松節(jié)油基萜類(lèi)化合物對(duì)德國(guó)小蠊驅(qū)避活性及定量構(gòu)效關(guān)系研究*

韓招久 李丙軍** 姜志寬 廖圣良 王宗德譚偉龍 陸年宏 鄭衛(wèi)青 鄭 劍 賈德勝

(1. 南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所，南京 210002；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，南昌 330045； 3.南昌市疾病預(yù)防控制中心，南昌 330045)

蟑螂是最為常見(jiàn)的室內(nèi)衛(wèi)生害蟲(chóng)，在世界范圍廣泛分布，是傳播腸道疾病的重要媒介。使用化學(xué)殺蟲(chóng)劑是防治蟑螂的常用手段。長(zhǎng)期使用化學(xué)殺蟲(chóng)劑會(huì)導(dǎo)致害蟲(chóng)抗藥性的發(fā)生，并引起嚴(yán)重的環(huán)境污染與健康風(fēng)險(xiǎn)。

傳統(tǒng)的殺蟲(chóng)劑大多是作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)毒劑，使用過(guò)程中可能對(duì)非靶生物造成傷害。隨著時(shí)代的發(fā)展，人們防治害蟲(chóng)的理念與時(shí)俱進(jìn)。防治害蟲(chóng)的目的是有效地控制危害，殺死并非實(shí)現(xiàn)這一目的唯一手段。昆蟲(chóng)驅(qū)避劑是殺蟲(chóng)劑的重要替代藥劑，一般認(rèn)為昆蟲(chóng)驅(qū)避劑通過(guò)作用于昆蟲(chóng)的外周神經(jīng)系統(tǒng)而干擾或抑制昆蟲(chóng)的行為。昆蟲(chóng)驅(qū)避劑不僅可以用于涂抹皮膚保護(hù)人畜免遭害蟲(chóng)侵?jǐn)_，還可用于物品包裝和特殊環(huán)境阻止害蟲(chóng)侵?jǐn)_(Petersonetal., 2001)。

萜類(lèi)化合物在植物精油中廣泛存在，有的對(duì)昆蟲(chóng)表現(xiàn)出良好的驅(qū)避活性。松節(jié)油是世界上產(chǎn)量最大的植物精油。利用其主要成分為α-蒎烯和β-蒎烯合成多個(gè)系列的萜類(lèi)化合物，并從中篩選驅(qū)避劑是一個(gè)重要的研究思路。本課題組現(xiàn)已從松節(jié)油基萜類(lèi)化合物中成功篩選出了對(duì)蚊蟲(chóng)驅(qū)避活性較好的驅(qū)避劑(王宗德等，2005；韓招久等，2005)。本文報(bào)道了26個(gè)萜類(lèi)化合物對(duì)德國(guó)小蠊Blattellagermanica的驅(qū)避活性，并計(jì)算定量構(gòu)效關(guān)系，從而為萜類(lèi)蟑螂驅(qū)避劑的分子設(shè)計(jì)、驅(qū)避機(jī)理探討，以及松節(jié)油開(kāi)發(fā)利用新途徑的開(kāi)辟提供前期研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試蟲(chóng)：德國(guó)小蠊，南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所室內(nèi)飼養(yǎng)。昆蟲(chóng)飼養(yǎng)室條件：光照時(shí)間10 h/d：相對(duì)濕度60%～75%；飼養(yǎng)溫度25～28℃。試驗(yàn)用蟲(chóng)為羽化10～15 d健康活躍的雄性成蟲(chóng)。

1.1.2藥劑：26個(gè)萜類(lèi)化合物為江西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物天然產(chǎn)物與林產(chǎn)化工研究所提供。

1.2 驅(qū)避活性測(cè)試方法

參照Peterson等(2002)的方法，并進(jìn)行相應(yīng)的改進(jìn)。把直徑為15 cm濾紙對(duì)半切成2塊，分別標(biāo)記為處理與對(duì)照。將標(biāo)記為處理的半張濾紙用 1.5 mL 濃度為 20 mg/mL 無(wú)水乙醇配制萜類(lèi)化合物溶液均勻浸透2 min，另半張濾紙用不含樣品的溶劑(無(wú)水乙醇)浸透(同上)作為對(duì)照。濾紙自然晾干 5 min后，把兩個(gè)半張濾紙切邊相對(duì)，半圓邊靠皿壁放置于直徑為 18 cm培養(yǎng)皿中。皿蓋中央切1個(gè)2 cm×2 cm方孔。用直徑1.8 cm、長(zhǎng)10 cm的試管通過(guò)方孔把1只德國(guó)小蠊引入到培養(yǎng)皿中，并用透明塑料片將小孔覆蓋，等待 5 min (剛開(kāi)始投入到培養(yǎng)皿的德國(guó)小蠊常驚慌，故需等待一段時(shí)間，當(dāng)其平息下來(lái)，再進(jìn)行試驗(yàn))，開(kāi)始用2只秒表分別記錄德國(guó)小蠊在處理與對(duì)照濾紙上停留的時(shí)間，觀(guān)察時(shí)間5 min(300 s)。德國(guó)小蠊停留在濾紙空白處(濾紙間的區(qū)域)的時(shí)間，不計(jì)入處理和對(duì)照濾紙上德國(guó)小蠊的停留時(shí)間內(nèi)，但計(jì)入總時(shí)間(300 s)內(nèi)。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 驅(qū)避活性計(jì)算

