PI3Kp110β抑制劑對(duì)人舌鱗狀細(xì)胞癌CAL27細(xì)胞增殖與凋亡的影響

陳福海，鄭安元，溫思露，李芬，陶澤璋

舌鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma of tongue，TSCC)是口腔內(nèi)常見的惡性腫瘤，約占口腔癌的30%[1-2]，也是最常見的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)之一[3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年新增口腔癌病例4.81萬[4]，嚴(yán)重威脅著我國(guó)人民的身體健康。傳統(tǒng)的舌鱗狀細(xì)胞癌治療方法一般包括手術(shù)切除以及配合術(shù)后放療和化療等，但近30年來舌鱗狀細(xì)胞癌患者的總體生存率并沒有得到顯著提高，其5年生存率仍低于60%[5-7]。臨床研究表明，患者死亡的原因主要在于舌鱗狀細(xì)胞癌的局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[8]，因此尋找其機(jī)制及關(guān)鍵靶點(diǎn)有助于對(duì)患者進(jìn)行及時(shí)的早期治療，對(duì)改善患者預(yù)后具有非常重要的臨床意義。PI3K是PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)及上游分子[9-10]，并且有研究表明，在一系列因素的作用下，PI3K的異常激活可以引起其下游分子的激活[11]，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和血管生成等效應(yīng)[12-13]。因此抑制PI3K的活性可有效緩解上述效應(yīng)，有利于腫瘤的治療[14-16]。KIN-193是PI3Kp110β亞型的選擇性抑制劑，并且已有研究表明其細(xì)胞毒性較低，安全性較好[17]。因此，本實(shí)驗(yàn)觀察了人舌鱗狀細(xì)胞癌CAL27細(xì)胞在不同濃度KIN-193作用下的細(xì)胞增殖能力、凋亡程度以及形態(tài)學(xué)變化，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)細(xì)胞與試劑：人舌鱗狀細(xì)胞癌CAL27(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞資源中心)；澳洲Gibco胎牛血清(美國(guó)Invitrogen公司)；高糖DMEM、PBS、DMSO及0.25 %胰酶Trypsin(杭州吉諾生物公司)；細(xì)胞增殖和毒性檢測(cè)試劑盒CCK-8 (日本同仁化學(xué)研究所)；蛋白提取試劑盒、一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(碧云天生物公司)；Cell-LightTMEdU Apollo?567 In Vitro Imaging Kit(廣州銳博生物公司)；KIN-193(美國(guó)MCE，MedChemExpress公司)；目的蛋白抗體(美國(guó)Cell signaling tech公司)。(2)儀器設(shè)備：二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Scientific公司)；倒置顯微鏡(德國(guó)徠卡儀器有限公司)；全自動(dòng)顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)(美國(guó)LI-COR公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 2018年1—7月于武漢大學(xué)人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。人舌鱗狀細(xì)胞癌CAL27的培養(yǎng)及藥物濃度： CAL27細(xì)胞用含10%胎牛血清 (FBS) 及青霉素+鏈霉素溶液的高糖DMEM培養(yǎng)基20 μg/ml于37 ℃ 5 %CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用胰酶消化，分組培養(yǎng)。用DMSO溶解KIN-193配置10 mmol/L的母液，取適量KIN-193母液用完全培養(yǎng)基稀釋為終濃度為0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L、25 μmol/L、30 μmol/L的KIN-193溶液加入到對(duì)應(yīng)分組細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察： 人舌鱗狀細(xì)胞癌CAL27培養(yǎng)及KIN-193溶液共同培養(yǎng)48 h后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)并攝片記錄。

1.2.2 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡： 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CAL27細(xì)胞用胰酶消化后，取適量加入含有細(xì)胞爬片的24空板內(nèi)。第2天細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的KIN-193(0、10、20、30 μmol/L)，在37 ℃ 于5 %CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)48 h，然后應(yīng)用TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，在全自動(dòng)顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡并拍照記錄。

1.2.3 細(xì)胞存活能力檢測(cè)： 將CAL-27細(xì)胞懸液濃度調(diào)至2×107個(gè)/L，每孔加入100 μl到96空板內(nèi)，在37 ℃的 5 %CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。第2天細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的KIN-193(0、10、20、30 μmol/L)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，分24、48、72 h 3個(gè)時(shí)間段進(jìn)行培養(yǎng)，在對(duì)應(yīng)時(shí)間取CCK-8 10 μl加入到每孔中，并在37 ℃下孵育2 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定吸光光度值，計(jì)算相應(yīng)藥物濃度細(xì)胞存活率。

