肝細(xì)胞生長因子對(duì)高糖誘導(dǎo)的腹膜纖維化的影響

修亦斌

[摘要] 目的 探討外源性肝細(xì)胞生長因子（Hepatocyte Growth Factor，HGF）對(duì)腹膜纖維化的影響。 方法 將HPMCs通過胰蛋白酶消化法從大網(wǎng)膜組織中分離并實(shí)施原代培養(yǎng)。后取第三代HPMCs，并在不同葡萄糖濃度（5.5、30、60 mmol/L D-葡萄糖）環(huán)境下持續(xù)培養(yǎng)48 h后對(duì)FN蛋白、TGF-β1水平進(jìn)行檢測、比較，并在60 mmol/L葡萄糖溶液中加入不同濃度的rhHGF（25、50、100 ng/mL）檢測FN蛋白、TGF-β1水平，檢測方式以ELISA方式開展。 結(jié)果 （1）HPMCs在高糖環(huán)境下TGF-β1、FN蛋白水平均較N組明顯增加（P<0.05），呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系（P<0.05）;（2）外源性HGF可對(duì)HPMCs在TGF-β1、FN的表達(dá)產(chǎn)生抑制效果（P<0.05），呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系（P<0.05）。 結(jié)論 高糖環(huán)境有利于促進(jìn)HPMCs的TGF-β1表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)HPMCs合成ECM;高糖誘導(dǎo)ECM過程可在外源性HGF影響下發(fā)生抑制，提示在腹膜纖維化過程中HGF具有抑制作用，為PD相關(guān)腹膜纖維化的預(yù)防及治療提供理論依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 高糖環(huán)境;人腹膜間皮細(xì)胞;肝細(xì)胞生長因子;纖維化

[中圖分類號(hào)] R587.2;R572? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2019）34-0018-03

Effect of hepatocyte growth factor on peritoneal fibrosis induced by high glucose

XIU Yibin

Emergency Department， Zhongshan Hospital of Xiamen University， Xiamen? ?361004， China

[Abstract] Objective To explore the effect of exogenous hepatocyte growth factor（HGF） on peritoneal fibrosis. Methods HPMCs were isolated from the greater omentum issue by tryps in digestion， and primary culture was carried out. After that， the third-generation HPMCs were and cultured continuously for 48 hours at different glucose concentrations（5.5， 30， 60 mmol/L D-glucose） and FN protein and TGF-β1 levels were detected， in the 60 mmol/L glucose environment added with rhHGF of different concentrations（25， 50， 100 ng/mL） and FN protein and TGF-β1 levels were detected and compared by ELISA. Results （1）TGF-β1 and FN protein levels of HPMCs in the high glucose environment were significantly increased compared with those in the N group（P<0.05） and a dose-effect relationship was observed（P<0.05）. （2）The expression of TGF-β1 and FN in HPMCs was inhibited by exogenous HGF （P<0.05）， and a dose-effect relationship was observed（P<0.05）. Conclusion High glucose environment promotes the expression of TGF-β1 and the synthesis of ECM in HPMCs. The process of high glucose inducing ECM can be inhibited under the influence of exogenous HGF， suggesting that HGF has an inhibitory effect in the process of peritoneal fibrosis， which provides theoretical basis for the prevention and treatment of PD related peritoneal fibrosis.

[Key words] High glucose environment; Human peritoneal mesothelial cells; Hepatocyte growth factor; Fibrosis

腹膜透析（Peritoneal dialysis，PD）為有效的終末性腎病腎臟替代治療方法，與常規(guī)血液透析治療相比，能使患者得到更高的生活質(zhì)量[1]。但在腹膜透析長期治療過程中可出現(xiàn)纖維化病變，對(duì)超濾治療產(chǎn)生負(fù)性影響，增加超濾失敗發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，因此發(fā)生溶質(zhì)清除障礙，為PD治療難以保持長期療效的原因之一[2]。傳統(tǒng)腹膜透析液（Peritoneal dialysis fluid，PDF）中含有葡萄糖降解產(chǎn)物（GDP）、低pH、乳酸鹽緩沖液、高糖等不相容生物成分，為腹膜損傷、腹膜纖維化的重要原因[3]。

