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      TGF-β1和β-catenin在兒童結(jié)腸息肉中的表達(dá)及意義

      2019-02-19 06:08:58王松陽
      關(guān)鍵詞:單發(fā)息肉結(jié)腸

      王松陽

      (漯河市第二人民醫(yī)院 外二科,河南 漯河 462000)

      兒童結(jié)腸息肉(colonic polyps)為兒童腸黏膜隆起贅生物,一般均為具有錯構(gòu)瘤特征的幼年性息肉,并會誘發(fā)兒童下消化道出血。目前,兒童結(jié)腸息肉通過結(jié)腸鏡的檢查,檢出率較高。該病的發(fā)病機(jī)制還不明確,文獻(xiàn)認(rèn)為該病的發(fā)生與遺傳因素有關(guān),并與多個信號通路異常表達(dá)有關(guān),為多基因參加和調(diào)控的過程[1]。

      研究表明,轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β, TGF-β1)與結(jié)腸癌、肝癌等多種腫瘤發(fā)生有關(guān),通過雙向調(diào)控影響腫瘤生物學(xué)行為[2]。而β-連環(huán)蛋白(β-catenin)作為Wnt/β-catenin通路的細(xì)胞因子,可以直接調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化。目前有關(guān)TGF-β1和β-catenin在兒童結(jié)腸息肉中的表達(dá)、進(jìn)展及機(jī)制報道較少,本研究主要分析兒童結(jié)腸息肉中TGF-β1和β-catenin蛋白的陽性表達(dá)及基因表達(dá)水平,并分析其分子機(jī)制,為兒童結(jié)腸息肉預(yù)防和治療提供依據(jù)。

      1 資料與方法

      1.1 研究對象

      選取2006年1月—2017年1月河南省漯河市第二人民醫(yī)院病理科存檔的兒童息肉石蠟標(biāo)本54例。其中,單發(fā)幼年性息肉29例。男性18例,女性11例;年齡4~13歲,平均(6.2±1.9)歲。多發(fā)幼年性息肉25例。男性16例,女性9例;年齡4~12歲,平均(6.1±1.7)歲。收集同期標(biāo)本旁組織25例,病理分析為正常組織。標(biāo)本采集均告知家屬并知情同意。

      1.2 主要試劑

      兔抗人TGF-β1多克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),兔抗β-catenin單克隆抗體(美國Santa Cruz公司),二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒,SP法免疫組織化學(xué)(以下簡稱免疫組化)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),F(xiàn)ast-King一步法逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]。

      1.3 免疫組化染色檢測TGF-β1和β-catenin的表達(dá)

      常規(guī)固定標(biāo)本、脫水并進(jìn)行石蠟包埋,連續(xù)切片(4μm),抗原修復(fù),采用SP法行免疫組化染色,二氨基聯(lián)苯胺顯色,鏡檢。磷酸鹽緩沖液替代一抗制作陰性對照切片。TGF-β1和β-catenin為胞漿、胞膜和/或細(xì)胞核染色,呈棕黃色顆粒狀或線狀,其中單一或混合染色即為陽性染色細(xì)胞。隨機(jī)選擇4個視野(×400)雙盲法讀片。TGF-β1的陽性診斷:胞漿和/或胞膜著色≥30%。β-catenin異常表達(dá):胞膜著色≥70%為正常,相反為胞膜表達(dá)缺失,胞漿和/或胞核著色>10%為異位表達(dá),胞膜表達(dá)缺失和異位表達(dá)均為異常表達(dá)。

      1.4 RT-PCR檢測TGF-β1和β-catenin mRNA的表達(dá)

      Trizol提取總RNA,按照Fast-King一步法RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行RT-PCR實驗。引物序列由上海英駿公司提供。TGF-β1(NM_000660.6)序列:正向5'-G GGCTACCATGCCAACTTCT-3',反向 5'-GACACAGAG ATCCGCAGTCC-3',擴(kuò)增產(chǎn)物長度384 bp;β-catenin(X87838.1)序列:正向5'-GGCCTAGGTGTCCAAAG GTG-3',反向 5'-AGAATGACCGCATAGTGCCC-3',產(chǎn)物長度201 bp;內(nèi)參GAPDH(NM_001289745.2)序列:正向5'-GAATTTGGCCACACTCAGTCC-3',反向5'-GT ACATGACAAGGTGCGGCT-3',長度 110 bp。