驅(qū)避率RR(%)=[(對(duì)照濾紙上停留的時(shí)間-處理濾紙上停留的時(shí)間)/300]×100%。

1.4 定量構(gòu)效關(guān)系的計(jì)算

1.4.1結(jié)構(gòu)構(gòu)建與幾何優(yōu)化：應(yīng)用Gaussian View 4.1構(gòu)建26個(gè)萜類(lèi)德國(guó)小蠊驅(qū)避化合物，采用Gaussian 03W進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，計(jì)算水平為HF/6-31G(d)，在結(jié)構(gòu)優(yōu)化的過(guò)程中，由于鍵長(zhǎng)、鍵角的調(diào)整，會(huì)存在許多不同能量值的構(gòu)象，其中最優(yōu)構(gòu)象的能量最低，在結(jié)構(gòu)優(yōu)化完成后即可獲得最優(yōu)構(gòu)象。

1.4.2結(jié)構(gòu)描述符的計(jì)算：利用Ampac 8.16軟件對(duì)以上計(jì)算結(jié)果進(jìn)行格式的轉(zhuǎn)換，并計(jì)算部分量子化學(xué)描述符，再將轉(zhuǎn)換格式后的所有締合體結(jié)構(gòu)導(dǎo)入到Codessa 2.7.10軟件，計(jì)算它們的結(jié)構(gòu)描述符及特定部位描述符(六元環(huán))。描述符包括6種類(lèi)型：結(jié)構(gòu)組成描述符、拓?fù)涿枋龇缀蚊枋龇?、靜電描述符、量子化學(xué)描述符和熱力學(xué)描述符。

1.4.3定量構(gòu)效關(guān)系模型的建立：應(yīng)用Codessa 2.7.10軟件通過(guò)啟發(fā)式方法(Heuristic method，HM)篩選出顯著性結(jié)構(gòu)參數(shù)，該方法首先對(duì)分子參數(shù)進(jìn)行共線(xiàn)性控制，采用預(yù)處理的方式進(jìn)行快速篩選排除掉一些參數(shù)，將結(jié)構(gòu)描述符按參數(shù)模型的相關(guān)系數(shù)降序排列， 依次引入剩余結(jié)構(gòu)描述符中與活性或其他性質(zhì)相關(guān)系數(shù)最大的結(jié)構(gòu)描述符。因此可以對(duì)結(jié)構(gòu)描述符快速篩選，并建立構(gòu)效關(guān)系計(jì)算模型。

2 結(jié)果

2.1 驅(qū)避活性

測(cè)試的26個(gè)萜類(lèi)化合物表現(xiàn)出了不同水平的驅(qū)避活性(表1)，其中20個(gè)化合物為正向驅(qū)避活性。薄荷醇的活性最高，驅(qū)避率為69.8%。由于α-蒎烯和β-蒎烯具有良好的化學(xué)反應(yīng)性能，能夠合成不同系列的萜類(lèi)化合物。根據(jù)碳鏈骨架結(jié)構(gòu)不同，可分為四元環(huán)、六元環(huán)、橋環(huán)和開(kāi)鏈類(lèi)。根據(jù)官能團(tuán)不同，則可分為醇類(lèi)、醚類(lèi)、酯類(lèi)、酮類(lèi)等。萜類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)的豐富多樣性，以及驅(qū)避活性的復(fù)雜性，既為合成篩選蟑螂驅(qū)避劑提供了潛能，也增加了工作的難度與不確定性。對(duì)結(jié)構(gòu)與活性進(jìn)行定量分析，能夠?yàn)檩祁?lèi)蟑螂驅(qū)避劑的分子設(shè)計(jì)提供參考，提升針對(duì)性。