目前在腹膜纖維化發(fā)生原因研究中，已經(jīng)明確證實(shí)PMCs的EMT為誘發(fā)腹膜纖維化關(guān)鍵過程，且由TGF-β介導(dǎo)EMT觸發(fā)并維持[4]。而HGF可在TGF-β1所致的纖維化作用中，具有特異性對(duì)抗作用，因此在慢性纖維化發(fā)生機(jī)制中HGF和TGF-β1之間的平衡起到?jīng)Q定性作用[5]。但目前在腹膜纖維化的HGF相關(guān)因素研究較少。本次在探討高糖環(huán)境下rhHGF對(duì)原代培養(yǎng)的HPMCs是否存在TGF-β1表達(dá)影響，以及是否可抑制HPMCs的EMT、ECM產(chǎn)生，以為防治PD相關(guān)腹膜纖維化提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 試劑? 人FN ELISA試劑盒;人TGF-β1 ELISA試劑盒;重組人HGF;即用型兔抗人波形蛋白多克隆抗體，即用型兔抗人細(xì)胞角蛋白多克隆抗體，即用型鼠抗人白細(xì)胞CD45抗體;雙抗（青霉素-鏈霉素）。

1.1.2 儀器? DU650紫外分光光度計(jì);ELXSOO型酶標(biāo)儀;UVIPRO凝膠成像系統(tǒng);Olympus1×50倒置顯微鏡;凝膠電泳儀;HERA cell CO2培養(yǎng)箱。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞原代培養(yǎng)? 選擇期腹部手術(shù)治療患者無菌大網(wǎng)膜為細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)象，面積約15 cm2，排除尿毒癥、惡性腫瘤患者;將網(wǎng)膜組織消化、離心、重懸細(xì)胞，并接種于培養(yǎng)瓶中靜置培養(yǎng)。之后進(jìn)行HPMCs傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)至第二代時(shí)，以EliVision TM二步法（非生物素即用型）進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色鑒定，顯色選DAB，免疫組化染色對(duì)象為抗人波形蛋白、抗人CD45、抗第Ⅷ因子、抗人角蛋白等;持續(xù)細(xì)胞原代培養(yǎng)，至第三代后，進(jìn)行試驗(yàn)研究。

1.2.2 細(xì)胞分組? 不同葡萄糖濃度組：培養(yǎng)液GLU終濃度為5.5 mmol/L作為正常對(duì)照組（N組）。GLU終濃度為30 mmol/L、60 mmol/L的培養(yǎng)液為G30、G60組。

HGF干預(yù)組 G60組：選濃度為60 mmol/L的葡萄糖新鮮培養(yǎng)液作為干預(yù)對(duì)照組。分別另加入rhHGF終濃度為25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL為H25、H50、H100組，持續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集上清至冷凍管中，并放置在-80℃冰箱中保存、待檢。

1.2.3 FN和TGF-β1的蛋白質(zhì)含量測定? 收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，細(xì)胞消化后計(jì)數(shù)，采用ELISA法檢測蛋白質(zhì)含量，先使用標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)稀釋、溫育、洗板、顯色、終止等步驟，450 nm波長依序測定各孔吸光度，根據(jù)樣品吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出相應(yīng)濃度，用細(xì)胞數(shù)校正，計(jì)算每105個(gè)細(xì)胞分泌的蛋白量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)計(jì)算統(tǒng)計(jì)選用SSPS17.0進(jìn)行處理;計(jì)量資料（指標(biāo)水平等）均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，若多組間均數(shù)比較則以單因素方差分析（one-factor ANOVA）進(jìn)行;組間顯著性分析采用LSD-t法行兩兩比較;若方差不齊，以Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)多組間均數(shù)比較，方差齊性檢驗(yàn)以Levene法進(jìn)行;以Mann-Whitney U檢驗(yàn)行組間兩兩比較;α=0.05，P<0.05提示組間比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、鑒定