1.2.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力： 將CAL-27細(xì)胞懸液濃度調(diào)至1×107個(gè)/L，然后每孔加入250個(gè)細(xì)胞到6空板內(nèi)。第2天細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的KIN-193(0、10、20、30 μmol/L)，在37 ℃ 于5 %CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)12 d，然后PBS洗一遍六孔板，再用4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)計(jì)數(shù)細(xì)胞，計(jì)算克隆形成率(克隆形成率=細(xì)胞克隆形成數(shù)/原始種入孔內(nèi)細(xì)胞數(shù))。

1.2.5 細(xì)胞增殖能力： 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CAL27細(xì)胞用胰酶消化后，將適量的CAL27細(xì)胞加入含有細(xì)胞爬片的24空板內(nèi)。第2天細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的KIN-193(0、10、20、30 μmol/L)，在37 ℃于 5 %CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)48 h，然后應(yīng)用Cell-LightTMEdU Apollo?567 In Vitro Imaging Kit，在全自動(dòng)顯微鏡下觀察細(xì)胞增殖能力并拍照記錄。

1.2.6 細(xì)胞蛋白濃度： 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CAL27細(xì)胞用胰酶消化后傳代，將傳代好的細(xì)胞分成4組，第2天細(xì)胞貼壁后，分別加入終濃度為0 μmol/L(對(duì)照組)、10、20、30 μmol/L 的KIN-193溶液共同培養(yǎng)72 h。收集CAL27細(xì)胞，用裂解液裂解收集細(xì)胞，離心后取上清，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，調(diào)平蛋白濃度，加1/4總體積的4×LDS和1/10總體積的DTT，水浴變性蛋白，10 %凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，脫脂牛奶封閉，一抗4 ℃下孵育過夜，然后孵育二抗。采用Western-Bloting經(jīng)Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描，并分析處理顯影蛋白條帶。

2 結(jié) 果

2.1 CAL27細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變 隨著KIN-193濃度的增加，在倒置顯微鏡下觀察到CAL27細(xì)胞的貼壁數(shù)量依次減少，而漂浮死亡的細(xì)胞增多，細(xì)胞體積變小，細(xì)胞由長(zhǎng)條形變成圓形，且在細(xì)胞周圍出現(xiàn)許多突起，細(xì)胞邊界模糊不清，見圖1A(插頁Ⅰ)。

2.2 CAL27細(xì)胞凋亡的影響 在0、10、20、30 μmol/L的KIN-193干預(yù)CAL27細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組相比，加藥組綠色熒光更強(qiáng)，并且CAL27細(xì)胞的凋亡呈濃度依賴性增高 (F=7.428，P=0.000)，見圖1B(插頁Ⅰ)。

2.3 CAL27細(xì)胞存活能力 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著KIN-193作用濃度和時(shí)間的增加，CAL-27細(xì)胞的活力明顯被抑制 (24 h、48 h、72 h 的F值與P值分別為：F=6.682，P=0.001；F=14.428，P=0.000；F=38.549，P=0.000)，見圖2。

2.4 CAL-27細(xì)胞的克隆形成能力 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，KIN-193能夠明顯抑制CAL-27細(xì)胞的克隆形成能力，并且隨著藥物濃度增加而克隆形成數(shù)量減少(F=75.141，P=0.000)，見圖3(插頁Ⅰ)。

2.5 CAL27細(xì)胞增殖作用 EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著KIN-193作用的濃度增加，CAL-27細(xì)胞的增殖明顯被抑制，在KIN-193為30 μmol/L 時(shí)，對(duì)CAL27細(xì)胞的增殖抑制最強(qiáng)(F=6.885，P=0.000)，見圖4(插頁Ⅰ、Ⅱ)。

圖2 不同濃度KIN-193對(duì)CAL27細(xì)胞存活率的影響

2.6 CAL27細(xì)胞蛋白表達(dá) KIN-193干預(yù)CAL27細(xì)胞48 h后，隨著KIN-193藥物濃度的增加，CAL27細(xì)胞的 PI3Kp110β蛋白表達(dá)量明顯下降，且藥物作用的濃度越高，蛋白表達(dá)量下降的程度越大(F=4.312，P=0.04)，見圖5。

圖5 不同濃度KIN-193干預(yù)CAL27細(xì)胞72 h后 Western blotting的結(jié)果

3 討 論

目前惡性腫瘤成為一種常見疾病，舌鱗狀細(xì)胞癌作為常見的惡性頭頸部腫瘤之一，時(shí)刻危害著人類的健康。舌鱗狀細(xì)胞癌惡性程度較高，因其具有豐富的血液及淋巴循環(huán)，所以其通常在術(shù)后還會(huì)有較高的復(fù)發(fā)率并且容易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移[18]。舌鱗狀細(xì)胞癌較難早期診斷，一般發(fā)現(xiàn)時(shí)已是晚期，極大地危害著患者的生命。通常治療采取手術(shù)及術(shù)后放化療，但臨床上化療藥物不良反應(yīng)較大，并且因舌鱗狀細(xì)胞癌容易對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥，一般患者預(yù)后極差。

