豬源大腸桿菌耐藥性及超廣譜β-內酰胺酶流行性分析

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大腸桿菌(Escherichiacoli)屬于革蘭氏陰性菌，廣泛存在于自然界，為人和動物腸道中的常居菌，在一定條件下可引起仔豬黃、白痢和仔豬水腫病，在獸醫(yī)臨床上屬于多發(fā)常見病，發(fā)病率和死亡率普遍較高。β-內酰胺類藥物是獸醫(yī)臨床重要的抗感染藥物，廣泛用于動物疾病的治療。隨著近十多年來，β-內酰胺類藥物在獸醫(yī)臨床上長期不合理的使用，導致耐藥菌株的產生并且廣泛擴散流行，抗菌效果降低甚至喪失，導致大批量動物死亡，給豬場養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經濟損失。超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)是介導大腸桿菌對第三代頭孢菌素耐藥的重要機制。ESBLs耐藥基因由質粒攜帶可通水平傳播，在全球范圍內迅速擴散，造成耐藥。同時動物源產 ESBLs 大腸桿菌可經食物鏈直接或間接傳播給人，給人類的健康造成嚴重威脅。

目前，福建地區(qū)豬源大腸桿菌ESBLs流行病學的研究資料相對較少。因此，本實驗對該地區(qū)分離的豬源大腸桿菌ESBLs流行性進行調查以及種系發(fā)育進行分析，旨在闡明該地區(qū)分離株的ESBLs流行分布特征和種系發(fā)育進行情況，以期對該病原菌耐藥性風險評估及獸醫(yī)臨床合理使用藥提供一定的科學依據。

1 材料和方法

1.1細菌分離與鑒定 2014-2016年采用肛門拭子采集規(guī)?；i場糞便樣品，將采集的糞便樣品在潔凈工作臺中接種于3 mL滅菌的LB肉湯中，37 ℃震蕩培養(yǎng)箱增菌12～24 h，再用接種環(huán)接取少量菌液均勻劃線于麥康凱瓊脂上， 37 ℃培養(yǎng)箱12～24 h，挑取麥康凱瓊脂上紅色不透明中等大小可疑單菌落進行純化并鑒定。所有分離株經革蘭氏染色后鏡檢、生化鑒定和16S rRNA[1](F：AGAGTTTGATCTGGCTCAG，R:GGTTACCTTGTTACG-ACTT)分析檢測。分離株保存在終濃度為30.0%甘油肉湯中，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。大腸桿菌ATCC 25922作為藥敏質控菌，由本實驗室保存。

1.2藥物與試劑 麥康凱瓊脂(MacConkey Agar)，LB肉湯(LB Broth)，LB瓊脂(LB Agar)，水解酪蛋白瓊脂(MH Agar)，水解酪蛋白肉湯(MH Broth)，均購自廣州環(huán)凱微生物科技有限公司；氨芐西林、頭孢噻呋、慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、氟苯尼考、萘啶酸、恩諾沙星、環(huán)丙沙星和甲氧芐啶/磺胺甲噁唑，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；頭孢噻肟購自中國藥品生物制品檢定所；rTaqDNA聚合酶購自寶生物工程(大連)有限公司；引物合成和PCR產物序列測定由華大生物科技(上海)有限公司完成。

1.3藥物敏感性測定 大腸桿菌藥物敏感性的測定方法參考美國臨床實驗室標準化委員會(M100-S25)推薦方法執(zhí)行，采用瓊脂二倍稀釋法測定分離菌株的最低抑菌濃度(MIC)，以完全抑制細菌生長的最低濃度為最低抑菌濃度。其中頭孢噻呋[2]和氟苯尼考[3]的耐藥折點參考文獻報道，恩諾沙星的耐藥折點參考(CLSI，M3-A3)雞大腸桿菌的耐藥折點，并根據MIC的測定值，計算每種藥物的MIC50和MIC90。大腸桿菌ATCC 25922作為藥敏質控菌株。

1.4基因組DNA提取 用水煮法提取DNA模板，將鑒定純化的大腸桿菌劃線接種于麥康凱瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)12～24 h后，挑取單個菌落接種于4 mL LB肉湯中，37 ℃振蕩培養(yǎng)12～24 h，將菌液分裝到2 mL 的EP管中12 000 r/min離心2 min，棄上清，加入250～300 μL 滅菌超純水，置于沸水浴10 min，冰浴5 min后，12 000 r/min離心5 min，取上清液至另一滅菌EP管，儲于4 ℃冰箱保存。

1.5ESBLs基因的檢測及CTX-M亞型分析 試驗檢測了ESBLs耐藥基因，包括TEM、SHV、OXA和CTX-M基因，其中CTX-M 型包括CTX-M-1G和CTX-M-9G，引物序列參考相關文獻報道，見表1。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的基因的PCR產物經序列測定后提交NCBI平臺通過BLAST進行分析確認。

