成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子18對(duì)骨和軟骨發(fā)育

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(1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南 衡陽(yáng)421001；2.中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心/生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所,上海 200031；3.南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究室,湖南 衡陽(yáng)421001)

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Fibroblast growth factor，F(xiàn)GF) 家族是一組多功能信號(hào)分子，由22種結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白質(zhì)組成，其中的18種能夠作為配體結(jié)合到4種酪氨酸激酶受體上，另外4種(FGF11-14)屬于胞內(nèi)蛋白不與受體反應(yīng)。FGF存在于多種動(dòng)物中，包括線蟲、斑馬魚、老鼠和人類等，能調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和遷移，與機(jī)體的器官形成、組織重塑、神經(jīng)調(diào)控、血管生成和代謝調(diào)節(jié)有著密切的關(guān)系。FGF家族成員雖然結(jié)構(gòu)相似，但表現(xiàn)出不同的分泌方式、作用機(jī)制和生物學(xué)效應(yīng)。因此，它們被進(jìn)一步分成幾個(gè)亞家族。FGF18由Ohbayashi等人首先發(fā)現(xiàn)，它在結(jié)構(gòu)上與FGF8和FGF17最為相似，歸屬于一個(gè)亞型，是成人肺和正在發(fā)育的組織中的一種分泌信號(hào)分子。FGF18作為FGF家族中具有代表性的因子，在骨骼發(fā)育、軟骨形成和關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)中起著關(guān)鍵作用。

1 FGF18的受體

目前已知的有四種FGF受體(Fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR)，F(xiàn)GF配體能與細(xì)胞表面FGFR的硫酸乙酰肝素鏈結(jié)合，誘導(dǎo)受體二聚化，傳遞下游信號(hào)。FGF的功能與FGF受體表達(dá)的時(shí)間和空間密切相關(guān)。

FGFR1和FGFR2表達(dá)于發(fā)育的肢芽和骨中，并表現(xiàn)出相似的信號(hào)傳遞效應(yīng)。肢體間充質(zhì)FGFR1和FGFR2的失活將會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的骨骼發(fā)育不全。FGFR3則在增殖和預(yù)肥大的軟骨細(xì)胞中表達(dá)，抑制出生后軟骨發(fā)育。軟骨細(xì)胞FGFR3功能失活后的小鼠、綿羊和人表現(xiàn)出骨骼的過度生長(zhǎng)，而FGFR3激活則會(huì)導(dǎo)致軟骨的發(fā)育不全和異常[1]。在成骨前體細(xì)胞中特異性敲除Fgfr1和Fgfr2后，該小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的出生后缺陷，包括體重減輕、骨量減少、縱骨生長(zhǎng)受損，生長(zhǎng)板總長(zhǎng)度和增殖軟骨細(xì)胞帶的長(zhǎng)度明顯縮短[1]。另外，該小鼠出現(xiàn)的軟骨發(fā)育受損的表型，包括軟骨細(xì)胞增殖減少，基質(zhì)破壞，肥大區(qū)縮小等，作者認(rèn)為這是由于FGF9和FGF18的代償性上調(diào)，從而激活FGFR3負(fù)調(diào)控軟骨發(fā)育導(dǎo)致的。但也有研究認(rèn)為FGFR3能被FGF18激活，促進(jìn)未成熟的增殖軟骨細(xì)胞分裂，而缺乏FGF18的小鼠軟骨增殖則受到抑制[2]。

