng)計(jì)圖，結(jié)果用±s表示。兩組獨(dú)立樣本的比較，正態(tài)分布資料使用t檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、斑禿患者與健康對(duì)照血清中細(xì)胞因子水平

斑禿組血清IL-9水平顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），而TGF-β1及IFN-γ水平顯著高于對(duì)照組（均P＜0.05）。兩組IL-4水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 斑禿患者血清中Th9細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子水平（±s，ng/L）

表1 斑禿患者血清中Th9細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子水平（±s，ng/L）

組別斑禿組對(duì)照組t值P值例數(shù)74 57白細(xì)胞介素9 190.40±12.33 288.10±17.38 4.71＜0.01白細(xì)胞介素4 19.65±4.80 21.29±3.22 0.27＞0.05轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 6 191.00±355.50 4 026.00±258.00 4.41＜0.01 γ干擾素15.71±3.00 8.79±0.60 2.00＜0.05

斑禿活動(dòng)期組與穩(wěn)定期組、病程＜6個(gè)月組與＞6個(gè)月組IL-4、TGF-β1及IFN-γ水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。重癥與輕癥組IL-9、IL-4及TGF-β1水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但重癥組IFN-γ水平低于輕癥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.02），見表2。Spearman相關(guān)分析顯示，斑禿患者IFN-γ水平與SALT分級(jí)呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.298，P=0.010），與疾病活動(dòng)（rs=-0.068，P=0.566）及病程（rs=0.168，P=0.152）無顯著相關(guān)性。

二、斑禿患者PBMC中Th9細(xì)胞比例

斑禿組Th9細(xì)胞占（1.22±0.14）%，對(duì)照組為（1.67±0.18）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.04，P=0.045），見圖1。斑禿患者Th9細(xì)胞比例與疾病活動(dòng)情況（rs=0.124，P=0.427）、病程（rs=-0.104，P=0.507）及SALT分級(jí)（rs=0.020，P=0.901）均無顯著相關(guān)性。

表2 不同疾病活動(dòng)情況、病程及脫發(fā)面積斑禿患者的細(xì)胞因子水平（±s，ng/L）

表2 不同疾病活動(dòng)情況、病程及脫發(fā)面積斑禿患者的細(xì)胞因子水平（±s，ng/L）

注：a P＞0.05；b P＜0.05

分組疾病活動(dòng)情況活動(dòng)期穩(wěn)定期t值病程＜6個(gè)月＞6個(gè)月t值脫發(fā)面積重癥（＞49%）輕癥（≤49%）t值例數(shù)白細(xì)胞介素9白細(xì)胞介素4轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 γ干擾素56 18 182.60±13.58 214.50±27.94 1.11a 20.92±5.71 15.72±8.79 0.46a 6 466.00±382.50 5 459.00±777.30 1.27a 15.85±3.46 15.31±6.16 0.08a 51 23 186.40±15.37 199.30±20.67 0.48a 15.83±4.98 28.13±10.80 1.19a 6 505.00±427.40 5 417.00±548.20 1.40a 14.29±2.45 18.86±8.06 0.70a 40 34 186.50±15.59 195.00±19.81 0.34a 11.02±2.65 29.81±9.77 1.99a 6 061.00±480.00 6 339.00±535.70 0.39a 9.28±1.94 23.29±5.90 2.40b

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)斑禿患者與對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞中CD4+IL-9+T細(xì)胞比例1A：斑禿組；1B：對(duì)照組

三、斑禿患者PBMC中Th9相關(guān)mRNA表達(dá)

