TGF-β1和β-catenin在兒童結(jié)腸息肉中的表達(dá)及意義

王松陽

（漯河市第二人民醫(yī)院 外二科，河南 漯河 462000）

兒童結(jié)腸息肉（colonic polyps）為兒童腸黏膜隆起贅生物，一般均為具有錯構(gòu)瘤特征的幼年性息肉，并會誘發(fā)兒童下消化道出血。目前，兒童結(jié)腸息肉通過結(jié)腸鏡的檢查，檢出率較高。該病的發(fā)病機(jī)制還不明確，文獻(xiàn)認(rèn)為該病的發(fā)生與遺傳因素有關(guān)，并與多個信號通路異常表達(dá)有關(guān)，為多基因參加和調(diào)控的過程[1]。

研究表明，轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β, TGF-β1）與結(jié)腸癌、肝癌等多種腫瘤發(fā)生有關(guān)，通過雙向調(diào)控影響腫瘤生物學(xué)行為[2]。而β-連環(huán)蛋白(β-catenin)作為Wnt/β-catenin通路的細(xì)胞因子，可以直接調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化。目前有關(guān)TGF-β1和β-catenin在兒童結(jié)腸息肉中的表達(dá)、進(jìn)展及機(jī)制報道較少，本研究主要分析兒童結(jié)腸息肉中TGF-β1和β-catenin蛋白的陽性表達(dá)及基因表達(dá)水平，并分析其分子機(jī)制，為兒童結(jié)腸息肉預(yù)防和治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2006年1月—2017年1月河南省漯河市第二人民醫(yī)院病理科存檔的兒童息肉石蠟標(biāo)本54例。其中，單發(fā)幼年性息肉29例。男性18例，女性11例；年齡4～13歲，平均（6.2±1.9）歲。多發(fā)幼年性息肉25例。男性16例，女性9例；年齡4～12歲，平均（6.1±1.7）歲。收集同期標(biāo)本旁組織25例，病理分析為正常組織。標(biāo)本采集均告知家屬并知情同意。

1.2 主要試劑

兔抗人TGF-β1多克隆抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），兔抗β-catenin單克隆抗體（美國Santa Cruz公司），二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒，SP法免疫組織化學(xué)（以下簡稱免疫組化）試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），F(xiàn)ast-King一步法逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]。

1.3 免疫組化染色檢測TGF-β1和β-catenin的表達(dá)

常規(guī)固定標(biāo)本、脫水并進(jìn)行石蠟包埋，連續(xù)切片（4μm），抗原修復(fù)，采用SP法行免疫組化染色，二氨基聯(lián)苯胺顯色，鏡檢。磷酸鹽緩沖液替代一抗制作陰性對照切片。TGF-β1和β-catenin為胞漿、胞膜和/或細(xì)胞核染色，呈棕黃色顆粒狀或線狀，其中單一或混合染色即為陽性染色細(xì)胞。隨機(jī)選擇4個視野（×400）雙盲法讀片。TGF-β1的陽性診斷：胞漿和/或胞膜著色≥30%。β-catenin異常表達(dá)：胞膜著色≥70%為正常，相反為胞膜表達(dá)缺失，胞漿和/或胞核著色＞10%為異位表達(dá)，胞膜表達(dá)缺失和異位表達(dá)均為異常表達(dá)。

1.4 RT-PCR檢測TGF-β1和β-catenin mRNA的表達(dá)

Trizol提取總RNA，按照Fast-King一步法RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行RT-PCR實驗。引物序列由上海英駿公司提供。TGF-β1（NM_000660.6）序列：正向5'-G GGCTACCATGCCAACTTCT-3'，反向 5'-GACACAGAG ATCCGCAGTCC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長度384 bp；β-catenin（X87838.1）序列：正向5'-GGCCTAGGTGTCCAAAG GTG-3'，反向 5'-AGAATGACCGCATAGTGCCC-3'，產(chǎn)物長度201 bp；內(nèi)參GAPDH（NM_001289745.2）序列：正向5'-GAATTTGGCCACACTCAGTCC-3'，反向5'-GT ACATGACAAGGTGCGGCT-3'，長度 110 bp。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用方差分析，兩兩比較用用LSD-t檢驗。計數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗，相關(guān)分析用Spearman法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1和β-catenin的表達(dá)情況

