孤獨癥細胞模型應用研究進展

何雪玲，張應花

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院基礎醫(yī)學院解剖學教研室 新鄉(xiāng)市分子神經(jīng)病學重點實驗室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

孤獨癥是一種復雜、普遍的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙性疾病，多在3歲前發(fā)病，其病因復雜，臨床表型和遺傳異質(zhì)性明顯。目前對孤獨癥的研究主要借助于動物模型和細胞模型。孤獨癥動物模型容易制作，但干擾因素較多，表型多樣且造模周期長。孤獨癥體外細胞模型種類多樣，比較常用的細胞系有腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞、人神經(jīng)母細胞瘤 SH-SY5Y 細胞、原代神經(jīng)元、淋巴細胞系及誘導的多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)。孤獨癥細胞模型的建立能彌補動物模型的不足，具有可操作性強、周期短等優(yōu)點，對闡明孤獨癥發(fā)病機制、發(fā)現(xiàn)藥物作用新靶點、研發(fā)與篩選新藥以及評價新藥療效有重要意義。本文就孤獨癥細胞模型的應用及其相關病理機制研究進展加以綜述。

1 PC12細胞

腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞是1976年Greene和Tisehler從大鼠腎上腺髓質(zhì)瘤中移植出的單克隆細胞株[1]，其在常規(guī)條件下可作為一種兒茶酚胺樣細胞，具有增殖細胞的一些特性。PC12細胞可在神經(jīng)生長因子誘導下增殖并分化為交感神經(jīng)樣細胞，其形態(tài)、生理及生物化學功能接近神經(jīng)元。PC12細胞已作為一種研究神經(jīng)發(fā)育的標準體外細胞模型廣泛應用于帕金森病、阿爾茨海默癥等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究。

孤獨癥是神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病，其發(fā)病機制與突觸功能異常有關[2-3]，神經(jīng)信號蛋白(neuroligins，NLGNs)通過與突觸前、后神經(jīng)元聯(lián)系并介導信號的傳導，參與神經(jīng)網(wǎng)絡的形成、可塑性及成熟[4]。NLGNs上的R451C基因可參與孤獨癥的發(fā)病[5]。ULBRICH等[6]利用NLGN3轉(zhuǎn)染PC12 Tet-On細胞，并使用多西環(huán)素誘導PC12 Tet-On細胞過表達NLGN3，進行體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，R451C突變可引起NLGN3蛋白在細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)聚集，并導致氧化應激異常；且?guī)в型蛔冃蚏451C的PC12細胞的氧化應激標志物C/EBP同源蛋白、蛋白78含量高于野生型鼠來源的PC12細胞，這一結(jié)果與氧化應激參與孤獨癥的發(fā)病機制是一致的[7]。孤獨癥的發(fā)病機制復雜，影響因素多樣，研究顯示，人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome，PTEN)與多巴胺功能障礙和孤獨癥破壞性行為有關，PTEN基因缺失有利于多巴胺神經(jīng)元的存活及功能恢復[8-9]，而多巴胺在調(diào)節(jié)運動、學習、行為、情緒和社會交往中起重要作用。HE等[10]研究顯示，孤獨癥模型小鼠酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)和多巴胺受體增加，導致磷酸化蛋白激酶B(phosphate protein kinase B，P-PKB)增加，推測孤獨癥的發(fā)生與磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositide 3-kinases，PI3K)信號通路下游靶基因PTEN突變有關；利用Tet-On啟動子處理PC12細胞，發(fā)現(xiàn)Tet-On PC12細胞中PTEN表達量低于野生型PC12細胞，TH、P-PKB、磷酸化環(huán)磷腺苷效應元件結(jié)合蛋白(phosphatase cAMP-response element binding protein，P-CREB)均升高；PI3K抑制劑LY294002及血清饑餓處理后的PC12細胞中TH、P-PKB、P-CREB表達降低；提示孤獨癥發(fā)生過程中PTEN可通過抑制PI3K/CREB通路使TH表達降低，為治療孤獨癥提供了針對PTEN-TH-多巴胺通路的靶向藥物。

