五株蟲生真菌對白紋伊蚊成蚊及幼蚊致病力的研究*

盧健聰 曾潤深 曾 科 魏姍姍 李雪蘭 陸 洋 彭鴻娟

(南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)院病原生物學(xué)系，廣東 510515)

蚊蟲是瘧疾、絲蟲病、日本流行性乙型腦炎、登革熱等疾病的重要傳播媒介。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球約25億人有登革熱感染的危險(xiǎn)，每年有1億新感染病例，其中50萬重癥患者需住院治療(張復(fù)春，2011)，極度影響人類健康、社會(huì)的穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。白紋伊蚊Aedesalbopictus位于我國媒介昆蟲和傳播登革熱的蚊種之首。在蚊媒防治中，過去幾十年我國主要應(yīng)用化學(xué)殺蟲劑進(jìn)行防治，在預(yù)防疾病流行方面起著舉足輕重的作用(邵柏等，2002)，但長期使用化學(xué)殺蟲劑造成的嚴(yán)重環(huán)境污染，可通過生物鏈傳遞進(jìn)而危害人體健康，同時(shí)蚊蟲抗藥性的產(chǎn)生帶來的弊端也日益顯現(xiàn)，因而尋求新的有效的防治方法成為醫(yī)學(xué)界面臨的重要課題。

蚊蟲的生物防治主要應(yīng)用蚊蟲病原體、寄生物、捕食物來達(dá)到防治效果，同時(shí)具有對非目標(biāo)生物和有益生物無害的特性，不污染環(huán)境以及不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn)(Thomasetal.，2007)。球孢白僵菌Beauveriabassiana作為一類重要的天敵生物資源，因其易于生產(chǎn)、寄主范圍廣的特點(diǎn)，能浸染15目149科的700多種昆蟲，具有侵染期長、不傷害人和其他脊椎動(dòng)物的優(yōu)點(diǎn)，倍受人們的關(guān)注(Blakeetal.，2002；Tafoyaetal.，2004)。從20世紀(jì)50年代開始，球孢白僵菌已被應(yīng)用于防治玉米螟、大豆食心蟲和甘薯葉甲，而中國是世界上生產(chǎn)和使用白僵菌最多的國家，利用球孢白僵菌防治松毛蟲的經(jīng)驗(yàn)與技術(shù)令全世界矚目(楊懷文，2005)。

Mnyone等(2010a,b)系統(tǒng)地研究了球孢白僵菌及綠僵菌孢子粉施用方法，以及蚊齡、吸血情況等生理因素對驅(qū)蚊的易感性的影響。研究證明，在對蚊蟲施用球孢白僵菌及綠僵菌后28 d內(nèi)均能夠降低蚊蟲的成活率，分生孢子施用于泥板及棉布上比施用于聚脂纖維網(wǎng)上的效果好(Mnyoneetal., 2010a)；這兩種真菌的礦物油制劑對所測試的蚊蟲有驅(qū)避作用，可用作真菌殺蟲劑(Mnyoneetal., 2010b)。這兩種真菌對蚊蟲的各齡段具有感染性和致病性，但對未吸血蚊蟲具有更好的敏感性(Mnyoneetal., 2010c)。

本研究以國內(nèi)外生物防治中常用的幾株蟲生真菌為材料，分別研究其對白紋伊蚊幼蟲和成蚊的致病力，以期篩選出高致病力菌株，并進(jìn)一步探尋影響該菌株發(fā)揮高致病毒力的相關(guān)條件，為蚊蟲的生物防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)菌種及培養(yǎng): 球孢白僵菌B.bassianaGIM3.428、GIM3.45、GIM3.46、GIM3.436及金龜子綠僵菌MetarhiziumanisopliaeGIM3.528株，均購自廣東省微生物研究所菌種保藏中心。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)從廣東省微生物研究所菌種保藏中心購買，按使用說明配制成斜面固體培養(yǎng)基。將以上菌株接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，25℃生長5～6 d，在培養(yǎng)基上長滿孢子后在4℃保存。

1.1.2蚊蟲飼養(yǎng): 白紋伊蚊為南方醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)系傳代培育品系，幼蟲喂食生酵母片，成蚊飼喂10%的葡萄糖水，喂SPF級(jí)昆明鼠血產(chǎn)卵傳代。幼蟲與成蚊都飼養(yǎng)于溫度為30℃、相對濕度70%～80%，光周期為光照∶黑暗=12L∶12D 的自動(dòng)溫濕控制的蚊蟲培養(yǎng)室內(nèi)。

1.2 毒力測試實(shí)驗(yàn)

1.2.1白僵菌孢子和綠僵菌孢子的準(zhǔn)備：用無菌棉簽從長滿孢子的PDA斜面上刷下孢子至無菌水中，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，用無菌水稀釋成3.0×108個(gè)/mL的孢子懸浮液，用于對蚊幼蟲的毒力測試實(shí)驗(yàn)；或者將生長于固體培養(yǎng)基上的孢子粉直接用于對成蚊的毒力測試試驗(yàn)。

