干酪乳桿菌CRISPR基因座分析

楊蘭，楊洋，李偉勛，Obaroakpo JOY，逄曉陽，呂加平

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干酪乳桿菌CRISPR基因座分析

楊蘭，楊洋，李偉勛，Obaroakpo JOY，逄曉陽，呂加平

（中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193）

【目的】目前基于釀膿鏈球菌()spCas9為核心的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)在乳酸菌上的應(yīng)用受到很多限制，亟待開發(fā)適合于乳酸菌的基因編輯系統(tǒng)。對6株干酪乳桿菌()的CRISPR系統(tǒng)進行深入分析，并預測激活干酪乳桿菌自身Cas9蛋白所識別的PAM序列，為開發(fā)適用于乳酸菌的CRISPR/lcCas9基因編輯系統(tǒng)奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā恳砸淹瓿扇蚪M測序的6株干酪乳桿菌為研究對象，利用生物信息學方法對其CRISPR系統(tǒng)進行深入分析，重點對不同菌株的CRISPR系統(tǒng)結(jié)構(gòu)進行解析，并且對Cas蛋白以及spacer的同源性進行分析，最后對CRISPR區(qū)重復序列的二級結(jié)構(gòu)以及Cas9蛋白識別的PAM序列進行預測。【結(jié)果】6株干酪乳桿菌CRISPR系統(tǒng)具有相似的結(jié)構(gòu)，均具有特征性的Cas9蛋白，并且Cas基因序列保守。預測到tracrRNA位于Cas9和Cas1之間，重復序列可以形成莖部長達7個堿基的二級結(jié)構(gòu)。根據(jù)CRISPR的間隔區(qū)序列，6株干酪乳桿菌可被分為3個基因型，將間隔區(qū)逐一進行blast比對，結(jié)果表明6個間隔區(qū)比對上14個來源不同的原間隔序列，這些間隔序列均來源于不同質(zhì)粒。干酪乳桿菌lcCas9蛋白識別PAM序列的1、3位堿基偏好T/C、A/C，2、4位堿基對G、A的偏好性比較大。【結(jié)論】6株干酪乳桿菌CRISPR系統(tǒng)均為type-ⅡA型，序列和重復序列高度保守。DR序列可以形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，TGMA為干酪乳桿菌Cas9蛋白高效識別的PAM序列。