FGF18通過作用于FGFR4來(lái)調(diào)節(jié)自噬，進(jìn)而影響軟骨基質(zhì)的產(chǎn)生。生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞在出生后的發(fā)育過程中會(huì)誘發(fā)自噬，自噬能調(diào)節(jié)Ⅱ型膠原(Collagen typeⅡ,Col2)的分泌，而Col2是軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分[3]。而缺乏自噬相關(guān)基因7小鼠的前Ⅱ型膠原(typeⅡ procollagen，PC2)大量存儲(chǔ)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未釋放，而導(dǎo)致軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中的Col2纖維網(wǎng)形成缺陷。 這些結(jié)果說(shuō)明自噬參與了軟骨細(xì)胞的發(fā)育，接著他們證明了FGF18通過影響自噬，參與了這一過程。隨后他們發(fā)現(xiàn)沉默F(xiàn)gfr3和Fgfr4可以抑制FGF18對(duì)自噬的誘導(dǎo)作用，但是沉默F(xiàn)gfr1和Fgfr2沒有出現(xiàn)這一現(xiàn)象，并且只有Fgfr4敲除小鼠LC3水平降低。

2 FGF18相關(guān)信號(hào)通路

FGF與受體結(jié)合后會(huì)在質(zhì)膜上形成一個(gè)三分子復(fù)合物，從而激活下游分子并傳遞信號(hào)。FGF信號(hào)通路是脊椎動(dòng)物骨骼發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子，對(duì)骨和軟骨發(fā)育、骨礦化的動(dòng)態(tài)平衡等都起著關(guān)鍵作用[2]。FGF18相關(guān)信號(hào)通路總結(jié)于表1。

表1 FGF18相關(guān)信號(hào)通路

有研究發(fā)現(xiàn)，PHLPP1能抑制軟骨細(xì)胞的增殖、分化和基質(zhì)的產(chǎn)生，從而影響軟骨內(nèi)骨化。Phlpp1-/-小鼠Akt2活性增強(qiáng)，轉(zhuǎn)錄因子FoxO1水平降低，促進(jìn)FGF18表達(dá)，從而通過FGFR2刺激ERK1/2的磷酸化，促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖[4]。關(guān)節(jié)間區(qū)細(xì)胞的Hedgehog信號(hào)能選擇性地抑制β-catenin誘導(dǎo)的FGF18表達(dá)，從而引起一系列關(guān)節(jié)形態(tài)的改變，影響關(guān)節(jié)軟骨發(fā)育并誘發(fā)相關(guān)疾病[5]。小鼠軟骨細(xì)胞中選擇性敲除核轉(zhuǎn)錄因子7類似物2(transcription factor 7 like 2，TCF7L2)顯性負(fù)性突變亞型(也稱為dnTCF7L2)基因可以消除Hedgehog信號(hào)誘導(dǎo)的FGF18下調(diào)，故Hedgehog信號(hào)可能通過dnTCF7L2來(lái)調(diào)節(jié)β-catenin基因。另外，在小鼠骨關(guān)節(jié)炎(OA)模型中，β-catenin的激活可以削弱Hedgehog信號(hào)誘導(dǎo)的或手術(shù)誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨退化。這些結(jié)果說(shuō)明，Hedgehog通過選擇性抑制β-catenin靶基因的表達(dá)，直接影響了關(guān)節(jié)間區(qū)細(xì)胞以及關(guān)節(jié)軟骨的發(fā)展和疾病。

在對(duì)骨發(fā)育的研究中，F(xiàn)GF18通過上調(diào)成骨層骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(Bone morphogenetic protein2，BMP2)加速成骨過程[6]。他們?cè)谛∈筇后w內(nèi)植入重組人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子18(Recombinant human fibroblast growth factor18, rhFGF18)后發(fā)現(xiàn)BMP2特異性上調(diào)，而BMP拮抗劑rmNoggin可以抑制rhFGF18對(duì)成骨標(biāo)志物的刺激作用。Mahapatra，等提出膠原蛋白中一種介孔性質(zhì)的生物活性玻璃納米載體能大量穩(wěn)定地釋放FGF18，F(xiàn)GF18能與間充質(zhì)干細(xì)胞表面的BMP2結(jié)合，刺激下游信號(hào)分子Smad1/5/8的分泌，從而加速骨發(fā)育和骨基質(zhì)的形成[7]。