      1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

      數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,比較采用方差分析,兩兩比較用用LSD-t檢驗。計數(shù)資料以率(%)表示,比較用χ2檢驗,相關(guān)分析用Spearman法,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1 TGF-β1和β-catenin的表達(dá)情況

      TGF-β1蛋白在正常結(jié)腸組織的腺體腺上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞膜可見少量表達(dá),而幼年性息肉組織中表達(dá)主要位于胞膜、胞漿和/或細(xì)胞核中,呈棕黃色顆粒。β-catenin蛋白在正常結(jié)腸組織上皮細(xì)胞(包括腺體上皮細(xì)胞)膜可見少量的表達(dá),呈棕黃色。而幼年性息肉組織中可見膜表達(dá)、胞漿表達(dá)和部分核表達(dá)。見圖1。

      圖1 TGF-β1和β-catenin蛋白在兒童幼年性息肉組織中的表達(dá) (×400)

      TGF-β1在兒童多發(fā)幼年性息肉組織中的陽性表達(dá)率高于正常組織陽性表達(dá)率(P<0.05),而單發(fā)幼年性息肉組織中的陽性表達(dá)率與正常組織陽性表達(dá)率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。β-catenin蛋白在兒童多發(fā)幼年性息肉組織中的表達(dá)率高于正常組織表達(dá)率以及單發(fā)幼年性息肉組織中的表達(dá)率(均P<0.05),而單發(fā)幼年性息肉組織中的表達(dá)率與正常組織比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

      2.2 TGF-β1和β-catenin mRNA的表達(dá)情況

      多發(fā)幼年性息肉組織中TGF-β1和β-catenin mRNA相對表達(dá)水平高于單發(fā)以及正常組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而單發(fā)幼年性息肉組織中的TGF-β1和β-catenin mRNA相對表達(dá)水平與正常組織比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2和圖2。

      表1 TGF-β1和β-catenin在兒童幼年性息肉組織中的表達(dá)

      表2 TGF-β1和β-catenin mRNA的表達(dá) (±s)

      表2 TGF-β1和β-catenin mRNA的表達(dá) (±s)

      標(biāo)本 n TGF-β1 β-catenin正常組 25 0.35±0.06 0.21±0.03單發(fā)息肉 25 0.38±0.06 0.23±0.03多發(fā)息肉 29 0.43±0.05 0.27±0.04 F值 13.900 21.970 P值 0.000 0.000

      圖2 TGF-β1和β-catenin mRNA的表達(dá)

      2.3 TGF-β1和β-catenin相關(guān)性分析

      兒童多發(fā)幼年性息肉組織中T G F-β1和β-catenin的表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.463,P=0.000),見表3。

      表3 TGF-β1和β-catenin相關(guān)性分析 (n =14)

      3 討論

      幼年性息肉病常易誘發(fā)潰瘍、糜爛出血。部分還出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤,最初的研究顯示幼年性息肉無癌變的傾向,生物學(xué)效應(yīng)表現(xiàn)為良性[3]。但近年來部分研究顯示,幼年性息肉也具有轉(zhuǎn)化為腺瘤樣息肉惡變的風(fēng)險。BOSKOVIC等[4]報道1例兒童3個息肉中伴有低級別上皮內(nèi)瘤變(IEN),而國外ADOLPH等[5]認(rèn)為幼年性息肉可以和腺瘤共存,這也提示幼年性息肉部分可能發(fā)生癌變。