干酪乳桿菌；CRISPR系統(tǒng)；spacer；；PAM

0 引言

【研究意義】隨著分子生物學和高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展，人類已經(jīng)完成了數(shù)以千計乳酸菌的全基因組測序，但是目前對于乳酸菌全基因組的研究仍然面臨兩大艱巨任務(wù)，一是如何更精確解讀基因組測序得到的海量數(shù)據(jù)；二是如何對乳酸菌基因組進行遺傳修飾，更加突出乳酸菌的益生功能。近年來，研究火熱的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)為高效完成上述兩大任務(wù)提供了強有力的工具。目前應(yīng)用最多的CRISPR/Cas9系統(tǒng)是以釀膿鏈球菌（）的spCas9為核心構(gòu)建的，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于真核生物的基因組編輯[1-3]。然而它在乳酸菌中的應(yīng)用仍然受到很大限制，主要原因是spCas9在多數(shù)乳酸菌內(nèi)有較高的細胞毒性；另外，spCas9蛋白較大、異源蛋白密碼子偏好性等也是限制該系統(tǒng)在乳酸菌成功應(yīng)用的重要原因。對乳酸菌自身CRISPR系統(tǒng)進行深入研究，解析乳酸菌抵御噬菌體等外源遺傳基因侵染的機制，對于后續(xù)開發(fā)適合于乳酸菌的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)具有重要意義。另一方面，干酪乳桿菌作為具有益生功能的微生物發(fā)酵劑被廣泛的用于食品發(fā)酵中，具有降血壓[4]、調(diào)節(jié)腸道菌群[5]和提高機體免疫力[6]等促進健康的作用。深入研究該菌CRISPR系統(tǒng)行使免疫功能的機制，將為解決乳酸菌工業(yè)發(fā)酵過程中易受到噬菌體的侵染導致發(fā)酵失敗提供重要的理論依據(jù)。【前人研究進展】CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）/Cas（CRISPR associated）系統(tǒng)是細菌的一種獲得性免疫系統(tǒng)，用來抵御噬菌體、質(zhì)粒等外源DNA的侵害[7]。CRISPR基因座包括CRISPR序列和Cas蛋白，CRISPR序列由重復序列（repeat）和間隔序列（spacer）交替組成[8]。在前導區(qū)的調(diào)控下，CRISPR序列轉(zhuǎn)錄為pre-crRNA[9-10]，與一種反式編碼的小RNA（tracrRNA）通過堿基配對形成雙鏈RNA（dsRNA）區(qū)域，在Cas蛋白存在下被RNase III切割加工成熟，然后與細菌自身的Cas核酸酶形成核酸蛋白復合體[11]。在type-II型系統(tǒng)中，當入侵的外源DNA和crRNA序列配對結(jié)合，同時Cas9蛋白識別對應(yīng)的特異性PAM序列，就能夠?qū)θ肭值腄NA進行靶向切割，從而得到破壞外源DNA、實現(xiàn)自我防御的目的[12]。CRISPR/Cas系統(tǒng)的機制和功能日益清晰，科學家逐漸意識到可以將其應(yīng)用于基因編輯。目前，CRISPR/Cas編輯系統(tǒng)飛速發(fā)展，已經(jīng)被迅速應(yīng)用于小鼠[13-15]、大鼠[16]、斑馬魚[17-18]、秀麗隱桿線蟲[19]、擬南芥[20-21]及大腸桿菌[22-23]等多個物種，成為基因組精準編輯的有力工具[24-26]，但是目前在乳酸菌中利用此系統(tǒng)進行成功編輯的研究還較少。OH等[27]將CRISPR/Cas9系統(tǒng)引入羅伊氏乳桿菌中，結(jié)合RED重組技術(shù)實現(xiàn)了對乳酸菌基因組的成功編輯，這是CRISPR/Cas9系統(tǒng)在乳酸菌上應(yīng)用的首次報道。但是該研究也存在一些問題，其Cas9蛋白載體的構(gòu)建是一種組成型表達，而且構(gòu)建敲除系統(tǒng)所用質(zhì)粒較多，電轉(zhuǎn)化效率不是很高，影響了基因編輯的效率。目前在乳酸菌領(lǐng)域使用的基因編輯方法仍然是傳統(tǒng)的基于基因同源重組的策略，至少需要24 d才能獲得一個基因敲除，這是相當繁瑣且耗時的[28]?！颈狙芯壳腥朦c】目前的CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于乳酸菌還存在很多限制因素，亟待對該系統(tǒng)進行改進優(yōu)化。本研究以干酪乳桿菌（）的CRISPR系統(tǒng)為切入點，深入研究該菌的CRISPR系統(tǒng)行使免疫功能的機制，解析lcCas9識別的PAM序列?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究對干酪乳桿菌不同菌株CRISPR系統(tǒng)進行深入分析，重點解析lcCas9蛋白識別的PAM序列，以期對現(xiàn)有CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行改良，為開發(fā)適用于乳酸菌的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗于2017年10月—2018年7月在中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)加工研究所乳品研究實驗室進行。

1.1 材料

NCBI Genbank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫中已公布全基因組序列的6株干酪乳桿菌。這些菌株包括：干酪乳桿菌BD-Ⅱ（NC_017474.1）、干酪乳桿菌BL23（NC_010999.1）、干酪乳桿菌LC2W （NC_017473.1）、干酪乳桿菌W56（NC_018641.1）、干酪乳桿菌ZHANG（NZ_CP001084.1/NC_014334.2）、干酪乳桿菌LOCK919（NC_021721.1）。

1.2 方法

1.2.1 CRISPR系統(tǒng)結(jié)構(gòu)分析 使用CRISPR-CAS++（https://crisprcas.i2bc.paris-saclay.fr/CrisprCasFinder/Index）以及CRISPRdisco軟件對CRISPR系統(tǒng)進行查找，包括CRISPR序列及位置，確定CRISPR/Cas系統(tǒng)的類型。使用MEGA7對進行序列同源性分析。使用IBS 1.0.2進行基因結(jié)構(gòu)作圖。