PI3K/Akt/mTOR已被證明在腫瘤生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[19-20]，抑制PI3K的活性可有效緩解上述效應(yīng)，有利于腫瘤的治療[21-23]。但目前大多PI3K抑制劑因抑制PI3Kp110亞基中的全部亞型(包括p110α、p110β、p110γ、p110δ)而使得其肝腎細(xì)胞毒性較大[24-26]，另外不可口服以及性質(zhì)不穩(wěn)定也使得其未能進(jìn)行更深入的研究，限制了它們?cè)谂R床上的使用。PI3K分子一般分為3型，其中I型PI3K研究最多，且與腫瘤的關(guān)系最為密切[27]。I型PI3K由調(diào)節(jié)性亞基p85及催化亞基p110組成，當(dāng)p85與p110結(jié)合減弱甚至分離時(shí)，PI3K中的p110亞基被激活發(fā)揮其生物學(xué)活性。因此，針對(duì)p110亞基的靶向治療有望成為將來新的治療靶點(diǎn)。目前在頭頸部腫瘤p110亞基的抑制劑中，p110α和p110δ抑制劑研究最多，而關(guān)于p110β及p110γ的抑制劑在頭頸部腫瘤中的研究目前尚未有報(bào)道。而KIN-193屬于PI3Kp110β的選擇性抑制劑，可有效抑制PI3Kp110β[28]，通過文獻(xiàn)檢索，目前KIN-193尚未在腫瘤中進(jìn)行大規(guī)模研究。因此，本文研究具有較強(qiáng)的創(chuàng)新性。另外有研究表明，PI3K信號(hào)通路不僅與其他腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，而且在舌癌的增殖遷移等過程中也發(fā)揮著重要作用[29-30]。因此，本研究觀察了人舌鱗狀細(xì)胞癌CAL27細(xì)胞在不同濃度的PI3Kp110β亞基抑制劑KIN-193作用下的細(xì)胞增殖能力、凋亡程度以及形態(tài)學(xué)方面的變化。

腫瘤的引發(fā)不僅是細(xì)胞異常增殖分化的結(jié)果，同時(shí)也是細(xì)胞凋亡調(diào)控障礙的結(jié)果，當(dāng)細(xì)胞的凋亡受到抑制，且不能恢復(fù)，就會(huì)導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞數(shù)量的增加，而引發(fā)腫瘤[31-34]。凋亡的調(diào)控是細(xì)胞生理死亡和腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制，對(duì)于各種刺激誘導(dǎo)下細(xì)胞凋亡機(jī)制的分析有助于深入了解腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)及發(fā)現(xiàn)新的治療對(duì)策。CCK-8實(shí)驗(yàn)及克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果都表明隨著KIN-193濃度的增加，CAL-27細(xì)胞存活率及增殖能力逐漸降低，這表明KIN-193可有效地抑制CAL-27細(xì)胞的增殖。進(jìn)一步的TUNEL染色實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化結(jié)果也表明KIN-193可促進(jìn)口腔腫瘤CAL-27細(xì)胞的凋亡。此外，本結(jié)果表明，KIN-193對(duì)PI3Kp110β的抑制作用隨著KIN-193濃度的增強(qiáng)而增強(qiáng)，且與不同濃度的KIN-193抑制CAL27細(xì)胞的增殖和促進(jìn)其凋亡的趨勢(shì)一致，這也提示著在人舌鱗狀細(xì)胞癌CAL27細(xì)胞的促增殖、抗凋亡的腫瘤特性在一定程度上與PI3K分子的p110β亞型的激活相關(guān)。但KIN-193具體是通過何種細(xì)胞凋亡途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡的，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。此外，本研究?jī)H停留在細(xì)胞水平，后續(xù)還需進(jìn)行KIN-193在體內(nèi)的效應(yīng)研究?？偠灾琄IN-193能夠有效地抑制口腔癌CAL27細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡。

利益沖突：無

作者貢獻(xiàn)聲明

陳福海：提出研究思路、設(shè)計(jì)研究方案、實(shí)施研究過程、分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)、論文撰寫和論文修改；鄭安元、李芬、溫思露：處理數(shù)據(jù)、論文修改；陶澤璋：課題設(shè)計(jì)、論文修改和論文審核