1.2.2對幼蟲的毒力測試: 以一次性透明塑料杯作為容器，將孢子懸浮液用無菌單蒸水稀釋到1.0×102、1.0×103、1.0×104(單位：個(gè)/mL)等3個(gè)測試濃度各30 mL，以30 mL無菌水作為濃度為“0”的空白對照。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)組，每組選用20條健康、大小相同的白紋伊蚊二齡幼蟲進(jìn)行試驗(yàn)，于蚊蟲培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行。試驗(yàn)進(jìn)行12 h后，給每杯幼蟲喂食生酵母粉1 g/杯，之后每天喂飼1次(1g/杯)，逐日統(tǒng)計(jì)累計(jì)死亡幼蟲數(shù)，扣除空白對照組的正常死亡數(shù)后計(jì)算校正死亡率(羽化蚊蟲記為存活個(gè)體)，連續(xù)觀察10 d。

1.2.3對成蚊的毒力測定: 將長滿白僵菌或綠僵菌孢子粉的PDA斜面用無菌竹簽完整刮下，放置在一次性透明塑料碗中，然后置于蚊籠中，并以未接種的PDA斜面作為空白對照，每個(gè)菌株及空白照均設(shè)3個(gè)重復(fù)組。在每籠中放入30只健壯、羽化時(shí)間一致的白紋伊蚊成蚊，雌雄比例為1∶1，試驗(yàn)于蚊蟲培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行。試驗(yàn)進(jìn)行12 h后，用10%葡萄糖溶液喂養(yǎng)。逐日統(tǒng)計(jì)累計(jì)死亡成蚊數(shù)和死亡率，連續(xù)觀察10 d。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件對所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，以每實(shí)驗(yàn)組中3個(gè)重復(fù)組的累計(jì)死亡率的平均值作為該實(shí)驗(yàn)組的累計(jì)死亡率，用配對樣本t檢驗(yàn)對每兩個(gè)不同菌株在同一天的累計(jì)死亡率進(jìn)行差異顯著性的檢驗(yàn)(P<0.05為顯著性差異)。用Excel軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 幼蟲實(shí)驗(yàn)

將4株白僵菌(GIM3.428、GIM3.45、GIM3.46、GIM3.436)和1株綠僵菌和GIM3.528的孢子懸液配制為濃度為1×102、1×103、1×104個(gè)孢子/mL，分別處理白紋伊蚊幼蟲10 d后，觀察累計(jì)校正死亡率。從圖1可見，各菌株對白紋伊蚊幼蟲10 d累計(jì)校正死亡率，隨孢子濃度的增加而平穩(wěn)的增大；同時(shí)從各菌株累計(jì)校正死亡率的趨勢圖可見, GIM3.428、GIM3.45、GIM3.528、GIM3.436、GIM3.46各菌株對白蚊伊蚊幼蟲的毒力依次降低。GIM3.428株在1×104個(gè)孢子/mL濃度下對蚊幼蟲的致死率達(dá)(46.7±2.3)%，已接近半數(shù)致死濃度。

圖1 白紋伊蚊幼蟲在五株不同濃度的蟲生真菌孢子懸液中的10日累計(jì)校正死亡率Fig.1 The ten-day adjusted cumulative mortality of Aedes albopictus larvae in five strains of entomogenous fungi spores’ suspension in different concentration

圖3 白紋伊蚊成蚊感染五株白僵菌孢子后的逐日累計(jì)死亡率Fig.3 The cumulative mortality per day of Ae. albopictus adults affected with five strains of entomogenous fungi spores

圖2 白紋伊蚊幼蟲在五株白僵菌孢子懸液(濃度1×104個(gè)/mL)中的逐日累計(jì)死亡率Fig.2 The cumulative mortality per day of Ae. albopictus larvae in five strains of B. bassiana spores’ suspension (1×104 spores/mL concentration)

故而，我們選用濃度為1×104個(gè)/mL的5株菌株孢子懸液處理白紋伊蚊幼蟲10 d，每天的累計(jì)死亡率見圖2。5株菌株對白紋伊蚊幼蟲的累計(jì)死亡率均隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長而平穩(wěn)地增加。實(shí)驗(yàn)第10 d，GIM3.428、GIM3.45、GIM3.528、GIM3.436和GIM3.46對白紋伊蚊幼蟲的累計(jì)死亡率分別為(46.7±2.3)%、(45.0±4.0)%、(41.7±2.3)%、(35.0±4.0)%和(25.0±4.0)%，且觀察期內(nèi)不存在累計(jì)死亡率大幅度變化的區(qū)間。菌株GIM3.428和GIM3.45對白紋伊蚊幼蟲的致死率最高，且兩者的逐日累計(jì)死亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.964)；菌株GIM3.46的致死率最低，10 d累計(jì)校正死亡率僅為(25±4.0)%；各組中的逐日幼蟲累計(jì)死亡率與空白組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004)。經(jīng)過這5株菌株處理后，幼蟲的死亡率明顯高于空白組。