      TGF-β1為TGF-β/Smad4信號通路的多功能生長因子,能調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞分化,協(xié)調(diào)組織重塑和細(xì)胞外基質(zhì)的形成。并通過誘導(dǎo)細(xì)胞因子,促進(jìn)細(xì)胞的生長和分化,破壞細(xì)胞基質(zhì)的生長和降解平衡,促進(jìn)纖維化并參與息肉的形成。郝國榮等[6]研究發(fā)現(xiàn),子宮內(nèi)膜息肉中TGF-β1水平高于正常子宮內(nèi)膜息肉水平。LEONARDO等[7]研究發(fā)現(xiàn),17例鼻息肉病患者的息肉的TGF-β1水平高于11例正常對照的鼻黏膜中TGF-β1水平。有研究顯示TGF-β1與腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān),對腫瘤具有雙向調(diào)節(jié)作用,早期抑制腫瘤的生長,而晚期主要具有促進(jìn)作用[8]。而且有報道TGF-β1與乳腺癌的進(jìn)展、浸潤和預(yù)后相關(guān)[9]。本研究顯示,TGF-β1在多發(fā)幼年性息肉中的陽性表達(dá)率以及TGF-β1mRNA相對表達(dá)水平均高于正常組,提示TGF-β1蛋白水平的改變與息肉的發(fā)生有關(guān),并可能促進(jìn)腺瘤、腺癌的發(fā)生,對此患兒可以詢問家族史,并采用基因檢測或腸鏡檢查。而單發(fā)幼年性息肉組織中的陽性表達(dá)率以及TGF-β1mRNA相對表達(dá)水平與正常組織陽性表達(dá)率比較無差異,提示單發(fā)幼年性息肉發(fā)生癌變的風(fēng)險較低。而且TGF-β1蛋白以及基因水平在單發(fā)以及多發(fā)幼年性息肉組織中較正常組依次增加,這也證明了上述的觀點。

      β-catenin對癌基因、抑癌基因具有一定的調(diào)節(jié)作用,高水平的的β-catenin容易產(chǎn)生降解障礙,并出現(xiàn)過度積聚,通過對下游基因的激活,調(diào)控細(xì)胞增殖和分化,嚴(yán)重時擾亂增殖和凋亡平衡,并最終形成腸息肉[10]。金美芳等[11]發(fā)現(xiàn),兒童幼年性息肉中,β-catenin蛋白表達(dá)和分布改變明顯。目前針對腫瘤中β-catenin水平的變化研究報道較多,但針對兒童幼年性息肉中的β-catenin水平的變化研究報道較少。本研究中,多發(fā)幼年性息肉組織中的β-catenin陽性表達(dá)率以及β-catenin mRNA的相對表達(dá)水平高于正常組織和單發(fā)幼年性息肉組織中的表達(dá)水平,而單發(fā)幼年性息肉組織中的β-catenin陽性表達(dá)水平以及β-catenin mRNA的相對表達(dá)水平與正常組織異常表達(dá)率比較無差異,提示單發(fā)幼年性息肉惡變傾向較低,但不排除多發(fā)幼年性息肉癌變的風(fēng)險,尤其針對有家族史的患兒需要定時的檢查和檢測,減少癌變的風(fēng)險。

      研究表明,TGF-β/Smad4、Wnt/β-catenin信號通路與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān),并彼此影響調(diào)控細(xì)胞分化[12]。已有研究證實,TGF-β1和β-catenin共同參與、調(diào)節(jié)原發(fā)性肝癌的發(fā)生和進(jìn)展,表明TGF-β/Smad4信號通路中TGF-β1在參與經(jīng)典通路外,還可調(diào)節(jié)Wnt通路,并通過某些途徑共同調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[13]。WINCEWICZ等[14]研究發(fā)現(xiàn),TGF-β1與β-catenin間的聯(lián)系有差異。本研究結(jié)果表明,幼年性息肉的發(fā)生與TGF-β1和β-catenin異常表達(dá)有關(guān),并具有正相關(guān)性,提示TGF-β1基因可能通過β-catenin途徑促進(jìn)息肉的形成,尤其多發(fā)幼年性息肉中更加明顯,級聯(lián)激活TGF-β/Smad4信號通路,調(diào)控息肉組織細(xì)胞的增殖、分化和侵襲。

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