斑禿組PBMC中IL-9 mRNA相對(duì)含量（1.97±0.18）及PU.1 mRNA相對(duì)含量（1.48±0.10）均顯著低于對(duì)照組（2.79±0.41、1.89±0.17），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.12、2.178，P=0.037、0.032）。Spearman相關(guān)分析顯示，斑禿患者PBMC中IL-9 mRNA相對(duì)含量與斑禿疾病活動(dòng)情況（rs=-0.120，P=0.351）、病程（rs=0.034，P=0.794）及SALT分級(jí)（rs=-0.071，P=0.579）均無顯著相關(guān)性，且PU.1 mRNA相對(duì)含量與斑禿疾病活動(dòng)情況（rs=-0.056，P=0.662）、病程（rs=-0.029，P=0.822）及SALT分級(jí)（rs=-0.102，P=0.429）亦無顯著相關(guān)性。

討 論

目前大部分學(xué)者認(rèn)同的斑禿免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制是生長(zhǎng)期毛囊的“免疫赦免”被破壞繼而引起T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)［4］。T淋巴細(xì)胞被激活后，分泌大量炎癥因子作用于毛囊，引起毛囊細(xì)胞損傷，最終導(dǎo)致毛發(fā)的脫落。Th9細(xì)胞是最新發(fā)現(xiàn)的Th細(xì)胞亞型，分泌細(xì)胞因子IL-9，其特異性轉(zhuǎn)錄因子是PU.1。Th9細(xì)胞具有多種調(diào)節(jié)能力，在免疫過程中起著重要作用。IL-9與細(xì)胞表面的IL-9受體（IL-9R）結(jié)合，激活酪氨酸激酶JAK激酶磷酸化，進(jìn)一步引起轉(zhuǎn)錄因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）的磷酸化活化［8］，JAK/STAT信號(hào)通路的激活參與多種炎癥性及自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展。IL-9可促進(jìn)肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、原始淋巴樣細(xì)胞等在皮損部位聚集、活化，參與特應(yīng)性皮炎的發(fā)?。?］。Th9細(xì)胞及其效應(yīng)因子參與銀屑病的免疫病理機(jī)制，IL-9可誘導(dǎo)IL-17依賴的銀屑病樣皮膚炎癥及血管增生［10］。另有研究表明［11］，IL-9可能通過對(duì)Th17細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用在系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病中起重要作用。

本研究顯示，斑禿患者外周血中Th9細(xì)胞比例較健康對(duì)照組降低，IL-9、PU.1轉(zhuǎn)錄水平及血清IL-9水平亦降低。Th9細(xì)胞的分化及IL-9分泌均需要TGF-β、IL-4及其他協(xié)同刺激分子的刺激［12］。本研究結(jié)果顯示，斑禿患者外周血中TGF-β1水平顯著高于對(duì)照組，而IL-4水平低于對(duì)照組，其差異雖未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)水平，但其協(xié)同其他共刺激分子促進(jìn)IL-9分泌的作用可能降低。此外，斑禿患者外周血中抑制IL-9分泌的IFN-γ水平明顯升高。這些結(jié)果均提示，Th9細(xì)胞減少及其相關(guān)細(xì)胞因子缺乏可能參與了斑禿的發(fā)病。目前已明確Th9細(xì)胞可歸巢并定植于皮膚組織中［13］，IL-9可促進(jìn)Treg細(xì)胞的存活并增強(qiáng)其抑制功能［14］，而Treg細(xì)胞對(duì)維持毛囊的免疫耐受狀態(tài)有重要作用［15］。因此，我們推測(cè)斑禿患者IL-9水平較健康人降低，使患者Treg細(xì)胞的抑制功能降低，從而破壞毛囊的免疫耐受狀態(tài)，導(dǎo)致脫發(fā)的發(fā)生。

既往有研究提示［16］，斑禿患者皮損中IL-9基因表達(dá)高于對(duì)照組，但本研究顯示，斑禿患者外周血IL-9 mRNA和血清水平均低于健康對(duì)照組，原因有待進(jìn)一步研究。本課題組將進(jìn)一步對(duì)大樣本量斑禿患者皮損中Th9細(xì)胞及IL-9進(jìn)行相關(guān)研究，探索Th9細(xì)胞在斑禿發(fā)病中的作用。