1.6種系發(fā)育關系分析 根據Clermont等文獻報道的方法判斷大腸桿菌種族系統(tǒng)進化關系[4]。采用多重PCR及交叉式檢索表的方法，以chuA基因、yjaA基因及一個未知 DNA片段 TspE4.C2的存在或缺少為依據來判定菌株所在的種族。

表1 基因引物序列及片段長度
Tab.1 Primer sequences of genes and gene length

基因類別基因名稱 引物序列(5'-3')片段長度(bp)超廣譜β-內酰胺酶TEM5'-ATAAAATTCTTGAAGACGAAA-3'1080[5]5'-GACAGTTACCAATGCTTAATC-3'SHV5'-CACTCAAGGATGTATTGTG-3'885[6]5'-TTAGCGTTGCCAGTGCTCG-3'OXA5'-TGAAGGGTTGGGCGATTT-3'925[7]5'-ACCCGGAGCCTCATTAATTGT-3'CTX-M-1G5'-CTTCCAGAATAAGGAATCCC-3'949[8]5'-CGTCTAAGGCGATAAACAAA-3'CTX-M-9G5'-GTGACAAAGAGAGTGCAACGG-3'857[6]5'-ATGATTCTCGCCGCTGAAGCC-3'種系發(fā)育chuA5'-GACGAACCAACGGTCAGGAT-3'279[4]5'-TGCCGCCAGTACCAAAGACA-3'yjaA5'-TGAAGTGTCAGGAGACGCTG-3'211[4]5'-ATGGAGAATGCGTTCCTCAAC-3'TspE4C25'-GAGTAATGTCGGGGCATTCA-3'152[4]5'-CGCGCCAACAAAGTATTACG-3'

注：F，上游引物；R，下游引物

2 結 果

2.1細菌分離情況 2014-2016年期間，從福建地區(qū)規(guī)?；i場糞便中共分離大腸桿菌373株。大腸桿菌在麥康凱培養(yǎng)基上菌落呈圓形凸起，邊緣整齊，粉色至深紅色；在伊紅美藍培養(yǎng)基上，菌落中心呈黑色，有金屬光澤。分離株經革蘭氏染色及油鏡觀察，呈紅色短桿菌；生化鑒定結果符合大腸桿菌的相關特征；16S rRNA檢測，可獲得1 500 bp的目的條帶，經測序并分析，確認分離株為大腸桿菌。

表2 大腸桿菌對抗菌藥物的最低抑菌濃度
Tab.2 Distribution of minimum inhibitory concentration values for antimicrobials inEscherichiacoliisolates

藥物名稱MIC各濃度菌株分布 (μg/mL)≤0.030.060.1250.250.51248163264128≥256氨芐西林00131561221193562736858頭孢噻呋1032152622425537312222311018頭孢噻肟8261332497654261526718815慶大霉素0011214313836474356412529卡那霉素00667132425465043595836表2(續(xù))藥物名稱MIC各濃度菌株分布 (μg/mL)≤0.030.060.1250.250.51248163264128≥256四環(huán)素0051024203542394454373924多西環(huán)素01153015253934404349361828氟苯尼考000216141121344539686657萘啶酸000000417142950939373 恩諾沙星212153156543531252434271215環(huán)丙沙星315222735535444381326181411甲氧芐啶/磺胺甲噁唑0000291218192843699578

表3 大腸桿菌對抗菌藥物的MIC50、MIC90和耐藥率
Tab.3 MIC50, MIC90and resistance rates for antimicrobials inEscherichiacoli

藥物名稱MIC50(μg/mL)MIC90(μg/mL)耐藥折點(μg/mL)敏感 (S)耐藥 (R)耐藥率氨芐西林64256≤8≥3270.0%頭孢噻呋264≤2≥835.9%頭孢噻肟164≤1≥430.8%慶大霉素16128≤4≥1652.0%卡那霉素32128≤16≥6441.0%四環(huán)素16128≤4≥1653.1%多西環(huán)素8128≤4≥1646.6%氟苯尼考64256/≥1673.7%萘啶酸64256≤16≥3282.8%恩諾沙星264≤0.5≥254.4%環(huán)丙沙星264≤1≥444.0%甲氧芐啶/磺胺甲噁唑64256≤2≥493.8%

注：“ / ” 表示無耐藥折點可參考。

2.3ESBLs基因的流行情況 采用PCR方法檢測了ESBLs耐藥基因，在373株大腸桿菌中，共有122株菌攜帶有ESBLs耐藥基因，檢出率為32.7%，其中CTX-M、TEM及OXA的檢出率分別是18.0%(67)、12.1%(45)和7.5%(28)，SHV基因未檢出，并且CTX-M以CTX-M-9G的檢出率最高14.7%(55/373)，CTX-M-1G的檢出率為3.2%(12/373)。CTX-M-9G亞型分析表明CTX-M-14最為流行(61.9%，38/55)，其次是CTX-M-65(21.8%，12/55)和CTX-M-48(9.1%，5/55)，其種系發(fā)育顯示分離株主要分布在A群，其次是D群。CTX-M-1G主要以CTX-M-55亞型最為流行(83.3%，10/12)，主要以A群為主。部分CTX-M陽性株還攜帶有其他的ESBLs基因，其中有10株菌同時攜帶CTX和TEM基因，另有8株菌同時攜帶CTX和OXA基因，試驗結果見表4。