1.2.2 TracrRNA位置預測 基于之前對大量tracrRNA同源物的研究[29]，tracrRNA在CRISPR基因座內(nèi)的位置并不是保守的，在4個典型的位置中發(fā)現(xiàn)了反重復序列，分別為：Cas9的上游，Cas9和Cas1之間以及CRISPR序列的上下游。為了預測新的tracrRNA，通過一系列序列比對篩選了CRISPR/Cas基因座非repeat-spacer序列，包括Cas9上游1 kb、Cas9-Cas1之間以及CRISPR序列上下游1 kb兩條鏈的序列；驗證CRISPR重復：反重復配對情況。將篩選出的反重復序列使用Promoter 2.0 prediction server（http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/）預測啟動子，使用ARNold（http://rna.igmors.u-psud.fr/）預測終止子。

1.2.3 DR序列的二級結(jié)構(gòu)預測 在前導區(qū)的調(diào)控下，CRISPR基因座轉(zhuǎn)錄為單鏈RNA分子（pre- crRNA）[9-10]。由于CRISPR重復序列部分回文性質(zhì)，其可能形成穩(wěn)定的發(fā)夾二級結(jié)構(gòu)[8,30]。使用RNAalifold web server（http://nibiru.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/ RNAalifold.cgi）進行二級結(jié)構(gòu)預測，計算方法采用最小自由能法（minimum free energy，MFE），其他參數(shù)選擇默認。

1.2.4 間隔區(qū)多樣性及同源性分析 通過祖先間隔區(qū)和保守間隔區(qū)的分布可以將CRISPR序列分型將間隔區(qū)序列進行，使用Clustal X進行序列相似性分析。將6株菌的spacer逐一進行blast，查找預期匹配的原間隔序列，最多允許3個不匹配，并對原間隔序列進行溯源。篩選去除來源于CRISPR序列的同源序列，選擇來源于噬菌體或質(zhì)粒的序列作為潛在的外源遺傳元件[31-33]。

1.2.5 PAM序列預測及其可視化 使用CRISPR target（http://bioanalysis.otago.ac.nz/CRISPRTarget/crispr_analysis.html）分析來源不同的原間隔序列非靶標鏈下游10個堿基序列。使用weblogo（http://weblogo.berkeley. edu/logo.cgi）對每個位點的堿基偏好性進行可視化。

2 結(jié)果

2.1 干酪乳桿菌CRISPR基因座結(jié)構(gòu)

本研究的6株干酪乳桿菌中均只有一個已證實的CRISPR系統(tǒng)，同時在干酪乳桿菌ZHANG基因組上還存在5個疑似CRISPR區(qū)域，在干酪乳桿菌ZHANG質(zhì)粒上存在1個疑似CRISPR區(qū)域，在干酪乳桿菌LOCK919質(zhì)粒上存在一個疑似CRISPR區(qū)域，這些區(qū)域雖然存在簡單的重復間隔區(qū)，但是均只有1—2個間隔區(qū)，且不存在，本研究對此不進行深入分析（表1）。分析6株干酪乳桿菌確認的CRISPR系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)4個（、、、）位于CRISPR序列側(cè)翼。6株菌的基因組上均含有標志性基因，可以確定其CRISPR系統(tǒng)為type-ⅡA型。CRISPR序列最長的為1 424 bp，含有21個間隔序列，最短的為762 bp，含有11個間隔序列，重復序列均為36 bp，間隔序列為28—31 bp。對Cas蛋白序列保守型的比較分析表明，這些菌株的Cas蛋白之間具有高度的相似性。包括干酪乳桿菌BD-Ⅱ、干酪乳桿菌BL23、干酪乳桿菌LC2W、干酪乳桿菌W56、干酪乳桿菌ZHANG在內(nèi)的菌株，他們的Cas蛋白序列相似性均達到了100%，僅LOCK919與他們有微小差別，但相似性仍然達到90%以上（圖1）。

圖1 干酪乳桿菌CRISPR基因座結(jié)構(gòu)

表1 6株干酪乳桿菌CRISPR序列情況

2.2 TracrRNA位置預測

對6株菌株tracrRNA的預測表明，其tracrRNA均位于與之間，與轉(zhuǎn)錄方向相反（圖2）。tracrRNA與repeat區(qū)有高達30 bp的配對，并成預測tracrRNA的啟動子和終止子。啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子預測作為非必要的步驟，計算機模擬預測算法可以提供參考，若要獲得準確的序列可以進行RNA深度測序驗證。