前文已經(jīng)提到自噬影響軟骨細(xì)胞外基質(zhì)形成，且FGF18參與了這一過程。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)gf18半敲小鼠與WT小鼠MAPK通路中各因子的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)的活性減低。之前文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)導(dǎo)過活性的JNK1可以磷酸化B-cell lymphoma-2(bcl-2)，使bcl-2與beclin-1分離，形成vps34-beclin-1復(fù)合物。研究者通過一些實(shí)驗(yàn)對(duì)這一通路進(jìn)行了驗(yàn)證，隨后對(duì)Fgf18半敲小鼠腹腔注射beclin-1激活劑，發(fā)現(xiàn)該小鼠的自噬恢復(fù)了正常。這表明FGF18能夠通過調(diào)節(jié)MAPK通路中的JNK1來(lái)影響自噬，從而影響軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的形成。

3 FGF18和骨骼發(fā)育

3.1 骨發(fā)育

脊椎動(dòng)物有膜內(nèi)骨化和軟骨內(nèi)骨化兩種成骨方式，膜內(nèi)骨化是由間充質(zhì)干細(xì)胞直接分化成骨原細(xì)胞，而軟骨內(nèi)骨化則是先在肢芽中形成初級(jí)骨化中心和次級(jí)骨化中心，再逐漸由骨組織取代。FGF18在這兩種機(jī)制中都起著重要作用。

大部分研究認(rèn)為FGF18對(duì)骨發(fā)育起正向刺激作用。Fgf18全敲小鼠骨骼發(fā)育異常，骨化延遲，且出現(xiàn)胚胎致死，且該小鼠肱骨骨橋蛋白和骨鈣素表達(dá)降低，股骨核心結(jié)合因子a1在骨小梁處表達(dá)降低，提示FGF18參與成骨細(xì)胞的成熟和增殖[8]，且該小鼠表現(xiàn)出的延遲骨化與軟骨細(xì)胞肥大延遲啟動(dòng)、軟骨形成早期增殖減少、骨骼血管化延遲、破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞向生長(zhǎng)板聚集過慢等有關(guān)。有觀察發(fā)現(xiàn)[9]，在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rat bone marrow mesenchymal stem cells，rBMSCs)中加入rhFGF18后，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的水平和礦化水平明顯上升，成骨分化標(biāo)志Col1a1,Bmp4,Runx2的表達(dá)增加，這說(shuō)明FGF18誘導(dǎo)了rBMSCs的成骨分化。細(xì)胞活力分析顯示，F(xiàn)GF18提高了rBMSCs的增殖活性，且隨劑量上升。Nagayama等[6]采用子宮手術(shù)將rhFGF18植入到小鼠胎兒的冠狀縫上以探討促成骨作用的機(jī)制。冠狀縫區(qū)包括發(fā)育中的額骨和頂骨的邊緣部分，且由縫隙間充質(zhì)隔開。rhFGF18通過促進(jìn)額骨與頂骨結(jié)構(gòu)域的連接而加速了骨的形成，使得縫隙間充質(zhì)消失。

與之前觀點(diǎn)相反的是Zhai等[10]認(rèn)為FGF18對(duì)骨發(fā)育起負(fù)調(diào)節(jié)作用。他們?cè)诤蠪GF18的成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞，第7天和第14天時(shí)ALP活性明顯降低，成骨相關(guān)基因包括Alp, Col1a1,骨鈣蛋白(Ocn)，骨唾液蛋白(Bsp)等的表達(dá)明顯被抑制。另外，該細(xì)胞的礦物沉積也明顯降低。

3.2 軟骨發(fā)育

軟骨是一種由軟骨細(xì)胞組成的特殊結(jié)締組織，這些軟骨細(xì)胞嵌入在含有膠原、蛋白多糖和非膠原蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)中。根據(jù)軟骨類型的不同，細(xì)胞外基質(zhì)的含量也不同，透明軟骨和彈性軟骨主要含有Ⅱ型膠原(Collagen typeⅡ,Col2)，而纖維軟骨主要含有Ⅰ型膠原(Collagen type Ⅰ，Col1a1)。