因PC12細胞具有較高的同質(zhì)性，已廣泛應用于神經(jīng)細胞分化、離子通道、受體、遞質(zhì)分泌的各種研究中，PC12細胞模型為研究孤獨癥提供潛在的平臺。由于PC12細胞是一種腫瘤細胞，經(jīng)過多次傳代，其形狀和性狀會發(fā)生改變，所以，在將PC12細胞模型應用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機制和藥物作用機制的研究時應慎重。

2 SH-SY5Y細胞

SH-SY5Y 細胞來源于人神經(jīng)母細胞瘤株，具有類似神經(jīng)元的形態(tài)和生理、生物化學特性，增殖迅速，可連續(xù)穩(wěn)定傳代，其神經(jīng)外胚層譜系是適合研究神經(jīng)發(fā)育過程中神經(jīng)表型和神經(jīng)退行性疾病的細胞模型[11]，且具有成本低、易于培養(yǎng)分化、再生性和重現(xiàn)性較好等優(yōu)點，被廣泛應用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機制的研究[12]。

近年來，隨著基因組分析技術的運用，研究者發(fā)現(xiàn)，孤獨癥患者血漿和腦脊液中存在多種microRNA表達異常[13]。脆性綜合征為孤獨癥類型中的一種，包括miR-19b-3p在內(nèi)的多種microRNA能調(diào)控脆性綜合征相關基因[14]。為研究 miR-19b-3p與脆性綜合征相關基因的關系，MA等[14]以SH-SY5Y細胞為模型進行研究發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染NC mimic的SH-SY5Y細胞比較，轉(zhuǎn)染 miR-19b-3p mimic的SH-SY5Y 細胞的靶基因RAB18、USP32表達上升，而靶基因FXR1、DUSP 表達下降，提示miR-19b-3p有望成為治療孤獨癥的新靶點。另有研究顯示，孤獨癥患者血漿和腦脊液中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平增加，提示TNF-α可能是孤獨癥的生物標志物[15]。KALKAN等[16]利用TNF-α干預SH-SY5Y細胞，發(fā)現(xiàn)SH-SY5Y 細胞內(nèi)caspase-3蛋白表達水平增加，引起神經(jīng)元凋亡，進而導致神經(jīng)元缺失，這一現(xiàn)象與孤獨癥動物模型大腦神經(jīng)元缺失是一致的[2]，提示可以用TNF-α干預SH-SY5Y細胞以研究孤獨癥有關神經(jīng)元缺失的發(fā)病機制。

SH-SY5Y細胞作為神經(jīng)毒性模型可用于直觀研究與疾病有關的突觸異常及相關蛋白的表達，實驗簡便，可操作性及重復性較好，但也存在一些問題：首先，與其他細胞模型相比，SH-SY5Y細胞不能應用于觀察神經(jīng)發(fā)育過程[17]；其次，SH-SY5Y細胞在實驗過程中不斷增殖，數(shù)量不斷增加，很難檢測神經(jīng)保護劑或神經(jīng)毒性藥物是否影響細胞增殖率或細胞死亡率[18]；最后，與原代神經(jīng)元比較，未分化的SH-SY5Y細胞對神經(jīng)毒素和神經(jīng)保護劑的敏感性較小[19]。

3 原代神經(jīng)元

原代神經(jīng)元培養(yǎng)離體時間短，遺傳性狀與體內(nèi)細胞相似，適用于神經(jīng)元形態(tài)、功能和分化等研究。另外，原代神經(jīng)元比多次傳代的細胞更接近體內(nèi)神經(jīng)細胞的正常發(fā)育狀態(tài)，且該細胞具有干擾因素少和結(jié)果易于觀察等優(yōu)點，因此，原代神經(jīng)元體外培養(yǎng)成為研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病的常用方法。