圖2 干酪乳桿菌tracrRNA在CRISPR基因座中的位置

2.3 DR序列的二級結(jié)構(gòu)分析

DR序列轉(zhuǎn)錄成非信使RNA，以特殊的結(jié)構(gòu)發(fā)揮功能。隨著轉(zhuǎn)錄的進行，連續(xù)的單鏈重復序列形成二級結(jié)構(gòu)，莖可長達4—8個堿基，從而產(chǎn)生更穩(wěn)定的RNA結(jié)構(gòu)。為了評估干酪乳桿菌CRISPR重復序列形成穩(wěn)定的RNA二級結(jié)構(gòu)的可能性，使用RNAalifold來預測重復序列的分子內(nèi)RNA結(jié)構(gòu)。預測到的DR序列二級結(jié)構(gòu)自由能為-2.50 kcal/mol，莖長度達7個堿基，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定（圖3）。

2.4 間隔區(qū)多樣性分析

本研究發(fā)現(xiàn)40個獨特的間隔區(qū)類型（圖4），根據(jù)祖先間隔區(qū)及保守間隔區(qū)的位置，6株菌被分為3種CRISPR類型。其中BD-Ⅱ、BL23、LC2W分享完全相同的間隔區(qū)，W56與他們共享祖先間隔區(qū)，但是有3個間隔區(qū)不同，這3個不同的間隔區(qū)又與之前的序列高度相似。ZHANG與GENOTYPE 1型共享一些保守的間隔區(qū)，但是具有不完全相同的祖先間隔區(qū)及部分獨特間隔區(qū)。LOCK919享有所有的獨特間隔區(qū)。

圖3 重復序列的RNA二級結(jié)構(gòu)

圖4 6株干酪乳桿菌CRISPR間隔區(qū)多樣性分析

2.5 間隔序列同源性分析

為了確定CRISPR間隔區(qū)的可能起源，研究其與已知序列的同源性。得到與干酪乳桿菌的部分間隔區(qū)高度匹配的噬菌體或質(zhì)粒序列，其中包括某些完全匹配（表2）。BD-Ⅱ、BL23、LC2W、W56的spacer21序列均與乳桿菌的質(zhì)粒pREN 100%匹配。ZHANG的spacer14序列與乳酸乳球菌乳酸亞種和乳酸乳球菌乳脂亞種的質(zhì)粒僅有一個堿基錯配。Spacer15序列與巴克乳桿菌、副干酪乳桿菌、卡氏雙球菌、植物乳桿菌、短乳酸桿菌、乳明串珠球菌、戊糖片球菌中的質(zhì)粒有1—3個堿基錯配。

Blast的結(jié)果中40個間隔區(qū)只有6個間隔區(qū)比對上了原間隔序列，這其中還包括一些非完全匹配序列。另外匹配到原間隔序列的spacer均為新獲取的間隔區(qū)，祖先間隔區(qū)均未匹配到有效序列，這可能是由于數(shù)據(jù)庫的不完整以及噬菌體質(zhì)粒進化過程中發(fā)生突變所致。ZHANG的spacer14和spacer15匹配到了多株菌的質(zhì)粒，這表明一個間隔序列可以抵抗多種外源元件的侵入。僅有幾個間隔區(qū)能夠匹配上編碼蛋白的基因，ZHANG的spacer15匹配到了來源于植物乳桿菌pXY3質(zhì)粒的ORF4，BD-Ⅱ、BL23、LC2W、W56的spacer21以及ZHANG的spacer來源于副干酪乳桿菌的質(zhì)粒均匹配到的是假定的蛋白，其余間隔區(qū)均未匹配到編碼蛋白的序列。結(jié)果表明，所有間隔序列的來源均為質(zhì)粒，但是這并不能說明抗噬菌體的能力較弱，僅有較少的新間隔區(qū)在數(shù)據(jù)庫中得到匹配，絕大多數(shù)的間隔區(qū)沒有得到匹配，噬菌體數(shù)據(jù)庫不完善成為了主要限制因素，blast結(jié)果只能成為細菌抗噬菌體能力的一種參考。