一些研究表明FGF18能促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和基質(zhì)的產(chǎn)生。Mori等[11]用微陣列分析比較了大鼠四種軟骨基因表達(dá)的差異，其中包括成年鼠的關(guān)節(jié)軟骨(Adult articular cartilage，AA)、成年鼠的生長(zhǎng)板軟骨(Adult growth plate cartilage，AG)、幼鼠的表層軟骨(Infant superficial layer，IS)和幼鼠的深層軟骨(Infant deep layer，ID)。結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄-定量聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcriptionquantitative polymerase chain reaction, RTqPCR)結(jié)果，他們篩選出16種基因在AA和IS中的表達(dá)高于AG和ID。在這些基因中同源異型盒基因D10、內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子-1和FGF18在AA中的表達(dá)高于IS。它們中FGF18的AA/AG比最高，且FGF18能明顯降低小鼠股骨頭軟骨黏多糖(Glycosaminoglycan，GAG)的釋放與耗竭，提高關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖能力。

Gigout等在細(xì)胞水平上分析了rhFGF18(又稱Sprifermin)對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的作用[12]，發(fā)現(xiàn)不同濃度的Sprifermin培養(yǎng)豬軟骨細(xì)胞后，軟骨細(xì)胞數(shù)量明顯增加，總GAG、Sox9的水平隨劑量增加，而Col1a1水平降低。且隨著Sprifermin濃度的增加，軟骨細(xì)胞不再表現(xiàn)為拉長(zhǎng)的形態(tài)，而是逐漸變成了圓形，通過間歇性給藥、持續(xù)性給藥以及僅一次給藥三種方式比較，間歇性給藥能使細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)量、兩種膠原的比例、Sox9的表達(dá)得到的更明顯的改善，在人受損關(guān)節(jié)軟骨，按受損程度輕重分為三組，Sprifermin處理后與之前實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本相一致，而受損最嚴(yán)重的一組Sprifermin治療效果相比之下不如受損較輕的組好。這些結(jié)果可以說(shuō)明FGF18正向調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖。但也有研究認(rèn)為FGF18負(fù)調(diào)控軟骨發(fā)育。Liu等[8]發(fā)現(xiàn)Fgf18全敲小鼠胚胎生長(zhǎng)板增殖區(qū)和肥大區(qū)擴(kuò)大，增殖區(qū)Brdu摻入量增加和肥大區(qū)COLX表達(dá)增加，提示FGF18對(duì)軟骨細(xì)胞的增殖和分化的作用是負(fù)向的。

4 FGF18與軟骨相關(guān)疾病的治療

關(guān)節(jié)軟骨主要由無(wú)血管的Col2和蛋白多糖基質(zhì)組成，成人的這種基質(zhì)是由相對(duì)較少的軟骨細(xì)胞分泌和維持的，因此關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)能力非常有限。創(chuàng)傷或感染引起的局灶性病變?nèi)绻荒芡耆?，就很容易迅速發(fā)展為骨關(guān)節(jié)炎。生長(zhǎng)因子是機(jī)體產(chǎn)生的一組具有生物活性的多肽，能刺激細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)和分化。生長(zhǎng)因子為局部關(guān)節(jié)軟骨缺損或更廣泛的軟骨缺損(如骨關(guān)節(jié)炎)的軟骨再生提供了新的治療方法。許多生長(zhǎng)因子在軟骨的損傷修復(fù)和骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展種起著非常重要的作用，其中就包括FGF18。

