白僵菌對不同生境淡色庫蚊的致病力研究*

劉麗娟 寇景軒 田寶振 王海防 程 鵬 崔 勇 公茂慶

(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，山東省寄生蟲病防治研究所，山東濟(jì)寧 272033)

球孢白僵菌屬于半知菌亞門Deuteromycotina，白僵菌屬Beauveria，是一種常規(guī)的生物殺蟲劑，具有高效、對非靶標(biāo)生物較安全、容易大量生產(chǎn)以及防治成本低廉等特點(diǎn)(Genthneretal.，1992；韓寶瑜等，1996；)，而且與部分低毒殺蟲劑具有較好的相容性(Hancock，2009；Howardetal.，2010；蔡悅等，2011；熊琦等，2012)，可以與化學(xué)殺蟲劑混用，共同防治害蟲。球孢白僵菌在農(nóng)、林業(yè)害蟲的防治中已廣泛應(yīng)用(Teferaetal.，2003；Rassetteetal.，2011；鄧春生等，2012)，尤其對玉米螟和松毛蟲的生物防治，在國內(nèi)已作為常規(guī)手段連年使用。目前研究發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌對蚊蟲具有致病性，尤其對傳瘧蚊蟲的致病性研究已有較多報(bào)道(Achonduhetal.，2008；De Paulaetal.，2008；Mnyoneetal.，2012)，對淡色庫蚊Culexpipienspallens致病性的研究較少。淡色庫蚊屬于尖音庫蚊的亞種，可傳播班氏絲蟲病及流行性腦炎等蚊媒傳染病，是重要的傳播媒介，目前已對多種化學(xué)殺蟲劑產(chǎn)生不同程度的抗藥性(王新國等，2003；Huangetal.，2003)，因此真菌對淡色庫蚊致病性的研究意義重大。受生境微氣候的影響，蚊蟲對真菌殺蟲劑也可能表現(xiàn)出不同程度的敏感性，因此，我們采集5個(gè)不同點(diǎn)的淡色庫蚊幼蟲用于試驗(yàn)，以期初步研究白僵菌對不同生境蚊蟲的致病力，為蚊蟲的生物防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試菌株：試驗(yàn)用球孢白僵菌Beauveriabassiana從鱗翅目僵蟲上分離獲得，現(xiàn)保存于山東省寄生蟲病防治研究所。利用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato Dextrose Agar，PDA)斜面4℃保存菌株，試驗(yàn)時(shí)將菌株轉(zhuǎn)接到PDA平板上進(jìn)行培養(yǎng)，收集孢子待用。

1.1.2供試蟲源：試驗(yàn)用蚊蟲分為A、B、C、D和E 5組，A組蚊蟲從濟(jì)寧市唐口鎮(zhèn)醫(yī)院污水中采集，B組蚊蟲從濟(jì)寧市郊區(qū)養(yǎng)豬場廢水溝采集，C組蚊蟲從微山湖稻區(qū)排水溝中采集，D組蚊蟲從山東省寄生蟲病防治研究所院內(nèi)水缸中采集，E組為室內(nèi)飼養(yǎng)蚊蟲。野外采集到的蚊蟲鑒定蚊種和齡期后直接用于試驗(yàn)。室內(nèi)蚊蟲飼養(yǎng)條件：溫度28℃，相對濕度為70%～80%，光周期為光照:黑暗=12L:12D，幼蟲用豬肝粉和酵母粉的混合飼料喂養(yǎng)。試驗(yàn)均用淡色庫蚊2齡幼蟲。

1.1.3培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯(去皮)200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 000 mL。配置好的培養(yǎng)基經(jīng)高溫高壓滅菌(121℃，30 min)。

1.2 方法

1.2.1孢子懸浮液的配制：試驗(yàn)時(shí)將供試菌株轉(zhuǎn)接到PDA平板上，在25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周，待菌落長滿PDA平板，用0.03%的吐溫80無菌水洗脫，磁力攪拌器攪拌30 min，后用雙層紗布過濾，血球計(jì)數(shù)板測量母液濃度。孢子懸浮液濃度稀釋成1×106孢子/mL，待用。

1.2.2球孢白僵菌對不同棲境淡色庫蚊幼蟲的致病力：試驗(yàn)容器為一次性透明塑料飲水杯，每杯盛有濃度為1×106孢子/mL的孢子懸浮液100 mL，淡色庫蚊2齡幼蟲25條。將5個(gè)點(diǎn)蚊蟲設(shè)成5個(gè)處理，另設(shè)不加孢子懸浮液的空白對照，每個(gè)處理設(shè)4個(gè)重復(fù)，每天加一次飼料。試驗(yàn)溫度25℃，光周期為光照∶黑暗=12L∶12D。連續(xù)觀察10 d，逐日統(tǒng)計(jì)感染死亡蟲數(shù)，計(jì)算試驗(yàn)10 d后淡色庫蚊的累計(jì)死亡率。

1.2.3統(tǒng)計(jì)分析： 所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SAS9.1處理，圖由Excel處理系統(tǒng)完成。