TGF-β1蛋白在正常結(jié)腸組織的腺體腺上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞膜可見少量表達(dá)，而幼年性息肉組織中表達(dá)主要位于胞膜、胞漿和/或細(xì)胞核中，呈棕黃色顆粒。β-catenin蛋白在正常結(jié)腸組織上皮細(xì)胞（包括腺體上皮細(xì)胞）膜可見少量的表達(dá)，呈棕黃色。而幼年性息肉組織中可見膜表達(dá)、胞漿表達(dá)和部分核表達(dá)。見圖1。

圖1 TGF-β1和β-catenin蛋白在兒童幼年性息肉組織中的表達(dá) （×400）

TGF-β1在兒童多發(fā)幼年性息肉組織中的陽性表達(dá)率高于正常組織陽性表達(dá)率（P＜0.05），而單發(fā)幼年性息肉組織中的陽性表達(dá)率與正常組織陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。β-catenin蛋白在兒童多發(fā)幼年性息肉組織中的表達(dá)率高于正常組織表達(dá)率以及單發(fā)幼年性息肉組織中的表達(dá)率（均P＜0.05），而單發(fā)幼年性息肉組織中的表達(dá)率與正常組織比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 TGF-β1和β-catenin mRNA的表達(dá)情況

多發(fā)幼年性息肉組織中TGF-β1和β-catenin mRNA相對表達(dá)水平高于單發(fā)以及正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而單發(fā)幼年性息肉組織中的TGF-β1和β-catenin mRNA相對表達(dá)水平與正常組織比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2和圖2。

表1 TGF-β1和β-catenin在兒童幼年性息肉組織中的表達(dá)

表2 TGF-β1和β-catenin mRNA的表達(dá) （±s）

表2 TGF-β1和β-catenin mRNA的表達(dá) （±s）

標(biāo)本 n TGF-β1 β-catenin正常組 25 0.35±0.06 0.21±0.03單發(fā)息肉 25 0.38±0.06 0.23±0.03多發(fā)息肉 29 0.43±0.05 0.27±0.04 F值 13.900 21.970 P值 0.000 0.000

圖2 TGF-β1和β-catenin mRNA的表達(dá)

2.3 TGF-β1和β-catenin相關(guān)性分析

兒童多發(fā)幼年性息肉組織中T G F-β1和β-catenin的表達(dá)呈正相關(guān)（rs=0.463，P=0.000），見表3。

表3 TGF-β1和β-catenin相關(guān)性分析 （n =14）

3 討論

幼年性息肉病常易誘發(fā)潰瘍、糜爛出血。部分還出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤，最初的研究顯示幼年性息肉無癌變的傾向，生物學(xué)效應(yīng)表現(xiàn)為良性[3]。但近年來部分研究顯示，幼年性息肉也具有轉(zhuǎn)化為腺瘤樣息肉惡變的風(fēng)險。BOSKOVIC等[4]報道1例兒童3個息肉中伴有低級別上皮內(nèi)瘤變（IEN），而國外ADOLPH等[5]認(rèn)為幼年性息肉可以和腺瘤共存，這也提示幼年性息肉部分可能發(fā)生癌變。