Wnt/β-catenin信號通路參與調(diào)控個體發(fā)育早期階段神經(jīng)元增殖、分化、凋亡、遷移以及神經(jīng)元形態(tài)和神經(jīng)突觸的形成與聯(lián)系[20]。研究顯示，丙戊酸鈉(valproic acid，VPA)孤獨癥模型大鼠腦區(qū)Wnt/β-catenin 信號通路活化，而應用該通路的特異性抑制劑舒磷酸干預后其孤獨癥樣行為得到改善，提示W(wǎng)nt/β-catenin信號通路在孤獨癥的發(fā)生過程中起重要作用；同時發(fā)現(xiàn)，原代神經(jīng)元經(jīng)VPA 預處理后Wnt/β-catenin信號通路中關鍵信號分子β連環(huán)蛋白、磷酸化糖原合成酶激酶-3表達均上升，提示原代神經(jīng)元內(nèi)Wnt信號通路活化[21-22]。此外，孤獨癥患者體內(nèi)存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激異常[7]，導致神經(jīng)元成熟障礙。VPA干預的原代神經(jīng)元能夠較好地模擬孤獨癥患者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激異常狀態(tài)，并抑制原代細胞樹突和軸突長度，從而影響神經(jīng)元的發(fā)育成熟[23]。應用VPA預處理的原代神經(jīng)元所建立的孤獨癥細胞模型，為進一步揭示孤獨癥患者腦區(qū)存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激異常的機制提供了研究平臺。粘連蛋白突變可引起孤獨癥小鼠社會交互障礙[24]，提示粘連蛋白異常與孤獨癥發(fā)生有關聯(lián)[25]。進一步利用原代細胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，粘連蛋白并不影響突觸的數(shù)量，而是影響突觸的抑制性和興奮性功能[26]，提示粘連蛋白影響突觸功能，進而引起社會交互障礙等孤獨癥行為異常，可能導致對孤獨癥易感性增加。

與體內(nèi)試驗相比，原代神經(jīng)元培養(yǎng)具有簡便快速、條件易控制、藥理靶點與環(huán)節(jié)較為清晰等優(yōu)點，其不足之處在于不能完全模擬在體環(huán)境，限制了原代神經(jīng)元在神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究中的廣泛應用。

4 淋巴細胞系

淋巴細胞亞群分析是檢測細胞免疫和體液免疫功能的重要指標，總體反映機體當前的免疫功能、狀態(tài)和水平，并可輔助診斷某些疾病如自身免疫性疾病、免疫缺陷病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等，對研究發(fā)病機制、觀察療效及預后有重要意義。孤獨癥患者存在免疫系統(tǒng)異常[27]。丙酸 (propionic acid，PPA)是短鏈脂肪酸，能激活淋巴細胞系非典型性免疫，且對孤獨癥患者淋巴細胞系線粒體功能障礙有不同的調(diào)節(jié)作用[28]。FRYE 等[29]將孤獨癥患者的淋巴細胞暴露于不同濃度的PPA，發(fā)現(xiàn)1 mmol·L-1的PPA作用24、48 h能顯著改善淋巴細胞系線粒體功能障礙，且能上調(diào)免疫系統(tǒng)活化相關的基因，特別是涉及免疫球蛋白產(chǎn)生的基因。PPA還能增加海馬區(qū)膠質(zhì)纖維酸性蛋白免疫活性及促進小膠質(zhì)細胞和白細胞介素-6的活化[30]。ROSE等[31]利用男性孤獨癥患者淋巴細胞系進行研究發(fā)現(xiàn)，1 mmol·L-1的丁酸脂(butyrate，BT)能改變與線粒體裂變有關的磷酸酶及張力蛋白同源物誘導的蛋白激酶1、線粒體動力相關蛋白和生理應激有關的蛋白哺乳動物雷帕霉素靶蛋白、解偶聯(lián)蛋白2、缺氧誘導因子-1α，并能改變與認知和行為相關的基因CREB1、CamkinaseⅡ，表明BT在生理應激和(或)線粒體功能障礙的情況下可增強線粒體功能，改善疾病狀態(tài)下的能量代謝。BT能治療VPA引起的孤獨癥行為[31]，并對孤獨癥相關基因進行調(diào)控[32]，有望成為治療孤獨癥的新藥。