表1 26個(gè)化合物及其對(duì)德國(guó)小蠊驅(qū)避活性Tab.1 26 compounds and their repellency

續(xù)表1

Tab.1continued

編號(hào)No.化學(xué)式Chemical formulation名稱(chēng)Name結(jié)構(gòu)式Structure驅(qū)避率Repellency M±SE(%)14C17H30O2內(nèi)型1-異莰烷基-3-戊醇乙酸酯Endo-1-isocamphanyl-3-pentanol acetate27.6±26.015C18H32O2內(nèi)型1-異莰烷基-3-己醇乙酸酯Endo-1-isocamphanyl-3-hexanol acetate-25.3±33.616C18H32O2內(nèi)型4-異莰烷基-3-乙基-2-丁醇乙酸酯Endo-1-isocamphanyl-3-ethyl-2-butanol acetate0.2±7.517C10H14O葛縷酮(又名:香芹酮)Carvone34.6±12.618C13H20O24-(1-甲基乙烯基)-1-環(huán)己烯-1-乙醇乙酸酯4-(1-Methylethylene)-1-cyclohexe nyl-1-ethyl acetate45.9±44.019C14H22O24-(1-甲基乙烯基)-1-環(huán)己烯-1-乙醇丙酸酯4-(1-Methylethylene)-1-cyclohexenyl-1-ethyl propionate58.4±19.520C10H20O薄荷醇Menthol69.8±14.621C12H22O2乙酸薄荷酯Menthyl acetate33.3±16.822C13H24O2丙酸薄荷酯Menthyl propionate51.2±24.923C10H18O28-羥基別二氫葛縷醇8-Hydroxylcarveol5.2±9.124C11H18O38-羥基別二氫葛縷醇甲酸酯8-Hydroxylcarveol formate54.8±46.125C12H20O38-羥基別二氫葛縷醇乙酸酯8-Hydroxylcarveol acetate13.2±10.326C13H22O38-羥基別二氫葛縷醇丙酸酯8-Hydroxylcarveol propionate51.9±47.0

注：驅(qū)避率為3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差

Note: Repllency is Mean±Standard error value of 3 trails

2.2 模型描述符個(gè)數(shù)的確定

表2 不同描述符個(gè)數(shù)的模型對(duì)應(yīng)的R2及Tab.2 R2 and of models with different number of descriptors

表3 最優(yōu)6參數(shù)模型Tab.3 Best six-parameter model

表4 模型候選參數(shù)的相關(guān)矩陣Tab.4 Correlation matrix of the candidate decriptors for model

注：X1：氫原子的最大原子態(tài)能量；X2：原子表面帶正電部分區(qū)域相對(duì)于總帶電區(qū)域的比例分?jǐn)?shù)；X3：分子總偶極的雜化成分；X4：碳原子最大原子態(tài)能；X5：原子表面帶負(fù)電部分區(qū)域相對(duì)于總帶電區(qū)域的比例分?jǐn)?shù)；X6：Onsager-Kirkwood溶解能的圖像。

Note:X1: Max atomic state energy for a H atom;X2: FPSA-3 Fractional PPSA (PPSA-3/TMSA)；X3: Tot hybridization comp. of the molecular dipole;X4: Max atomic state energy for a C atom;X5: ESP-FNSA-2 Fractional PNSA (PNSA-2/TMSA);X6: Image of the Onsager-Kirkwood solvation energy.

圖1 不同參數(shù)個(gè)數(shù)的模型對(duì)應(yīng)R2及Fig.1 R2 and of models with different number of parameters

2.3 最佳定量構(gòu)效關(guān)系模型

利用上面獲得6個(gè)描述符構(gòu)建最優(yōu)定量構(gòu)效關(guān)系模型：驅(qū)避率%Y=269.13+15.36X1-77.16X2+0.83X3+1.38X4+0.83X5+2.58X6

獲得的最佳QSAR模型，其R2為0.7923，F(xiàn)為23.08，s2為0.028。模型的t檢驗(yàn)值、截距及6個(gè)結(jié)構(gòu)描述符的具體情況見(jiàn)表2。根據(jù)顯著性檢驗(yàn)，26個(gè)樣本，顯著性水平α=0.01時(shí)，6個(gè)因素的F值為3.59(李云雁和胡傳榮，2005)，表2中模型的F值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于這個(gè)檢驗(yàn)值。X和ΔX分別表示回歸相關(guān)系數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，該模型根據(jù)6個(gè)描述符的顯著水平按照降序排列。

在表5中列出了驅(qū)避劑活性實(shí)驗(yàn)值、利用最優(yōu)計(jì)算模型計(jì)算出來(lái)的驅(qū)避活性值，以及二者的差值。計(jì)算值和實(shí)驗(yàn)值的關(guān)系見(jiàn)圖2。由表可知，一些結(jié)構(gòu)的活性實(shí)驗(yàn)值和計(jì)算值之間有較大的差值，反映出在生物活性測(cè)試時(shí)，不可避免的存在較大的誤差，要避免這種誤差，解決辦法可以是增加的測(cè)試次數(shù)和改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法等。

表5 模型計(jì)算的驅(qū)避率與實(shí)驗(yàn)值的比較Tab.5 Calculated Repellent Ratio vs experimental RR