2 結(jié)果

球孢白僵菌對不同生境淡色庫蚊幼蟲均有較好的致病力，幼蟲死亡率與菌株處理時(shí)間的關(guān)系見圖1。各組對照組蚊蟲在試驗(yàn)期內(nèi)未有死亡，試驗(yàn)期間已羽化為成蚊，因此在圖中未標(biāo)出。從圖中可以看出，經(jīng)孢子懸浮液處理后，各組淡色庫蚊幼蟲的累計(jì)死亡率均隨時(shí)間的延長而逐漸增加，室內(nèi)飼養(yǎng)蚊蟲的死亡率曲線較平滑，在試驗(yàn)的3～6 d幼蟲大量死亡；而野外采集蚊蟲的死亡率曲線不規(guī)整，在試驗(yàn)開始后的第5～8 d，幼蟲大量死亡。試驗(yàn)10 d后，各組蚊蟲累計(jì)死亡率均達(dá)95%以上，存活下來的蚊蟲生長緩慢，生活史明顯延長。經(jīng)孢子懸浮液處理后，五組蚊蟲的致死中時(shí)LT50見表1，從表中可以看出，室內(nèi)飼養(yǎng)蚊蟲的致死中時(shí)LT50最短，僅3.8 d，野外采集蚊蟲的致死中時(shí)在6 d左右，其中從養(yǎng)豬場廢水溝中采集的蚊蟲致死中時(shí)最長，為6.4 d。唐口鎮(zhèn)醫(yī)院污水、濟(jì)寧郊區(qū)養(yǎng)豬場廢水中采集蚊蟲與其他生境中蚊蟲的致死中時(shí)LT50差異顯著，稻區(qū)排水溝、院內(nèi)水缸中蚊蟲與室內(nèi)飼養(yǎng)蚊蟲的致死中時(shí)LT50差異顯著，其余各組間差異不顯著(F=67，P=0.001)。

圖1 球孢白僵菌處理后不同棲境淡色庫蚊幼蟲的累計(jì)死亡率Fig.1 The accumulated mortality of Cx. pipiens pallens from different habitats by the strain of B. bassianaA：從濟(jì)寧市唐口鎮(zhèn)醫(yī)院污水中采集的蚊蟲；B：從濟(jì)寧市郊區(qū)養(yǎng)豬場廢水溝中采集的蚊蟲；C：從微山湖稻區(qū)排水溝中采集的蚊蟲；D：從山東省寄生蟲病防治研究所院內(nèi)水缸中采集的蚊蟲；E：室內(nèi)飼養(yǎng)蚊蟲。下同。A: Mosquitoes were collected from sewage at TangKou Town hospital；B: Mosquitoes were collected from Piggery waste water at the outskirts of Jining City；C: Mosquitoes were collected from drainage ditch of paddy field in Weishan Lake；D: Mosquitoes were collected from water vat in Shandong Institute of Parasitic Diseases；E: Mosquitoes were breeding in the laboratory.The same below.

處理組Treatment groupLT-P回歸式LT-P regressionLT50/dRAy=12.352x-25.5336.2 a0.9761By=13.055x-30.46.4 a0.9591Cy=13.339x-28.6675.7 b0.9722Dy=13.121x-21.1675.8 b0.9794Ey=12.248x-1.46673.8 c0.9323

LT50一列中，相同字母在0.05水平上差異不顯著(LSD法).

The same letter on the medium lethal times indicates no significant difference atP=0.05 level (LSD).

3 討論

球孢白僵菌作為生物防治的常規(guī)菌種之一，在農(nóng)、林業(yè)害蟲的防治中發(fā)揮了重要的作用，但其作用效果受多種因素的影響，有研究報(bào)道害蟲種類以及不同的接種方式均會影響致病菌的作用效果(蔡守平等，2009；劉麗娟等，2011；Bukharietal.，2010)。蚊蟲的孳生環(huán)境復(fù)雜，水體中的微生物種類多，生境內(nèi)的微生物可能影響白僵菌的作用效果，因此，本文利用從自然界中分離篩選出來的高致病力菌株，研究其對不同生境蚊蟲的致病力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌對不同生境蚊蟲均具有較高的致病力，但野外組蚊蟲的致死中時(shí)LT50明顯大于室內(nèi)飼養(yǎng)蚊蟲，究其原因，一方面可能因?yàn)橐巴馕孟x在自然界中遵循優(yōu)勝劣汰的自然法則，存活下來的蚊蟲應(yīng)對不良環(huán)境的能力更強(qiáng)；另一方面野外蚊蟲體內(nèi)可能存在某些微生物，對白僵菌具有一定程度的抑制作用，有報(bào)道稱德國小蠊Blattellagermanica腸道菌對白僵菌具有明顯的抑制作用(張凡，2012)，蚊蟲腸道中是否存在抑制白僵菌的微生物還需要進(jìn)一步的研究。自然界中很難達(dá)到要求的孢子懸浮液濃度，孳生水體的鹽度、有機(jī)物種類以及水體溫度均會影響真菌的致病性。綜上幾種原因，白僵菌對野外組蚊蟲雖然表現(xiàn)出了較高的致病力，但是在利用白僵菌防治蚊蟲時(shí)，其防治效果與實(shí)驗(yàn)室結(jié)果可能存在很大差異，推廣應(yīng)用前還需要進(jìn)行大量的田間試驗(yàn)。另外，孳生環(huán)境中微生物對白僵菌致病性的影響也是今后研究的方向。