雌性駱駝繁殖研究進展

哈斯高娃，烏日罕，伊茹汗，唐斯嘎，韓烏蘭圖雅，娜仁花

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 動物科學學院，呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，呼和浩特 010018）

幾個世紀以來，駱駝一直是沙漠地區(qū)的重要動物，大型和小型駱駝科動物在干旱地區(qū)或高原地區(qū)上發(fā)揮著重要作用。因為它能夠在嚴酷、炎熱以及干燥的環(huán)境中提供奶，肉類以及運輸。駱駝科包含舊世界駱駝屬和新世界駱駝屬，舊世界駱駝包括兩種：單峰駱駝和雙峰駱駝[1]，新世界駱駝屬分為駝羊、羊駝、原駝和駱馬[2]。單峰駱駝在北非、阿拉伯和南亞的炎熱干燥氣候的環(huán)境中生長，而雙峰駱駝在更寒冷的地區(qū)發(fā)現(xiàn)，如俄羅斯南部、中國和蒙古。駱駝生長緩慢，比其他牲畜物種更晚到達青春期,雙峰駱駝母駝3歲性成熟。公、母駱駝混群放牧時，4歲的母駱駝才能產(chǎn)羔。適宜的配種年齡為4～5歲，繁殖年齡為18～20歲。母駱駝發(fā)情期集中在冬、春兩季。 發(fā)情期在12月下旬到第2年1月中旬[3]，駱駝的妊娠期為390 d，平均出生體重35～40 kg[4]。駱駝在天然牧場條件下的繁殖效率很低，也是影響駱駝生產(chǎn)力的重要因素之一。繁殖效率低的原因包括繁殖季節(jié)相對較短，進入青春期比較晚和13個月的長妊娠期。駱駝的繁殖壽命比其他物種長，并且其生育能力會隨著年齡的增長和因為發(fā)病而下降。

1 駱駝卵巢卵泡動力學

對卵泡生長階段精確的定義有助于更好了解家畜生殖周期。駱駝是誘導(dǎo)性排卵動物,在非懷孕的生殖周期中沒有黃體[5]。其排卵是在交配后24～48 h后開始的。在繁殖季節(jié)，駱駝卵巢卵泡的生長和發(fā)育以及卵母細胞的產(chǎn)量都較高，小、中、大卵巢以及卵巢卵泡總數(shù)在繁殖期間高于非繁殖季節(jié)[6]。在成年駱駝中，卵巢具有蠶豆的形狀，長2 cm，寬1.5 cm。 子宮是雙角的，但與其他反芻動物不同的是，因為子宮角短，缺乏典型的子宮子葉[7]。駱駝不育的最常見原因是卵巢發(fā)育不全，病情可能是單側(cè)或雙側(cè)卵巢發(fā)育不全，卵巢雙側(cè)發(fā)育不全的駱駝將沒有原始卵泡，因此是沒有生育功能的[8]。據(jù)Smesbah等人報道，單峰駱駝的每個卵巢的卵泡平均數(shù)（±SD）是11.57±7.45，小于4歲為9.11±5.74，大于4歲為12.18±7.72。每個卵巢2～4 mm卵泡的平均數(shù)量在小于等于4歲時為8.75±5.80,大于4歲時的單峰駱駝卵巢卵泡數(shù)為11.67±7.38[9]。單峰駱駝卵巢卵泡波可為四個階段，招募階段、生長階段、成熟階段以及回歸階段。在招募階段平均招募12個卵泡。卵泡的生長階段是卵泡招募后進行，3～6個卵泡長到約8 mm直徑 （持續(xù)時間：6.10±0.15 d）。成熟階段由一個或兩個生長的卵泡成為優(yōu)勢卵泡（持續(xù)時間：10.20±0.47 d）時開始，并在優(yōu)勢卵泡（DF）失去其優(yōu)勢并排卵，下一個卵泡波出現(xiàn)時結(jié)束[10]。

