山楂水溶性膳食纖維提取工藝及結(jié)構(gòu)研究

李鵬沖，李向力，尹紅娜，胡桂芳，孫茜茜，劉兵戈，李娜，付有利，鄭純宇，王永，張立攀

（河南省商業(yè)科學(xué)研究所有限責(zé)任公司，河南鄭州450002）

山楂是一種重要的藥食兩用資源，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)。相比其他水果，山楂中又含有大量的非營養(yǎng)物質(zhì)（果膠、纖維素、木質(zhì)素）等膳食纖維成分。目前對膳食纖維的保健功能已有報道：姚建軍等[1]指出可以預(yù)防腸道疾病的發(fā)生，丁莎莎等[2]指出可以緩解重金屬離子對人體的危害，Sushil等[3]指出可以增強(qiáng)胰島素的能力等。膳食纖維是一類混合物的總稱，其主要包括碳水化合物與非淀粉多糖等。鄧澤麗等[4]指出利用山楂為原料進(jìn)行發(fā)酵飲料營養(yǎng)獨特。楊光等[5]指出山楂膳食纖維對小鼠有潤腸通便作用。膳食纖維在溶解性方面可被分為可溶性膳食纖維與不可溶性膳食纖維，李逸鶴等[6]指出制備膳食纖維的方法主要有4類：一為化學(xué)試劑法、二為酶與化學(xué)試劑相結(jié)合通過分離的方法可制備膳食纖維、三以分子量大小為依據(jù)可通過選擇性透過性膜進(jìn)行分離制備的膜分離法、四為選用一定的菌種采用發(fā)酵的方法制備膳食纖維的發(fā)酵法[7]。本文采用另外一種新方法超聲波輔助法來提取山楂水溶性膳食纖維，并對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。鑒于膳食纖維的功效以及山楂未來的發(fā)展，本試驗立足于提高山楂可溶性膳食纖維的含量。為以后山楂食品的研發(fā)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山楂（豫北紅）：鄭州水果市場；纖維素酶（5×104U/g）、α-淀粉酶（0.4×104U/g）、糖化酶（1×105U/g）：上海源葉生物科技有限公司；其他試劑：鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇等化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

KQ-700DE型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；BSA224S-CW電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；FCD-3000型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：河南兄弟儀器設(shè)備有限公司；XQ200克型多功能高速粉碎機(jī)：上海廣沙工貿(mào)有限公司；YFS30×8新國標(biāo)型圓形驗粉篩：杭州大成光電儀器有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；FD-1A-50真空冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；DELTA320pH計：瑞士梅特勒-托利多公司；PW-1710 X-射線衍射儀：荷蘭菲利浦公司；JSM-6490LV掃描電子顯微鏡：美國FEI公司；Vertex 70傅里葉變換紅外光譜儀：美國Bruker光學(xué)公司；MICROTRAC S3500型激光粒度分析儀：美國麥奇克有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 提取工藝

原料準(zhǔn)備：將山楂一分為四，用干燥箱將樣品烘干，然后用粉粹機(jī)將烘干的山楂粉粹，通過60目的篩子過篩收集。準(zhǔn)確稱取0.25 g山楂粉末倒入燒杯中。按照以下試驗設(shè)計處理：（1）回流脫脂；（2）加入α-淀粉酶與糖化酶水解去淀粉并同時加入纖維素酶；（3）超聲波輔助提??；（4）等電點去蛋白并低速離心取上清液；（5）醇析濃縮烘干，研磨粉粹即為山楂水溶性膳食纖維。并參考汪紅等[8]的方法，采用AOAC985.29方法對山楂水溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）的純度進(jìn)行測定。

1.3.2 計算公式

式中：m為山楂水溶性膳食纖維的質(zhì)量，g；M為用于試驗的總的山楂粉末質(zhì)量，g。

1.4 山楂水溶性膳食纖維的制備工藝條件的優(yōu)化

分別選取影響因素較高的超聲功率、超聲時間、pH值和酶添加量進(jìn)行單因素試驗。在單因素試驗基礎(chǔ)上選取3個梯度水平進(jìn)行正交工藝優(yōu)化試驗。以山楂水溶性膳食纖維（SDF）的得率為試驗指標(biāo)。

1.5 山楂水溶性膳食纖維的結(jié)構(gòu)性質(zhì)研究

1.5.1 山楂水溶性膳食纖維的掃描電子纖維的測定

參考邱禮平等[9]方法并略作修改：取適量山楂水溶性膳食纖維粉末平鋪到工作臺上，蓋上一層導(dǎo)電帶，其厚度約為20 nm。之后將上述樣品放入真空蒸發(fā)皿中并噴金。噴金厚度50 nm左右。最后用掃描電子顯微鏡3 000、5 000、10 000倍下進(jìn)行電鏡掃描，觀察顆粒形貌。

