大面積重度燒傷患者CyclinB1、CyclinC及PCNA表達特征分析

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(襄陽市中心醫(yī)院，湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院整形美容科，湖北 襄陽 441021)

燒傷是指由熱液、蒸氣等所引起的組織損害[1]，嚴(yán)重者也可傷及皮下或/和黏膜下組織，根據(jù)燒傷面積及嚴(yán)重程度可將其分為不同程度的燒傷[2]。燒傷導(dǎo)致人體的第一道防疫屏障遭到破壞，同時腸道的機械、生物、免疫三大屏障功能亦遭到損害，機體內(nèi)環(huán)境紊亂，各組織臟器灌注不足，炎癥介質(zhì)釋放等，都為各種微生物的入侵提供了可能，這不僅導(dǎo)致皮膚組織的損傷，處理不當(dāng)時病情更趨危重，易引發(fā)一系列并發(fā)癥[3]。有研究發(fā)現(xiàn)[4-6]，細胞周期蛋白B1(CyclinB1)、細胞周期蛋白C(CyclinC)、增殖細胞核抗原(PCNA)的表達與細胞增殖有關(guān)，能加快細胞增殖，促進創(chuàng)面的愈合情況，本研究分析大面積重度燒傷患者創(chuàng)面組織中細胞周期蛋白CyclinB1、CyclinC以及增殖細胞核抗原(PCNA)的表達情況。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究中所有研究對象均來自我院收治大面積重度燒傷患者，收治時間均在2017年1月—2018年1月，根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)，共收集患者83例，根據(jù)患者預(yù)后情況分為生存組和死亡組。其中生存組45人，死亡組38人，生存組中男孩25例(60.87%)，女孩18例，平均年齡為(10.6±2.1)歲；死亡組中男孩16例(71.01%)，女孩13例，平均年齡為(9.3±2.7)歲。通過假設(shè)檢驗的，生存組患兒與死亡組患兒之間的所有基本資料的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)果見表1。收集所有患者的基本資料，主要有年齡、性別、燒傷總面積等信息，對其基本情況進行比較，并采集患者在治療期間的不同時間的創(chuàng)面標(biāo)本備用?；颊呒{入標(biāo)準(zhǔn)：①患者經(jīng)過診斷，確定為大面積重度燒傷患者；②患者年齡為16～60歲；③燒傷總體表面積(total body surface area,TBSA)≥50%；④獲得患者同意?；颊吲懦龢?biāo)準(zhǔn)：①燒傷時患者伴有胸腹部重要臟器損傷及嚴(yán)重顱腦外傷；②患者既往合并有重要臟器嚴(yán)重疾病；③臨床資料記錄嚴(yán)重不全者；④診療不配合者。根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)，將納入研究的83例患者根據(jù)患者病情發(fā)展情況分為不同組別，并收集所有患者的基本信息及相關(guān)指標(biāo)。

表1 生存組與死亡組患兒間基線資料的比較

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本采集 將83例大面積重度燒傷患者根據(jù)病情發(fā)展情況和結(jié)局分為生存組和死亡組。收集所有患者燒傷面積及傷后第1、2、3、5、7、9、13天，距離創(chuàng)面邊緣0.5cm處的創(chuàng)面標(biāo)本，為避免影響愈合，每次取創(chuàng)面標(biāo)本盡量避免破壞焦痂、結(jié)痂處，且對糜爛、化膿處及時予以消炎抗菌處理，每次取創(chuàng)面積約為0.3×0.3 cm。采用4%多聚甲醛將創(chuàng)面組織固定，石蠟包埋，備用。