評估雌性駱駝的卵巢狀況可以通過直腸觸診或通過超聲檢查。早先在單峰駱駝中了解卵泡波模式是基于少數(shù)動物的驗尸檢查和直腸觸診。據(jù)研究結(jié)果報告，在非交配情況下優(yōu)勢卵泡的壽命，即從卵泡首次出現(xiàn)時到卵泡消退時的天數(shù)為，印度的17～23 d[11]，埃及24 d[12]，在蘇丹28 d[5]。在雙峰駝中，平均優(yōu)勢卵泡壽命為19 d（14～21 d）[13]。在駝羊中，小卵泡每天生長0.5～1.0 mm，直到它們直徑達到1.0 cm，然后通常只有一個卵泡繼續(xù)生長成為優(yōu)勢卵泡，而其他卵泡則會退化[14]。在單峰駱駝和雙峰駱駝中，優(yōu)勢卵泡的平均最大直徑為2.0±0.1 cm，但在單峰駱駝的大約50%的發(fā)情周期中，優(yōu)勢卵泡繼續(xù)生長至直徑為4.2±0.2 cm[15]。這包括從形成優(yōu)勢卵泡并且能夠排卵，到?jīng)]有交配時的時間，它開始退化。

將雌性駱駝與雄性一起飼養(yǎng)，當優(yōu)勢卵泡的直徑為1.3±0.2 cm，小于非交配駱駝的1.5～2.5 cm優(yōu)勢卵泡時，它們通常會交配[16]。在交配的駱駝中，通過快速檢測，排卵交配后28～36 h內(nèi)成熟卵泡消失?？梢澡b定發(fā)育的黃體（CL）在交配后第4～5 d通過超聲檢查的到，到第8～9 d時尺寸最大，黃體會在第9～12 d退化[17,18]。

2 駱駝卵母細胞體外培養(yǎng)

體外卵母細胞成熟在輔助生殖技術(shù)（ART）中起著至關(guān)重要的作用。核成熟，包括排出第一極體（1PB），細胞質(zhì)成熟和卵丘細胞（CC）擴增是卵母細胞體外成熟（IVM）的標準。據(jù)報道，在繁殖季節(jié)單峰駱駝的卵母細胞的成熟率為68.2%，而在非繁殖季節(jié)卵母細胞成熟率降至44.4%[19]。Russo等人用熒光共聚焦在單峰駱駝卵母細胞中觀察生物能和氧化狀態(tài)，其與卵母細胞減數(shù)分裂階段有關(guān)。在IVM后，61%的卵母細胞恢復(fù)減數(shù)分裂，36%的卵母細胞達到減數(shù)分裂II期（MII）。在生發(fā)泡（GV）階段未成熟卵母細胞線粒體聚集體均勻分布，與GV期卵母細胞相比，MI和MII卵母細胞在皮質(zhì)周管狀網(wǎng)絡(luò)（PCTN）中顯示更高的線粒體分布率，MI和MII卵母細胞中的線粒體活性也增加了。MI和MII期卵母細胞的活性氧（ROS）水平也比GV期卵母細胞顯著增加[20]。

據(jù)報道，駱駝卵母細胞可以在30 h的最佳培養(yǎng)時間內(nèi)體外成熟。將培養(yǎng)時間從36 h延長至48 h導(dǎo)致卵母細胞退化。駱駝卵母細胞處于竇卵泡的生發(fā)泡階段時，卵母細胞的成熟將處于第一次減數(shù)分裂的前期I。GVBD所需的時間從不到6 h連續(xù)到30 h[21]。據(jù)報道，在培養(yǎng)單峰駱駝卵丘卵母細胞時，觀察到從培養(yǎng)的第12 h開始會排出第一極體（6.35%），在48 h期間，觀察到在288個卵丘卵母細胞復(fù)合物（COCs）中排出63個第一極體（21.88%），在24 h時觀察到第一極體排出最高速率（25.40%）[9]。

據(jù)報道，卵巢卵泡大小對單峰駱駝的卵母細胞質(zhì)量是有影響的。Khatir等人通過體外和體內(nèi)的發(fā)育能力來衡量卵母細胞質(zhì)量，COCs的體外成熟（IVM），體外受精（IVF）和體外培養(yǎng)（IVC）后，來自大卵泡的卵母細胞卵裂率比小卵泡的更高。來自小卵泡的囊胚沒有一個導(dǎo)致懷孕，而68%（15/22）的來自大卵泡的胚胎發(fā)育成25 d的妊娠。 在由此產(chǎn)生的15例妊娠中，53%（n=8）中止妊娠（5例2個月和4個月之間，3例在懷孕5～7個月之間）。 剩下的7名懷孕雌性駱駝生下了正常健康的后代（4峰雌性和 3 峰雄性）[22]。