1.5.2 山楂水溶性膳食纖維的粒徑分布

參考伊組濤等[10]方法并略作修改：用電子天平準(zhǔn)確稱取1.6 g山楂水溶性膳食纖維粉末，倒入25 mL小燒杯底部，添加蒸餾水使懸濁液的質(zhì)量濃度為5%，在常溫下將其放入超聲波儀器中超聲0.5 h。用激光粒度分析儀在0.1 μm～500 μm范圍內(nèi)分析掃描。

1.5.3 山楂水溶性膳食纖維的X-射線衍射測試

參考楊小玲等[11]方法并略作修改：準(zhǔn)確稱取山楂水溶性膳食纖維粉末0.5 g。設(shè)置相應(yīng)掃描參數(shù)：電壓（40 kV），電流（30 mA），選擇 Cu-Ka為 X-衍射特征線，衍射角度 2θ 為 5°～40°，0.02 為掃描步長，按照上述操作重復(fù)一遍。利用軟件計算山楂水溶性膳食纖維的結(jié)晶度。選擇4°～35°的之間的圖譜，并繪制出結(jié)晶區(qū)與無定形區(qū)的分割線，利用軟件直接讀出樣品的結(jié)晶度。

1.5.4 山楂水溶性膳食纖維的紅外光譜分析

取適量山楂水溶性膳食纖維樣品與KBr按1∶100的質(zhì)量比例混合。研磨均勻以后，在7 MPa的條件下，將混合樣品壓制成薄片，小心取出以防破碎。條件：掃描范圍為400 cm-1～4 000 cm-1，掃描次數(shù)64次，分辨率4 cm-1。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Origin 7.5、GC-MS 5977和SPSS 20.0對數(shù)據(jù)整理分析

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.2.1 超聲功率對山楂水溶性膳食纖維得率的影響

圖1所示在超聲時間8min、pH值5、加酶量0.4%的條件下，設(shè)置超聲功率 140、200、260、320、380 W。

圖1 超聲功率對水溶性膳食纖維得率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on the yield of soluble dietary fiber

從圖1中可看出，超聲功率上升至320 W以前，水溶性膳食纖維的得率上升趨勢與其保持一致，過后水溶性膳食纖維的提取得率隨超聲功率的增加而下降。原因可能是大功率下使得山楂提取液變得有些黏稠進(jìn)而難以提取[12]；或隨著超聲功率的增大使得細(xì)胞破裂致小分子內(nèi)容物釋出[13]。因此超聲功率選擇320 W左右為宜。

2.2.2 pH值對山楂水溶性膳食纖維得率的影響

圖2所示在超聲功率320 W、超聲時間8 min、加酶量為0.4%的條件下，設(shè)置pH 值為 4.2、4.5、4.8、5.1、5.4。

從圖2中可以看出，在pH值為4.2～4.5時，水溶性膳食纖維的得率隨著pH值的上升趨勢增加，當(dāng)pH值高于4.5時，水溶性膳食纖維的提取得率逐漸降低。原因可能是在pH值4.2～4.5時纖維素酶的活性較高，高于這個pH值時活性下降導(dǎo)致。因此pH值選擇4.5左右為宜。

2.2.3 超聲時間對山楂水溶性膳食纖維得率的影響

圖3所示在超聲功率320 W、pH4.5、加酶量0.4%的條件下，設(shè)置超聲時間分別為 3、6、9、12、15 min。

圖2 pH值對水溶性膳食纖維得率的影響Fig.2 Effect of pH on soluble dietary fiber yield

圖3 超聲時間對水溶性膳食纖維得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the yield of soluble dietary fiber

由圖3可以看出，隨著超聲時間的上升水溶性膳食纖維的提取得率亦呈現(xiàn)上升趨勢，當(dāng)超聲時間為12 min時，水溶性膳食纖維的提取得率便開始下降。這可能是由于長時間超聲時間導(dǎo)致不溶性膳食纖維分解進(jìn)而使水溶性膳食纖維的得率下降[14]。因此超聲時間選擇12 min左右為宜。

2.2.4 酶添加量對山楂水溶性膳食纖維得率的影響

圖4所示在超聲功率320 W、超聲時間12 min、pH值4.5條件下，設(shè)置酶添加量分別為0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%。

圖4 加酶量對溶性膳食纖維得率的影響Fig.4 Effect of enzyme content on the yield of soluble dietary fibe

圖中可以看出加酶量小于0.5%時，水溶性膳食纖維的得率呈現(xiàn)上升趨勢，當(dāng)酶的添加量超過0.5%之后，水溶性膳食纖維的得率逐漸降低。原因是在適量的纖維素酶的作用下不溶性膳食纖維可轉(zhuǎn)變?yōu)樗苄陨攀忱w維，過量的纖維素酶可使不溶性膳食纖維降解為單糖致使聚合度降低。導(dǎo)致部分水溶性膳食纖維無法醇沉。因此酶添加量選擇在0.5%左右為宜。