圖2 模型計(jì)算的驅(qū)避率與實(shí)驗(yàn)值的線(xiàn)性關(guān)系Fig.2 Linear relationship between calculated RR and experimental RR

2.4 模型的檢驗(yàn)

表6 6參數(shù)模型檢驗(yàn)Tab.6 Validation of six-parameter model

3 討論

植物在與昆蟲(chóng)長(zhǎng)期協(xié)同演化過(guò)程中，產(chǎn)生一些抵抗昆蟲(chóng)侵害的物質(zhì)。驅(qū)避是這些物質(zhì)的一個(gè)重要機(jī)理。天然的驅(qū)避劑主要是植物揮發(fā)物。很多植物能夠分泌具有昆蟲(chóng)驅(qū)避活性的萜類(lèi)物質(zhì)(Moraesetal.，2001)。從植物精油中篩選蟑螂驅(qū)避劑是一個(gè)重要的研究思路，并發(fā)現(xiàn)了一些具有良好驅(qū)避活性的物(Inazuka，1982; Thavaraetal.，2007)。松節(jié)油是世界上產(chǎn)量最大的植物精油，其主要成分α-蒎烯和β-蒎烯具有良好的化學(xué)反應(yīng)性能，可以通過(guò)基團(tuán)引入等方式合成多個(gè)系列的萜類(lèi)化合物。從這些化合物中篩選昆蟲(chóng)驅(qū)避劑具有很大的潛力(宋湛謙等，2006)。本項(xiàng)研究測(cè)試的26個(gè)萜類(lèi)化合物中有20個(gè)表現(xiàn)出了對(duì)德國(guó)小蠊的正向驅(qū)避活性。由于這些萜類(lèi)化合物存在結(jié)構(gòu)的豐富性，從碳鏈骨架上包含了六元環(huán)和橋環(huán)類(lèi)，從官能團(tuán)上則包含了醇類(lèi)、醚類(lèi)、酯類(lèi)、酮類(lèi)等豐富的結(jié)構(gòu)多樣性，為篩選蟑螂驅(qū)避劑提供了可能。我國(guó)的松節(jié)油資源十分豐富，年產(chǎn)能達(dá)8萬(wàn)t，為萜類(lèi)昆蟲(chóng)驅(qū)避劑的合成開(kāi)發(fā)利用提供了豐富原料。本項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)薄荷醇對(duì)德國(guó)小蠊有較好的驅(qū)避活性，具有作為蟑螂驅(qū)避劑加以開(kāi)發(fā)利用的前景。隨著研究的深入，有望篩選出安全高效的蟑螂驅(qū)避劑，改變當(dāng)前蟑螂防治過(guò)于依賴(lài)殺蟲(chóng)劑的局面。

萜類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)的豐富多樣性，導(dǎo)致生物活性復(fù)雜性。這既為篩選蟑螂驅(qū)避劑提供了潛力，也增加了工作的難度與不確定性。對(duì)化合物進(jìn)行定量構(gòu)效關(guān)系的分析，能夠?yàn)轶腧?qū)避劑的分子設(shè)計(jì)提供參考，提升針對(duì)性。通過(guò)對(duì)26個(gè)萜類(lèi)化合物對(duì)德國(guó)小蠊驅(qū)避活性構(gòu)效關(guān)系的定量分析，我們發(fā)現(xiàn)影響萜類(lèi)德國(guó)小蠊驅(qū)避活性的最主要的6個(gè)描述符為Max atomic state energy for a H atom；FPSA-3 Fractional PPSA (PPSA-3/TMSA)；Tot hybridization comp. of the molecular dipole；Max atomic state energy for a C atom；ESP-FNSA-2 Fractional PNSA (PNSA-2/TMSA)；Image of the Onsager-Kirkwood solvation energy。Max atomic state energy for a H atom、Max atomic state energy for a C atom、Tot hybridization comp. of the molecular dipole和Image of the Onsager-Kirkwood solvation energy都屬于量子化學(xué)描述符，分別表示氫原子的最大原子態(tài)能量、碳原子的最大原子態(tài)能量、分子總偶極的雜化成分和Onsager-Kirkwood溶解能的圖像。FPSA-3 Fractional PPSA (PPSA-3/TMSA) 和ESP-FNSA-2 Fractional PNSA (PNSA-2/TMSA) 屬于靜電描述符，分別表示原子表面帶正電部分區(qū)域相對(duì)于總帶電區(qū)域的比例分?jǐn)?shù)和原子表面帶負(fù)電部分區(qū)域相對(duì)于總帶電區(qū)域的比例分?jǐn)?shù)。從這些描述符的含義可知，分子內(nèi)部原子間的相互影響、分子極性、溶解性等因素對(duì)驅(qū)避活性有較大影響。