3 雌性駱駝卵泡周期的激素水平變化

與其他駱駝科觀察結(jié)果一致的是，在美洲駝中，黃體溶解始于排卵后第7 d，并在第10 d完成黃體溶解[23]。在單峰駱駝血漿中，促黃體生成素（LH）濃度在交配后1 h內(nèi)增加，2～3 h后達到最大濃度3～19 ng/mL，然后在交配后6 h開始減少[18]。在雙峰駝中，在交配后約4 hLH濃度約為6.9 ng/mL，然后在8 h后LH的濃度會減少[24]。在人工授精與自然交配的雙峰駱駝中，排卵后雌二醇-17β的濃度立即降低，而排卵后3 d再次上升，在排卵后13 d當懷孕開始時，雌二醇濃度再次下降[25]。

Skidmore等人報道，可以通過GnRH或hCG以及自然交配誘導(dǎo)使單峰駱駝排卵，用促性腺激素釋放激素（GnRH）或人絨毛膜促性腺激素（hCG）處理的最佳時間是當生長的卵泡直徑在0.9和1.9 cm之間時[26]。

在單峰駱駝的發(fā)情周期期間，雌二醇（E2）的濃度會有一定的變化。 發(fā)情周期的長度為17.2 d，在妊娠第10個月，E2水平突然上升并持續(xù)上升至第12個月，然后激素濃度下降直至分娩當天。 非繁殖季節(jié)（5月至11月）的E2水平較低[27]。在發(fā)情周期中，隨著卵巢卵泡大小的增加，雌激素與睪酮濃度也會上升，然后其濃度隨著卵泡的消退而減少[28]。

隨著卵泡大小的增加，卵泡液中膽固醇濃度也顯著增加。卵泡膽固醇來自兩個來源，即卵泡顆粒細胞中的乙酸鹽和血漿中的脂蛋白[29]。顆粒細胞在其生長和增殖過程中需要膽固醇[30]。

在已懷孕的單峰駝中，攜帶雄性胎兒的駱駝的孕酮水平高于攜帶雌性胎兒的駱駝水平，而雌二醇濃度低于攜帶雌性胎兒的駱駝水平。由此可見，在單峰駱駝中類固醇激素水平受到胎兒性別的影響[31]。

Ararooti等人經(jīng)過給單峰駱駝注射FSH、eCG-FSH和 hMG后觀察其超數(shù)排卵反應(yīng)，隔12～15 d注射兩次GnRH類藥物使單峰駱駝的卵泡波同步，在GnRH類藥物處理后2 d后，每3峰駱駝組成的組，接受不同的超數(shù)排卵方案，分別使用促卵泡素（FSH），馬絨毛膜促性腺激素(eCG)和FSH，人絕經(jīng)期促性腺激素（hMG）對單峰駱駝進行超數(shù)排卵，每天注射兩次，連續(xù)注射5 d并逐漸減少劑量，在最后一次注射的36 h后交配一次并靜脈注射GnRH類藥物，通過超聲檢查評估超數(shù)排卵后第4 d卵巢卵泡的直徑和數(shù)量≥4mm，交配后第7.5 d的黃體和卵泡總數(shù)≥9 mm，觀察到FSH，eCG-FSH和hMG中的黃體總數(shù)與FSH，eCG-FSH和hMG處理的單峰駱駝中擴大的孵化囊胚的數(shù)量之間沒有顯著差異。這項研究表明，三種超排卵方案都可以在單峰駱駝中成功使用并互相替換[32]。

4 駝卵巢囊腫

雌性駱駝的繁殖性能和不孕的原因也包括卵巢異常。Dawod等人收集非妊娠期的雌性駱駝的（n=500）的卵巢，在繁殖和非繁殖季節(jié)期間檢查，粗略地測量卵巢卵泡的直徑并記錄卵巢異常。駱駝卵泡囊腫通常在單側(cè)或雙側(cè)有單個或多個囊腫，大多數(shù)是單一的。 囊腫是薄壁的，血管良好或略微不透明，并充滿稻草色卵泡液。 直徑范圍為17～40 mm。卵巢黃體囊腫則是厚壁的，變得部分或完全不透明，接近灰黃色。抽吸后卵泡液達到22 mL。黃體囊腫的大小可以達到50 mm的直徑。出血性囊腫是單層，厚壁，長在卵巢單側(cè)或雙側(cè)，并且在抽吸后含有血液卵泡液達到8 mL。直徑范圍為10～25 mm[33]。

卵巢卵泡、黃體和出血性囊腫是非排卵卵泡（功能性囊腫）的正常進化。 這些囊腫的存在表明排卵失敗可能是由于交配后LH釋放不足引起的[15]。LH釋放不足可能是由于下丘腦-垂體功能紊亂或減少交配刺激的作用。