2.1.1 細(xì)胞生長情況? 原代消化下細(xì)胞初始生長形態(tài)為梭形成纖維細(xì)胞（封三圖1）;后逐漸融合為單層，倒置相差顯微鏡下呈現(xiàn)“鋪路石樣”典型細(xì)胞外觀（封三圖2）。以上細(xì)胞生長特點(diǎn)與文獻(xiàn)報(bào)道中腹膜間皮細(xì)胞特點(diǎn)相符合。

2.1.2 免疫組織化學(xué)染色及鑒定? 免疫組化顯示，第二代HPMCs中表達(dá)為陰性的為白細(xì)胞CD45抗原、第Ⅷ因子相關(guān)抗原，表達(dá)為陽性的為波形蛋白抗原、角蛋白。

2.2清液中FN、TGF-β1的含量

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線橫坐標(biāo)線標(biāo)注濃度（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），縱坐標(biāo)為檢測出OD值，依據(jù)曲線方程計(jì)算出樣品濃度后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.2.1 高糖對(duì)人腹膜間皮細(xì)胞分泌FN、TGF-β1的影響? FN、TGF-β1分泌濃度在不同葡萄糖培養(yǎng)環(huán)境下存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表1。

2.2.2 高糖環(huán)境下人腹膜間皮細(xì)胞在HGF影響下對(duì)FN、TGF-β1分泌的影響? FN、TGF-β1的分泌濃度在不同濃度rhHGF影響下存在顯著差異，呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，見表2。

3討論

腹膜由具有上皮細(xì)胞特性的單層PMCs所覆蓋，PMCs對(duì)于腹膜結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定和維持具有重要作用[6]。體外培養(yǎng)中，PMCs與腹膜間皮干細(xì)胞免疫組化標(biāo)記相同，因此在進(jìn)行細(xì)胞活力、細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞蛋白合成等細(xì)胞功能研究中，采用體外培養(yǎng)的PMCs可作為細(xì)胞模型實(shí)施不同因子及刺激細(xì)胞功能影響研究。本次研究細(xì)胞均為人健康大網(wǎng)膜細(xì)胞，通過胰蛋白酶消化法獲取。顯微鏡下顯示，獲取的健康大網(wǎng)膜細(xì)胞初始形態(tài)為梭形纖維樣，后逐漸生長、融合，形成單層、大小結(jié)構(gòu)相似的多邊形細(xì)胞結(jié)構(gòu)，倒置顯微鏡下，獲取試驗(yàn)細(xì)胞出現(xiàn)橢圓鋪路石樣典型細(xì)胞結(jié)構(gòu)，其形態(tài)特征與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道中腹膜間皮細(xì)胞相符[7]，并在免疫組織化學(xué)染色后證實(shí)細(xì)胞純度高。

PD已被證明是ESRD患者有效的腎替代治療方法，維持長期腹膜透析的基礎(chǔ)為保持腹膜功能與結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[8]，而經(jīng)長期PD治療的患者極易發(fā)生纖維化，對(duì)超濾效果具有顯著負(fù)性影響，增加治療失敗發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，最終需退出腹膜透析治療。目前認(rèn)為腹膜長期暴露于生物相容性較差的腹膜透析液中，為引發(fā)腹膜纖維化的主要原因，可因此發(fā)生血管病變、腹膜纖維化、腹膜損傷、新生血管生成等[3]。我國目前普遍選用滲透劑為葡萄糖的商用PDF治療，而目前認(rèn)為高濃度葡萄糖是腹膜纖維化及增厚重要始動(dòng)因子[9]。