2.6 干酪乳桿菌Cas9蛋白識別PAM序列的預測

分析結(jié)果表明，干酪乳桿菌PAM序列的1、3位堿基偏好T/C、A/C，2、4位堿基對G、A的偏好性比較大，推測干酪乳桿菌CRISPR系統(tǒng)識別效率最高的PAM序列為TGMA（圖5）。但是通過生物信息學分析的方法預測到的原間隔序列有限，所以這一方法可以對CRISPR系統(tǒng)識別的PAM進行初步預測，對于將這一系統(tǒng)應(yīng)用于基因編輯，后續(xù)將通過分子試驗進一步驗證。

3 討論

CRISPR/Cas系統(tǒng)是細菌的獲得性免疫系統(tǒng)，存在于46%細菌和84%古菌基因組中[31,34]。免疫功能由細菌基因組上的CRISPR序列和Cas蛋白執(zhí)行，Cas1-Cas2復合物將新捕獲的外源間隔序列整合入細菌的CRISPR區(qū)[35]，間隔序列的插入代表著入侵者的特征遺傳信息存儲到宿主基因組。當入侵者再次侵染時，菌體自身的CRISPR系統(tǒng)會快速識別入侵者并引導相關(guān)Cas蛋白對入侵者DNA序列進行特異性切割破壞，從而發(fā)揮免疫作用。值得注意的是，間隔區(qū)在CRISPR基因座上的排列是按照進化時間順序的，新獲取的間隔區(qū)序列總是被整合到CRISPR位點的前導序列和第一個重復間隔單元之間[31]。因此，間隔區(qū)的位置可以代表他們被捕獲時間的先后，這也為細菌提供了一種基于獨特高變的基因座基因分型方法[36]。本研究通過分析確定其均為type-ⅡA型系統(tǒng)，并且基于CRISPR序列，將6株菌分為3個基因型。通過對其Cas蛋白序列對比分析，發(fā)現(xiàn)6株菌的Cas蛋白相似性較高，ZHANG與BD-Ⅱ等菌株Cas蛋白相似度均為100%，但是其間隔區(qū)卻不完全相同，僅共享一部分保守間隔區(qū)。LOCK919與其他菌株Cas蛋白相似度達到90%左右，但是他們的間隔區(qū)完全不同，保守的祖先間隔區(qū)意味著菌株之間具有較高的親緣關(guān)系，而后來獲得的間隔區(qū)由于相關(guān)菌株暴露于不同的外來侵入性DNA而不同。雖然間隔區(qū)的差異巨大，但是repeat以及tracrRNA和Cas蛋白比對結(jié)果相似，是高度保守的。

表2 干酪乳桿菌spacer對應(yīng)的原間隔區(qū)序列特點

圖5 干酪乳桿菌CRISPR系統(tǒng)識別PAM預測

通過對入侵者的靶標序列分析發(fā)現(xiàn)，原間隔序列側(cè)翼位置上有一段2—7個堿基的前間隔序列鄰近基序（Protospacer adjacent motif，PAM）[37]?，F(xiàn)有研究表明，細菌CRISPR系統(tǒng)在獲取新的間隔序列過程[38]和Cas9介導的靶序列特異性切割過程[10,39]中，PAM序列發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。PAM存在于入侵者靶標序列側(cè)翼但是在自身CRISPR序列中并不存在，這是宿主區(qū)分自我和非我的重要依據(jù)[40]。在不存在PAM的情況下，即使gRNA將Cas9蛋白引導到靶標基因的位置，Cas9蛋白也不會被激活，從而無切割活性。隨著不同宿主來源的CRISPR系統(tǒng)被研究的逐漸深入，越來越多的PAM序列被解析出來。目前廣泛使用的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)是基于釀膿鏈球菌Cas9（SpCas9）為核心構(gòu)建的，研究已證實該Cas9識別的經(jīng)典PAM序列是5-NGG-3，進一步的研究表明5-NAG/NGA-3也是其識別的非經(jīng)典PAM[40-42]。通過體外篩選試驗，研究人員發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌Cas9（SaCas9）識別更長的PAM(5-NNGRR(T)-3)，SaCas9體積小，有利于體內(nèi)基因組編輯[43-44]。不同來源的Cas9基因序列相似性不同使他們識別不同的PAM序列，這使得可以不斷探索不同物種Cas9蛋白所識別的PAM序列，豐富CRISPR工具庫，提高基因編輯效率。本研究使用CRISPRtarget對干酪乳桿菌lcCas9所識別的PAM進行了初步預測。40個間隔序列在GenBank-Phage、RefSeq-Plasmid、RefSeq-Viral數(shù)據(jù)庫中進行檢索，僅有3個序列得到了有效匹配，但是其中2個匹配到了多達13個不同質(zhì)粒。雖然間隔區(qū)是相同的，但是其匹配到的間隔區(qū)來源及錯配數(shù)都是不同的，而且得到有效匹配的間隔序列均位于CRISPR的新獲取間隔區(qū)，可靠性較強，表明TGMA非常有潛力成為高切割效率的PAM序列。