4.1 骨關(guān)節(jié)炎的治療

Reker等[13]用牛關(guān)節(jié)軟骨和臨床試驗(yàn)證明Sprifermin確實(shí)能影響關(guān)節(jié)軟骨的代謝，包括細(xì)胞的增殖，增加代謝活性和Col2的產(chǎn)生。但在關(guān)節(jié)軟骨預(yù)先激活炎癥反應(yīng)后這一效果就消失了，因此他們推測(cè)Sprifermin對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的治療依賴于炎癥發(fā)生之前。Mori[11]等對(duì)大鼠施行半月板撕裂術(shù)誘發(fā)骨關(guān)節(jié)炎，術(shù)后三周開始進(jìn)行關(guān)節(jié)內(nèi)注射rhFGF18。實(shí)驗(yàn)組分為兩類，一類每周注射一次持續(xù)三周，另一類僅注射一次。對(duì)照組從術(shù)后6周開始出現(xiàn)關(guān)節(jié)損害，至9周更加嚴(yán)重。連續(xù)注射組與對(duì)照組相比軟骨受損程度明顯減低，但單次注射組與對(duì)照組相比無(wú)明顯差別。且關(guān)節(jié)內(nèi)給藥后，血液中總rhFGF18水平極低，這表明rhFGF18對(duì)全身的潛在影響很小。Dahlberg等[14]首次將Sprifermin應(yīng)用于臨床試驗(yàn)，Sprifermin治療的病人沒有出現(xiàn)嚴(yán)重的安全問題，但還需要更廣泛的研究來(lái)證實(shí)。Lohmander等[15]對(duì)192位有癥狀的骨關(guān)節(jié)炎患者做了臨床試驗(yàn)，結(jié)果顯示股骨脛骨中間室的關(guān)節(jié)軟骨厚度與安慰劑組相比沒有明顯改變，但Sprifermin能劑量性依賴地降低股骨脛骨側(cè)面處軟骨厚度和體積以及關(guān)節(jié)間隙寬度的減少。Eckstein等[16]的臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示Sprifermin不僅能降低關(guān)節(jié)軟骨的磨損，還能增加關(guān)節(jié)軟骨的厚度。

4.2 手術(shù)損傷治療

在軟骨損傷修復(fù)的其他方面，F(xiàn)GF18也起著非常重要的作用。研究者對(duì)母羊施行微骨折手術(shù)，術(shù)后關(guān)節(jié)內(nèi)注射rhFGF18治療的山羊組織填充百分比和O’Driscol評(píng)分有明顯改善，軟骨樣組織增多。IHC染色結(jié)果顯示，Col2的修復(fù)組織染色比Col1a1更強(qiáng)，這表明關(guān)節(jié)內(nèi)已經(jīng)產(chǎn)生了成熟的透明軟骨修復(fù)組織[17-18]，且關(guān)節(jié)內(nèi)和膜內(nèi)注射無(wú)明顯差異，這表明Sprifermin在注射后可能通過膠原膜運(yùn)輸以促進(jìn)微骨折治療軟骨缺損的愈合。另有研究，在幼牛膝蓋軟骨中央?yún)^(qū)域制造了一個(gè)3mm的損傷，并在Sprifermin中培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)其膠原含量增加、核心軟骨與環(huán)狀軟骨的接觸面積增大[19]。這些結(jié)果說(shuō)明FGF18對(duì)關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)起著積極促進(jìn)的作用。但最近也有研究認(rèn)為FGF18對(duì)軟骨損傷后的合成代謝起負(fù)作用。但也有研究發(fā)現(xiàn)，未受損傷的人軟骨外植體在FGF18處理后，軟骨代謝相關(guān)基因的表達(dá)增加，而ACAN和COL2A1的表達(dá)降低。受損的人軟骨外植體在FGF18處理后，創(chuàng)傷誘導(dǎo)的MMP2、COL1A1、ACAN、COL2A1的表達(dá)都被明顯抑制[20]。兩組研究者者的結(jié)果為什么存在差異值得進(jìn)一步探討。

5 展 望

隨著人們對(duì)FGF18的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)的日益明確，研究認(rèn)為FGF18能對(duì)骨和軟骨發(fā)育起到正向調(diào)節(jié)的作用，這可能為骨關(guān)節(jié)炎的治療提供了新的契機(jī)，但其作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。