表4 大腸桿菌耐藥基因CTX-M亞型及種系發(fā)育分布
Tab.4 Distribution of the subtype and phylogeny of theEscherichiacolicarried CTX-M genes

3 討 論

本研究調查了福建地區(qū)豬源大腸桿菌對臨床常用的12種抗菌藥耐藥情況，結果表明該地區(qū)豬源大腸桿菌耐藥性較為嚴重，主要體現在耐藥率及耐藥水平均較高。對甲氧芐啶/磺胺甲噁唑、萘啶酸、氟苯尼考及氨芐西林的耐藥率在70%～93.8%之間，并且MIC值大于等于64 μg/mL菌株數均超過50%，在51.2%～69.4%。β-內酰胺類藥物作為獸醫(yī)臨床重藥的抗感染藥物，尤其是第三代頭孢菌素，在本試驗中分離株對頭孢噻肟(30.8%)和頭孢噻呋(35.9%)表現出較強的耐藥性，與廣東(34.5%，37.9%)和四川(40.4%，頭孢噻呋)的報道相接近，但是明顯低于貴州(93.29%，頭孢噻呋)的耐藥率，另一常用藥氨芐西林的耐藥率為70%，與廣東，四川、貴州等地相似(79.3%～91.25%)[9-11]，均處于在較高的耐藥水平。β-內酰胺類藥物耐藥性快速增長，可能跟該類藥物的大量使用有關。氟苯尼考作為廣譜抗菌藥同樣被大量使用，本實驗中氟苯尼考的耐藥率高達73.7%，該結果與四川73.97%相似[9]，但貴州地區(qū)的實驗結果顯示氟苯尼考的耐藥率僅為21.95%[10]，表現出相對較好的敏感性。

目前，ESBLs以TEM、SHV、CTX-M和OXA型較為常見，其中以CTX-M型最為流行[12-14]。到目前為止CTX-M型已有100多種，并可分為 5個亞群：CTX-M-1G、CTX-M-2G、CTX-M-8G、CTX-M-9G 和CTX-M-25G[15]，并且在CTX-M陽性大腸桿菌中CTX-M-9G基因檢出率最高[13, 16]。本研究在福建多個地區(qū)采集的373株大腸桿菌中，32.7%的菌株攜帶有ESBLs基因，高于2015年福建閩西的地區(qū)28.6%的檢出率[17]，其中CTX-M的檢出率最高為18.0%，同樣以CTX-M-9G最為流行(55/67)，但是也有不同的情況，王基偉[18]及佐明開[19]對吉林和江西的研究結果表明，最為流行是TEM型，而非CTX-M型。

本研究顯示CTX-M中最為流行亞型是CTX-M-14、其次CTX-M-65和CTX-M-55，然而2015年福建閩西地區(qū)調查結果顯示，最為流行的亞型是CTX-M-15[17]，與本試驗結果明顯不同，CTX-M-14屬于CTX-M-9G，而CTX-M-15屬于CTX-M-1G，并且CTX-M-15在本研究中未檢出，說明在該地區(qū)流行的亞型很可能已經發(fā)生改變。2011年，鄭紅青等研究廣東地區(qū)豬源產ESBLs大腸桿菌，結果表明CTX-M-14最為流行，其次是CTX-M-55和CTX-M-65[16]。然而2016年，靳嬋調查廣東地區(qū)屠宰前豬源大腸桿菌CTX-M流行情況時，發(fā)現不僅CTX-M的檢出率相對較低，其流行的亞型也不一樣，檢出率最高的為CTX-M-55，其次為CTX-M-14和CTX-M-65[20]，以上研究結果表明檢出率和流行的亞型存在一定的差異，可能是與樣品來源不同、地域差異及管理水平等因素有關。值得注意的是同一個養(yǎng)殖場，不同的樣品來源，CTX-M的流行亞型也不同[21]。

種系發(fā)育是大腸桿菌分子流行病學的重要特征，根據TSPE4.C2、yjaA及chuA這三個基因的不同組合，可將大腸桿菌分為 A、B1、B2 和 D 這 4 個種系發(fā)育型。共生型大腸桿菌主要分布在A組，毒力因子較多的常常位于B2組和D組[22-24]。健康豬源大腸桿菌主要分布在A群和B1群，腹瀉仔豬大腸桿菌分布在B2和D群的比例顯著高于健康豬源[18]。有資料表明，動物源CTX-M-14和CTX-M-55基因陽性的大腸桿菌，其種系發(fā)育均以A組為主[13, 25]。本實驗中，CTX-M-14、CTX-M-65和CTX-M-55，大多數屬于A組，占CTX-M陽性菌的70.1%，與他人的研究結果一致，說明CTX-M陽性菌多數以共生型大腸桿菌為主。

利益沖突：無