目前腹膜纖維化發(fā)生機(jī)制仍未完全明確，但相關(guān)研究顯示，腹膜纖維化發(fā)生發(fā)展過程中，PMCs的EMT起到關(guān)鍵作用[10]。成纖維細(xì)胞大量增殖代表了組織纖維化的發(fā)生，目前認(rèn)為它們主要來源于經(jīng)過EMT的PMCs[11]。目前仍不清楚EMT分子機(jī)制，但有證據(jù)證實(shí)誘導(dǎo)EMT關(guān)鍵介質(zhì)為TGF-β1[12]。TGF-β1家族是一種多功能的細(xì)胞因子，在不同器官組織纖維化中均積極參與，同時(shí)被認(rèn)為其是腹膜高糖環(huán)境下發(fā)生纖維化的關(guān)鍵誘導(dǎo)因子[13]。有研究[14]用TGF-β1刺激體外培養(yǎng)的HPMCs后發(fā)生EMT。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)的HPMCs在高糖的刺激下，TGF-β1、FN蛋白水平的表達(dá)量明顯增加，并且與葡萄糖的濃度呈正相關(guān)，F(xiàn)N是ECM的主要結(jié)構(gòu)成份，說明HPMCs在高糖的刺激下發(fā)生了EMT， ECM的合成能力增強(qiáng)，促進(jìn)腹膜纖維化的發(fā)生，提示HPMCs可能在TGF-β1的誘導(dǎo)下發(fā)生了EMT及ECM表達(dá)增加。

隨著對(duì)腹膜纖維化分子機(jī)制認(rèn)知的增加，腹膜纖維化新的預(yù)防治療策略為針對(duì)確切分子通路干預(yù)，包括阻斷TGF-β1信號(hào)傳導(dǎo)通路、抑制TGF-β1表達(dá)[15]、抑制阻斷及其誘導(dǎo)的EMT[16-17]、改進(jìn)PDF的生物不相容性（以其他滲透劑替代葡萄糖）以改善PD相關(guān)腹膜纖維化。相關(guān)研究表示，抗纖維化主要內(nèi)在因子為HGF，能夠?qū)筎GF-β1導(dǎo)致的纖維化進(jìn)程，延緩或阻止器官組織纖維化形成[18]，包括腎間質(zhì)纖維化[19]。

目前在腹膜纖維化發(fā)生發(fā)展中關(guān)于HGF影響報(bào)道較少，但我們發(fā)現(xiàn)，部分腹膜透析治療患者在非生理性腹膜透析液長期暴露下仍可保持相對(duì)穩(wěn)定，說明機(jī)體自身存在能夠?qū)怪吕w維化因子刺激的保護(hù)系統(tǒng)，其中HGF為機(jī)體保護(hù)系統(tǒng)中重要組成成分。HGF由HPMCs合成，但在高糖環(huán)境下HPMCs合成能力下降，使HGF產(chǎn)物含量下降，說明機(jī)體存在抗腹膜纖維化系統(tǒng)，但受高糖環(huán)境刺激下抑制能力減弱，為腹膜纖維化主要成因之一[20]。

本次研究中，在加入不同濃度的外源性rhHGF后，在高糖環(huán)境培養(yǎng)下HPMCs的FN、TGF-β1水平均明顯抑制（P<0.05），說明外源性rhHGF能夠抑制HPMCs的EMT及ECM合成上調(diào)，從而起到抗腹膜纖維化的作用。

綜上所述，含有高葡萄糖濃度PDF可誘導(dǎo)HPMCs TGF-β1表達(dá)上調(diào)，使HPMCs發(fā)生EMT，進(jìn)而使ECM合成能力增強(qiáng)，為PD發(fā)生腹膜纖維化主要機(jī)制之一。HGF為存在于體內(nèi)的抗纖維化因子，外源補(bǔ)充后可抑制腹膜纖維化發(fā)生發(fā)展過程，達(dá)到預(yù)防、延緩腹膜纖維化形成效果。但因腹膜纖維化發(fā)生、發(fā)展過程較為復(fù)雜，存在眾多細(xì)胞因子及炎性因子相互影響、相互作用，出現(xiàn)不同信號(hào)通路間相互抑制、相互調(diào)節(jié);HGF生物學(xué)活性廣泛，可在不同類型細(xì)胞及分子機(jī)制細(xì)胞中以不同抑制機(jī)制降低纖維化發(fā)生率。但在抑制腹膜纖維化形成過程中HGF作用機(jī)制及PD動(dòng)物模型及患者中腹膜纖維化影響效果仍需進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2019-09-24）