2.2 成蚊實(shí)驗(yàn)

5株菌株孢子感染白紋伊蚊成蚊后，其累計(jì)死亡率見圖3。由圖可見，等量白僵菌感染白紋伊蚊成蚊的過程中，成蚊的累計(jì)死亡率均隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長而穩(wěn)步增加。GIM3.45、GIM3.428、GIM3.528、GMIM3.436和GIM3.46對白紋伊蚊成蚊的累計(jì)死亡率分別為(51.1±4.1)%、(37.8±3.1)%、(38.9±4.1)、(30.0±2.7)及(17.8±3.1)。其中GIM3.45處理成蚊的累計(jì)死亡率最高，且第6 d死亡率明顯增加。5株菌株逐日的累計(jì)死亡率與空白組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。

3 討論

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，白紋伊蚊幼蟲的累計(jì)校正死亡率隨著野生型白僵菌孢子懸液濃度的提高而增加。這可能是因?yàn)殡S著孢子濃度的提高，幼蟲感染孢子的機(jī)會(huì)增加，隨之發(fā)病率也上升。此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示不同菌株對白紋伊蚊的致病力存在一定的差異。菌株GIM3.428和GIM3.45對白紋伊蚊幼蟲的致病力最強(qiáng)，10 d累計(jì)死亡率分別為(46.7±2.3)%、(45±4.0)%，且兩菌株毒力無顯著性差異；菌株GIM3.46對幼蟲的致病力最弱，其10 d累計(jì)死亡率僅為25%，但累計(jì)死亡率與空白組之間具有顯著性差異。在成蚊實(shí)驗(yàn)中，菌株GIM3.45，GIM3.428，和GIM3.528對成蚊的致病力最強(qiáng)，其10 d累計(jì)死亡率分別為(51.1±4.1)%、(37.8±3.1)%和(38.9±4.1)。綜合對于成蚊以及幼蟲的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，菌株GIM3.428和GIM3.45對白紋伊蚊成蚊及幼蟲均具有最強(qiáng)的毒力。

目前關(guān)于真菌對蚊的致病力的研究，國內(nèi)學(xué)者也進(jìn)行過多個(gè)試驗(yàn)。劉麗娟等(2011)利用5株蟲生真菌防治淡色庫蚊防治蚊幼蟲，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5株蟲生真菌中白僵菌菌株GIM3.428對淡色庫蚊幼蟲的致病力最高。選用大鏈壺菌對蚊幼蟲進(jìn)行試驗(yàn)，認(rèn)為大鏈壺菌通過直接入侵和破壞蚊幼蟲組織，進(jìn)而引起蚊幼蟲死亡(包懷恩等,1996)。球孢白僵菌在淡色庫蚊幼蟲間存在水平傳遞作用，即感染病原菌的蟲體可以作為傳染源，進(jìn)一步釋放孢子，增加環(huán)境中的真菌含量，使周圍正常蚊幼蟲感染真菌，在淡色庫蚊幼蟲中形成病害流行(韋瑋和公茂慶，2010)。與此相似，是否在白紋伊蚊感染中也會(huì)出現(xiàn)此規(guī)律，尚需進(jìn)一步對比試驗(yàn)方能得出結(jié)論。

本試驗(yàn)結(jié)果為白紋伊蚊的生物防治，提供了有益的資料。然而在白僵菌滅蚊方面仍有以下問題亟待解決：(1)提高球孢白僵菌的殺滅能力。本試驗(yàn)通過研究5株最常用的蟲生真菌對白紋伊蚊幼蟲和成蚊的致病性研究，得出GIM3.428和GIM3.45菌株對白紋伊蚊幼蟲和成蚊的毒力效果相對理想，且和幼蟲的致死效果在10 d時(shí)間內(nèi)大多低于50%，若要其在未來蚊的生物防治中發(fā)揮作用，必須進(jìn)一步提高其殺滅毒性；(2)使用條件的優(yōu)化。目前國內(nèi)外毒力實(shí)驗(yàn)的研究都建立在將孢子粉混懸于無菌水中，在液態(tài)條件下不利于球孢子粉的存活，限制了其使用范圍和降低了使用價(jià)值；(3)降低其對人體的毒副作用。如已在實(shí)驗(yàn)小鼠上發(fā)現(xiàn)的弱致病作用(田澤敏等, 2006)和實(shí)驗(yàn)大鼠上發(fā)現(xiàn)的間質(zhì)性肺炎、肉芽腫、纖維化等傾向(張冰等, 1996)，應(yīng)進(jìn)一步完善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究，必要時(shí)在充分論證的情況下進(jìn)行規(guī)范的臨床研究，減少生物滅蚊真菌對人體的傷害。