目前CRISPR/Cas9基因編輯方法在乳酸菌的應(yīng)用并不廣泛，受到了很多限制。對乳酸菌自身的CRISPR系統(tǒng)進行解析并基于此開發(fā)適合于乳酸菌的CRISPR/ cas9基因編輯系統(tǒng)，在乳酸菌遺傳改良方面具有重要應(yīng)用前景。本研究對干酪乳桿菌CRISPR基因座進行了全面的分析，預測了trcarRNA位置，并對PAM進行了初步預測，為解析干酪乳桿菌CRISPR系統(tǒng)提供了理論基礎(chǔ)。同時也為解決乳酸菌工業(yè)發(fā)酵中噬菌體侵染這一產(chǎn)業(yè)難題提供了十分重要的理論依據(jù)，具有較高的應(yīng)用價值和實際意義。

4 結(jié)論

6株干酪乳桿菌CRISPR系統(tǒng)均為type-ⅡA型，Cas基因序列和重復區(qū)序列保守，tracrRNA位于Cas9和Cas1蛋白之間。DR可以形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，根據(jù)間隔區(qū)序列可以將6株菌株分為3種基因型，TGMA為干酪乳桿菌CRISPR系統(tǒng)高效識別的PAM序列。

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CRISPR Locus Analysisof

YANG Lan, YANG Yang, LI WeiXun, Obaroakpo JOY, PANG XiaoYang, Lü JiaPing

(Institute of Food Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193)

【Objective】The application of the CRISPR/Cas9 gene editing system based onspCas9 has restriction on lactic acid bacteria at present. It is urgent to develop a suitable gene editing system for lactic acid bacteria. In this study, we analysed the CRISPR system ofin depth, and then predicted the PAM sequence to activate its Cas9 protein. Our study provided the experimental foundation for the development of the CRISPR/lcCas9 gene editing system for lactic acid bacteria 【Method】In this study, six strains of whole genome-sequencedwere used as research object. Bioinformatics was used to analyze the CRISPR system. Cas protein structure, CRISPR system and homology of space were analysed. At the end, the second structure of the CRISPR repeat and PAM sequence recognized by Cas9 protein were predicted. 【Result】The CRISPR system ofhad similar structures characteristic of Cas9 protein, and the Cas gene were conserved. It was predicted that the tracrRNA was located between Cas9 and Cas1, and the repeat sequence could form a secondary structure with a stem length of seven bases. According to the sequence characteristics of CRISPR spacers, sixcould be divided into three genotypes. Then the spacer sequences were blasted one by one. The results showed that the six spacers aligned 14 original source sequences with different origins, and these spacer sequences were all derived from different plasmids. The PAM sequence recognized bylcCas9 protein preferred T/C, A/C at the 1stand 3rdbases. The 2ndand 4thbases had greater preferences for G and A.【Conclusion】The CRISPR system of six strains ofwere all type-IIA. Consequently, thegene and repeat sequences were highly conserved. The DR sequence formed a stable secondary structure, while TGMA as a PAM sequence was effectively identified by the Cas9 proetein of..

; CRISPR system; spacer;gene; PAM

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.03.012

2018-08-03；

2018-11-14

國家重點研發(fā)計劃（2017YFC1600903）、國家自然科學基金面上項目（31871833）

楊蘭，E-mail：poplarorchid@163.com。通信作者逄曉陽，E-mail：pangxiaoyang@163.com。通信作者呂加平，E-mail：lvjp586@vip.sina.com

（責任編輯 趙伶俐）