TGF-β1為TGF-β/Smad4信號通路的多功能生長因子，能調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞分化，協(xié)調(diào)組織重塑和細(xì)胞外基質(zhì)的形成。并通過誘導(dǎo)細(xì)胞因子，促進(jìn)細(xì)胞的生長和分化，破壞細(xì)胞基質(zhì)的生長和降解平衡，促進(jìn)纖維化并參與息肉的形成。郝國榮等[6]研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜息肉中TGF-β1水平高于正常子宮內(nèi)膜息肉水平。LEONARDO等[7]研究發(fā)現(xiàn)，17例鼻息肉病患者的息肉的TGF-β1水平高于11例正常對照的鼻黏膜中TGF-β1水平。有研究顯示TGF-β1與腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，對腫瘤具有雙向調(diào)節(jié)作用，早期抑制腫瘤的生長，而晚期主要具有促進(jìn)作用[8]。而且有報道TGF-β1與乳腺癌的進(jìn)展、浸潤和預(yù)后相關(guān)[9]。本研究顯示，TGF-β1在多發(fā)幼年性息肉中的陽性表達(dá)率以及TGF-β1mRNA相對表達(dá)水平均高于正常組，提示TGF-β1蛋白水平的改變與息肉的發(fā)生有關(guān)，并可能促進(jìn)腺瘤、腺癌的發(fā)生，對此患兒可以詢問家族史，并采用基因檢測或腸鏡檢查。而單發(fā)幼年性息肉組織中的陽性表達(dá)率以及TGF-β1mRNA相對表達(dá)水平與正常組織陽性表達(dá)率比較無差異，提示單發(fā)幼年性息肉發(fā)生癌變的風(fēng)險較低。而且TGF-β1蛋白以及基因水平在單發(fā)以及多發(fā)幼年性息肉組織中較正常組依次增加，這也證明了上述的觀點。

β-catenin對癌基因、抑癌基因具有一定的調(diào)節(jié)作用，高水平的的β-catenin容易產(chǎn)生降解障礙，并出現(xiàn)過度積聚，通過對下游基因的激活，調(diào)控細(xì)胞增殖和分化，嚴(yán)重時擾亂增殖和凋亡平衡，并最終形成腸息肉[10]。金美芳等[11]發(fā)現(xiàn)，兒童幼年性息肉中，β-catenin蛋白表達(dá)和分布改變明顯。目前針對腫瘤中β-catenin水平的變化研究報道較多，但針對兒童幼年性息肉中的β-catenin水平的變化研究報道較少。本研究中，多發(fā)幼年性息肉組織中的β-catenin陽性表達(dá)率以及β-catenin mRNA的相對表達(dá)水平高于正常組織和單發(fā)幼年性息肉組織中的表達(dá)水平，而單發(fā)幼年性息肉組織中的β-catenin陽性表達(dá)水平以及β-catenin mRNA的相對表達(dá)水平與正常組織異常表達(dá)率比較無差異，提示單發(fā)幼年性息肉惡變傾向較低，但不排除多發(fā)幼年性息肉癌變的風(fēng)險，尤其針對有家族史的患兒需要定時的檢查和檢測，減少癌變的風(fēng)險。

研究表明，TGF-β/Smad4、Wnt/β-catenin信號通路與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)，并彼此影響調(diào)控細(xì)胞分化[12]。已有研究證實，TGF-β1和β-catenin共同參與、調(diào)節(jié)原發(fā)性肝癌的發(fā)生和進(jìn)展，表明TGF-β/Smad4信號通路中TGF-β1在參與經(jīng)典通路外，還可調(diào)節(jié)Wnt通路，并通過某些途徑共同調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[13]。WINCEWICZ等[14]研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1與β-catenin間的聯(lián)系有差異。本研究結(jié)果表明，幼年性息肉的發(fā)生與TGF-β1和β-catenin異常表達(dá)有關(guān)，并具有正相關(guān)性，提示TGF-β1基因可能通過β-catenin途徑促進(jìn)息肉的形成，尤其多發(fā)幼年性息肉中更加明顯，級聯(lián)激活TGF-β/Smad4信號通路，調(diào)控息肉組織細(xì)胞的增殖、分化和侵襲。