5 體外成熟以及體外受精

與其他物種一樣，輔助生殖技術(shù)（ART）在駱駝科動物中也非常重要，ART可以更有效地利用優(yōu)越遺傳基因的雄性，幫助預(yù)防駱駝性病傳播，減少動物運輸?shù)男枰?。體外成熟（IVM）和體外受精（IVF）的目標是產(chǎn)生大量優(yōu)質(zhì)的胚胎和這些胚胎在轉(zhuǎn)移到受體動物后能夠成功活產(chǎn)。與其他一些大型家畜相比，關(guān)于駱駝科動物的IVM和IVF的報道很少。

與其他動物物種相比，駱駝科動物的體外胚胎生產(chǎn)效率不高，將卵巢儲存長達12 h而不會對體外卵母細胞成熟產(chǎn)生有害影響的能力對于長距離運輸有很大幫助，但是更多的研究需要集中在通過超聲波引導(dǎo)卵子采集（OPU），如?；蚱渌倚笪锓N來收集活體動物的卵母細胞。

駱駝的人工授精需要誘導(dǎo)排卵，因為駱駝是誘導(dǎo)排卵的。由于排卵發(fā)生在GnRH注射后的28～36 h，人工授精的最佳時間被認為是用GnRH處理后24 h，然而研究表明，在GnRH注射的同時也進行了人工授精懷孕結(jié)果為55%。初步研究表明，受孕需要多達300×106個活精子，但是最近的研究表明，子宮體內(nèi)150×106活精子或僅80×106位于含有優(yōu)勢卵泡的卵巢的子宮角尖端，兩者的妊娠率均為40%～50%[34]。稀釋的精液可以在4℃下儲存24 h，如果24 h后的運動性至少可以達到為35%～40%，則可以進行人工授精。 然而，使用新鮮精液可獲得55%的懷孕率，但使用冷卻的精液可將懷孕率降低至約25%[35]。

使用前列腺素合成酶抑制劑甲氯芬那酸也可以延長駱駝的黃體壽命。如果從排卵后第7 d開始口服甲氯芬那酸，直至胚胎移植后7 d，并在排卵后第8 d、10 d或12 d轉(zhuǎn)移胚胎，妊娠率分別達到80%，60%和70%的妊娠率，而未用甲氯芬那酸處理的第8 d的對照組的妊娠率為10%[36]。

種間胚胎移植也是一種可用于保護瀕危物種的方法。Niasari等人首次報道了舊世界駱駝科植物種間胚胎移植的第一份報告，首次單峰駱駝出生的雙峰駝犢的成果。Niasari等人使用FSH遞減劑量的方法處理一峰雙峰駝超數(shù)排卵6 d，然后在第7 d單次注射FSH。每天進行卵巢超聲檢查直至大多數(shù)生長的卵泡達到13～17 mm的大小并成熟，并相隔24 h，與具有生育能力的雄性雙峰駝交配兩次。 在第一次交配時，給予雌性駱駝20 μg乙基酰胺。在供體駱駝交配后一天，單峰駱駝受體靜脈注射25 mg豬促黃體生成素（LH）誘導(dǎo)排卵。在第一次交配后第8.5 d回收胚胎，并在LH注射后第7.5 d胚胎移植到受體中。胚胎移植后25 d診斷為妊娠。在分娩時出生的健康的雙峰駱駝并沒有任何特殊的并發(fā)癥（例如難產(chǎn)和新生兒疾?。37]。

6 結(jié) 語

目前，有關(guān)駱駝卵泡發(fā)育以及排卵的相關(guān)報道不多，需要更多的研究來了解雌性駱駝的卵巢、卵泡發(fā)生以及排卵的動力學有利于提高駱駝繁殖率。在駱駝的產(chǎn)犢間隔很長、繁殖季節(jié)比較短、性成熟晚等情況下，提高駱駝繁殖效率仍然是一項具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。 迫切需要通過使用激素處理和卵巢超聲波掃描來一致和準確地控制卵泡波生長周期和閉鎖。 還應(yīng)嘗試促進青春期的開始，縮短產(chǎn)后間隔至受孕并在繁殖季節(jié)之外誘導(dǎo)排卵。種間胚胎移植提供了一種至關(guān)重要的方法，可以保護瀕臨滅絕的駱駝科動物免受滅絕的威脅，也可以在不引入活體動物的情況下將新種駱駝科植物引入其他國家。