1.2.2 標(biāo)本制備 所有采集標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋，4 μm切片。切片常規(guī)脫蠟、脫水，通過蘇木精—伊紅染色法(HE)對樣本行病理組織切片觀察。通過免疫組織化學(xué)法染色，石蠟切片常規(guī)脫蠟，采用3%的過氧化氫溶液常溫孵育20 min。水洗3次。用于PCNA檢測的染色切片置于pH為6.0的0.01mol/L的枸櫞酸鹽緩沖液中進行5min抗原微波修復(fù)，用PH為7.2的0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，之后加入1∶200的PCNA一抗，常溫孵育2h；用于CyclinB1和CyclinC檢測的染色切片經(jīng)EDTA高壓抗原修復(fù)2min，用PBS洗滌3次，之后分別加入1:50稀釋的CyclinB1一抗和1:200的CyclinC一抗，常溫孵育4h，滴加由生物素標(biāo)記的二抗，常溫孵育40min，PBS洗滌3次，通過DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片等備用。

1.3 觀察指標(biāo)

采用400倍光學(xué)顯微鏡下觀察制片結(jié)果，每個切片隨機選擇5個視野，運用德國全自動圖像分析系統(tǒng)(KONTRON IBAS2.5)進行免疫組化染色的定量分析，從而計算平均陽性單位值(PU)[7]。最后，觀察比較兩組患者的切片結(jié)果，判斷兩組之間的差異是否具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

通過Excel軟件對所有患者的資料，進行錄入和處理，運用SPSS17.0，選擇恰當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計指標(biāo)對患者基本資料進行統(tǒng)計描述；采用χ2檢驗對兩組患者的基線資料進行比較，判斷其是否均衡可比；通過t檢驗、方差分析或χ2檢驗等方法比較兩組患者創(chuàng)傷標(biāo)本的檢測結(jié)果，判斷差異是否具有統(tǒng)計學(xué)意義。無特殊情況下P<0.05，表示具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 兩組創(chuàng)面肉芽組織特征

兩組第13天肉芽組織的HE染色病理切片結(jié)果見圖1。死亡組肉芽組織較多，具有更多的炎性細胞、有較多的炎性細胞浸潤(如白色箭頭所指)核固碎等。

圖1 生存組與死亡組患者病理組織特征結(jié)果

2.2 兩組患者CyclinB1的檢測結(jié)果

首先檢驗兩組患者在不同治療時間的CyclinB1的檢測結(jié)果分布情況，發(fā)現(xiàn)檢測結(jié)果近似服從正態(tài)分布，采用兩獨立樣本t檢驗對檢測結(jié)果進行比較。結(jié)果顯示，患者創(chuàng)傷治療后的第1、2、3、5、7天時，兩組患者CyclinB1的檢測結(jié)果間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均有P<0.05)，并且在生存組中，治療后第3天的CyclinB1水平達到峰值(圖2.1)，而死亡組在第5天才達到峰值。結(jié)果見表2。

表2 兩組患者CyclinB1比較

2.3 兩組患者CyclinC的檢測結(jié)果

研究結(jié)果顯示，在治療后的第1、2、3、5、7天時，兩組患者創(chuàng)面標(biāo)本中CyclinC的檢測結(jié)果間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均有P<0.05)，9天和13天時，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均有P>0.05)，另外在生存組中，治療后第2天的CyclinC含量達到峰值(圖2.2)。具體情況詳見下表3。

2.4 兩組患者PCNA的檢測結(jié)果

通過統(tǒng)計學(xué)分析比較兩組患者在住院后不同時間的PCNA的檢測結(jié)果。結(jié)果顯示，在治療后的第2、3、5、7天時，兩組患者創(chuàng)面標(biāo)本中PCNA的檢測結(jié)果間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均有P<0.05)，且在1、9和13天時，兩組患者標(biāo)本中PCNA的檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均有P>0.05)；在生存組中，治療后第2天的PCNA含量達到峰值(圖2.3)，而死亡組在第3天達到峰值，且最高含量仍低于生存組。具體情況詳見下表4。