2.2 山楂水溶性膳食纖維提取的正交試驗

山楂水溶性膳食纖維提取的正交試驗見表1～表3。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Level of orthogonal experimental factors

表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment design and results

表3 可溶性膳食纖維的正交試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test results of soluble dietary fiber

由表2可知，不同因素對山楂水溶性膳食纖維得率影響大小為B超聲功率、D pH值、A超聲時間、C加酶量。通過方差分析超聲功率值具有顯著性影響，且最佳組合為 A1、B2、C2、D1；即最佳組合為超聲時間：11 min、超聲功率80%、加酶量：0.5%、pH值4.4。驗證上述試驗理論值的準(zhǔn)確性，按照上述正交試驗得到的因素值，參照提取可溶性山楂膳食纖維的方法平行3次試驗其結(jié)果優(yōu)于正交試驗二組結(jié)果，得到水溶性膳食纖維的得率為6.12%。并測的其純度為91.63%。

2.3 山楂水溶性膳食纖維的結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 山楂水溶性膳食纖維的形貌分析

山楂水溶性膳食纖維的形貌分析見圖5。

圖5 山楂水溶性膳食纖維的表觀結(jié)構(gòu)Fig.5 Apparent structure of water-soluble dietary fiber from hawthorn

圖5中通過掃描電鏡可以看出在10 000倍的電鏡下山楂水溶性膳食纖維呈現(xiàn)明顯的葡萄形狀且間隙十分明顯；5 000倍電鏡下可以看出各種葡萄形狀簇?fù)碓谝黄穑? 000倍電鏡下看出大的葡萄形狀的聚集在一塊，小型葡萄形狀的較為分散。

2.3.2 山楂水溶性膳食纖維的粒度分析

圖6為山楂水溶性膳食纖維的粒度分布曲線，表4是山楂水溶性膳食纖維的粒度測定結(jié)果。

表4 粒度測定結(jié)果Table 4 Particle size determination results μm

圖6 山楂水溶性膳食纖維的粒徑分布Fig.6 Size distribution of water-soluble dietary fiber from hawthorn

從圖6可以看出山楂水溶性膳食纖維在100 μm出現(xiàn)一個峰，呈現(xiàn)單峰分布近似正態(tài)分布。從表格2～4中可以看出d95值為85.6 μm相對較小，說明顆粒分布比較集中顆粒比較均勻。并且山楂水溶性膳食纖維的平均粒徑為19.5 μm。

2.3.3 山楂水溶性膳食纖維的X-射線衍射結(jié)果分析X-射線衍射結(jié)果見圖7。

圖7 山楂水溶性膳食纖維的X-衍射圖譜Fig.7 X-ray diffraction spectrum of water-soluble dietary fiber from hawthorn

該圖經(jīng)過5個點平滑處理，其特征衍射峰在2θ為19.56°。通過軟件擬合計算出山楂水溶性膳食纖維的結(jié)晶度為13.45%。

2.3.4 山楂水溶性膳食纖維的傅里葉紅外光譜分析

山楂水溶性膳食纖維的傅里葉紅外光譜分析見圖8。

圖8 山楂水溶性膳食纖維的傅里葉紅外光譜分析Fig.8 Fourier transform infrared spectroscopy analysis of water soluble dietary fiber from hawthorn

從圖8可以看出，山楂水溶性膳食纖維在3450cm-1～2 900 cm-1處有一較強(qiáng)的吸收峰，此峰是羥基特征峰。糖類亞甲基峰的振動直接導(dǎo)致在2 900 cm-1～2 800 cm-1處有相一較小吸收峰。山楂水溶性膳食纖維在1 647 cm-1有一個吸收峰，直接印證了樣品中含有糖醛酸。

3 結(jié)論

本試驗主要對超聲波輔助提取山楂水溶性膳食纖維的提取工藝與其結(jié)構(gòu)性質(zhì)進(jìn)行研究，為以后開發(fā)山楂產(chǎn)品提供理論與數(shù)據(jù)支撐。主要得到了以下結(jié)論：

1）最佳工藝為超聲時間：11 min、超聲功率320 W、加酶量：0.5%、pH值4.4。利用最佳條件提取出的山楂水溶性膳食纖維的得率為6.12%，并測得其純度為91.63%。

2）對山楂水溶性膳食纖維的結(jié)構(gòu)分析研究：通過電鏡掃描呈現(xiàn)葡萄狀；通過粒徑分析其顆粒分布集中，且平均粒徑為19.5 μm；通過X-衍射分析可以得出其結(jié)晶度為13.45%；通過紅外分析表明山楂水溶性膳食纖維在 3 450 cm-1～2 900 cm-1、2 900 cm-1～ 800 cm-1、1 647 cm-1、直接印證了其含有羥基、糖類亞甲基、糖醛酸等基團(tuán)。