淋巴細胞是細胞遺傳學及分子遺傳學的主要研究材料，樣本容易獲取，但孤獨癥患者較分散，疾病的異質(zhì)性明顯，且淋巴細胞收集后不易保存，不能傳代培養(yǎng)，常需反復采集患者的樣品，再次取樣較難，給疾病的深入研究帶來困難。

5 iPSCs

iPSCs是日本科學家TAKAHASHI等[33]利用 Oct-4、Sox-2、Klf4、c-Myc等4個轉(zhuǎn)錄因子組合轉(zhuǎn)入分化的體細胞中，使其重編程而得到的類似于胚胎干細胞的一種細胞類型。近年來，國內(nèi)外利用iPSCs已成功構(gòu)建多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病細胞模型[34]，這些細胞模型帶有捐贈者的基因特征，能夠在體外表現(xiàn)出與體內(nèi)病理特征相似的疾病特點。孤獨癥患者的外周單核細胞經(jīng)過仙臺病毒載體重編程為iPSCs，提供了較好的孤獨癥細胞模型，能更好地應用于研究其病理機制、藥物治療、基因治療等[35]。

孤獨癥iPSCs細胞模型主要集中在祖細胞和神經(jīng)元的表型上[36]。RUSSO等[37]成功地用孤獨癥患者的乳牙牙髓干細胞編程將其分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞，與正常人的乳牙牙髓干細胞分化的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞比較，孤獨癥細胞模型所表達的與突觸有關的標志物神經(jīng)突觸素1、突觸后致密蛋白95均減少，而神經(jīng)元的標志物微管相關蛋白2表達無明顯變化。孤獨癥患者來源的星形膠質(zhì)細胞能產(chǎn)生較多的活性氧，體外培養(yǎng)96 h發(fā)現(xiàn)，細胞外谷氨酸含量增高，這與孤獨癥患者體內(nèi)存在氧化應激異常以及谷氨酸含量增加是一致的[38]。星形膠質(zhì)細胞異常能誘導孤獨癥的發(fā)生[39]。有研究將星形膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細胞可使神經(jīng)元的突觸長度變短及突觸相關蛋白表達減少，且星形膠質(zhì)細胞可以促進神經(jīng)元形態(tài)改變和突觸形成，與孤獨癥患者腦組織中存在星形膠質(zhì)細胞改變并能影響神經(jīng)元的異常是一致的[40]。

盡管使用iPSCs建立疾病模型具有很好的發(fā)展前景，但探尋更理想的種子細胞仍然是孤獨癥干細胞治療的重要課題。牙髓干細胞是來源于神經(jīng)嵴的牙源性干細胞，相比于其他干細胞，其具有更加明顯的神經(jīng)分化潛能，而且可自體取材，免疫原性低，在治療孤獨癥疾病方面更具有優(yōu)勢。但不足之處是，許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病使用iPSCs進行體外模擬時能從分子層面分析疾病相關蛋白的表達，但無法觀察到典型的病理表型；另一方面，制備iPSCs所使用的核心轉(zhuǎn)錄因子之一c-Myc 已經(jīng)被證明是癌基因，通過病毒轉(zhuǎn)染的方法引入外源基因，基因片段會隨機插入細胞基因組中，可能引發(fā)細胞癌變，因此，用iPSCs開展孤獨癥相關研究時應該嚴格控制其致瘤風險。

6 總結(jié)和展望

由于PC12細胞、SH-SY5Y細胞、原代神經(jīng)元、外周淋巴細胞系及iPSCs用于孤獨癥相關研究時各有利弊，限制了孤獨癥體外模型的廣泛應用。但隨著外顯子測序技術的發(fā)展，研究者利用CRISPR /Cas技術已成功建立了靈長類孤獨癥細胞模型，其細胞模型無論是形態(tài)上還是功能上都較接近人類細胞，對孤獨癥發(fā)病機制的研究將起到重要的推進作用[41]。由于道德觀念的約束，孤獨癥患者的標本難以得到，成功建立靈長類來源的孤獨癥細胞模型，對闡明孤獨癥發(fā)病機制及發(fā)現(xiàn)特異性標志物、藥物作用靶點、研發(fā)與篩選新藥以及評價新藥療效有重要意義。