圖2 生存組與死亡組患者CyclinB1，CyclinC和PCNA結(jié)果

表3 兩組患者的CyclinC比較

表4 兩組患者的PCNA比較

3 討 論

燒傷是中國較為常見的一種意外傷害，雖然近些年來醫(yī)療技術(shù)得到了快速的發(fā)展，大大提高了燒傷患者的生存率，而大面積燒傷，通常使得人體防御體系的第一道防御屏障受到破壞，并且影響腸道的機械、生物以及免疫功能，常導(dǎo)致機體內(nèi)環(huán)境紊亂，各重要組織臟器血灌流量不足，釋放各種炎癥因子，神經(jīng)內(nèi)分泌功能及免疫功能紊亂，并且感染機率明顯提高，通常情況下患者病情會日趨嚴(yán)重，因此，目前大面積重度燒傷成為燒傷治療和研究的重點[2]。

皮膚燒傷創(chuàng)面的愈合是一種較為復(fù)雜的生物學(xué)過程，主要包括炎性反應(yīng)、細胞增生等基本過程[8]，而創(chuàng)面的愈合又受多種外界及內(nèi)在的影響和調(diào)控。細胞周期是細胞增殖和細胞生命活動的基本過程，而細胞周期蛋白的合成與分解在真核生物細胞周期的調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用。cyclin在細胞周期內(nèi)是不斷變化的，cyclin與細胞周期蛋白依賴激酶結(jié)合后成為具有活性的二聚體，進而調(diào)控細胞周期的進程[9]，研究發(fā)現(xiàn)，細胞周期蛋白B1與細胞周期蛋白G1是細胞分裂，生長過程中重要的調(diào)節(jié)因子，是細胞周期蛋白中較早發(fā)現(xiàn)并且在G2-M期產(chǎn)生重要作用的蛋白分子[15-16]。CyclinB1在細胞周期中的S晚期的細胞漿中，當(dāng)CyclinB1轉(zhuǎn)送至細胞核時，細胞進入G2期，因此認(rèn)為CyclinB1在細胞周期中的G2或M期起到重要的調(diào)控作用[10-12]，另外，CyclinC只表達于細胞周期的G1期中點，并在G1期發(fā)揮重要作用[10]；PCNA是分子量為36KD的酸性蛋白，主要表達于細胞周期中的S期，參與DNA的合成，存在于細胞核內(nèi)且在細胞核內(nèi)合成，細胞周期中反映DNA的復(fù)制、合成狀態(tài)，因此僅在增殖細胞的細胞核中表達，是判斷腫瘤細胞增殖狀態(tài)的標(biāo)志物及良好指標(biāo)[13-14,18-19]。在組織形成期(創(chuàng)傷后2～10天)，創(chuàng)面愈合中關(guān)鍵的效應(yīng)細胞—成纖維細胞迅速增殖，合成大量胞外基質(zhì)，填補組織缺損,創(chuàng)面細胞周期蛋白B1(cyclin B1)和增殖細胞核抗原(PCNA)表達，可以增加S+G2期細胞數(shù)目，從而加快創(chuàng)面細胞增殖，促進創(chuàng)面愈合[17]。

本文研究結(jié)果顯示，大面積重度燒傷患者在燒傷后治療期間，創(chuàng)面標(biāo)本中的CyclinB1、CyclinC和PCNA含量是不斷變化的。并且在1、2、3天和5天時，兩組患者CyclinB1和CyclinC的檢測結(jié)果差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(均有P<0.05)，且生存組分別在第3天和第2天含量達到峰值，與死亡組相比明顯提前，而PCNA在兩組中的檢測結(jié)果在2、3、5和7天時的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均有P<0.05)，生存組在第2天時含量達到峰值；另外，三個檢測指標(biāo)的檢測峰值在生存組均明顯高于死亡組，這很可能與細胞增殖速度，創(chuàng)面愈合情況相關(guān)[5]。根據(jù)本文結(jié)果表示CyclinB1、CyclinC和PCNA含量對患者的預(yù)后情況具有一定的評估價值，可作為大面積重度燒傷患者預(yù)后情況的指標(biāo)。