結核分枝桿菌環(huán)絲氨酸藥物敏感性及耐藥機制研究

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耐藥結核病是造成結核病疫情居高不下的主要因素之一，MDR-TB(耐多藥結核病)及XDR-TB(廣泛耐藥結核病)的治療是控制耐藥結核病的關鍵。環(huán)絲氨酸(Cycloserine,Cs)，1982年就被美國FDA批準上市，其抗結核分枝桿菌的作用弱于異煙肼及鏈霉素，世界衛(wèi)生組織最新的耐藥結核病治療指南[1]將環(huán)絲氨酸列入治療MDR-TB的核心藥物之一。根據國內外已有的報道提示結核分枝桿菌對環(huán)絲氨酸的耐藥率較低[2-5]，然而近年來，隨著指南的出臺及耐藥結核病疫情的控制壓力，國內外使用環(huán)絲氨酸的病例在逐步增多，卻仍然缺乏可靠的環(huán)絲氨酸的藥敏實驗方法，也缺乏目前流行的結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)對該藥的耐藥情況的了解。因此，本研究通過一定數量的MTB臨床分離株的藥敏試驗，了解MDR-TB及XDR-TB臨床分離株對環(huán)絲氨酸的耐藥情況，為未來有效的優(yōu)化抗結核方案提供可靠的依據。目前國際上對環(huán)絲氨酸采取的藥敏方法大都是以羅氏固體培養(yǎng)基為基礎的絕對濃度法和比例法[2-5]，該培養(yǎng)基的制作需要加熱[6]，藥物存在著一定程度的損失，因此，本研究選取Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基，在96孔板中建立液體藥敏實驗方法，根據對140株耐藥MTB臨床分離株及37株全敏MTB臨床分離株的MIC結果，尋找判定MTB對環(huán)絲氨酸耐藥的臨界值。

在環(huán)絲氨酸耐藥機制的研究中，環(huán)絲氨酸可能起作用的靶標基因點為Ald、Alr、ddlA，由于目前研究耐藥機制的方法都是將基因克隆、轉化到大腸桿菌中進行研究[7-8]，并非針對來自臨床的環(huán)絲氨酸耐藥的分離菌株進行研究，因此，本研究通過上述的液體藥敏法從臨床病人的痰標本MTB分離株中篩選出環(huán)絲氨酸耐藥的菌株，并隨機抽取對環(huán)絲氨酸敏感的菌株，與H37Rv標準株一起，提取DNA和RNA，針對Ald、Alr、ddlA基因點設計引物，分別進行PCR基因擴增及Real-time PCR擴增，分析對環(huán)絲氨酸耐藥株有無明確的基因突變或有無基因表達量的變化，為建立環(huán)絲氨酸耐藥的快速分子檢測方法提供理論依據。

1 材 料

1.1菌株來源 結核分枝桿菌標準株(H37Rv ATCC27294)購自國家菌種保藏中心，177株MTB臨床分離株來自上海市肺科醫(yī)院結核科收治的患者，其中100株MDR-TB、40株XDR-TB及37株全敏MTB臨床分離株。肺結核病的診斷遵循中華醫(yī)學會結核病分會制定的《肺結核診斷和治療指南標準》。對臨床標本判斷是否耐藥的實驗室藥敏方法為BACTEC MGIT 960法，MDR-TB指體外藥敏實驗證實至少同時對異煙肼和利福平耐藥的MTB, XDR-TB指體外藥敏實驗證實至少同時對異煙肼和利福平耐藥外，還對任何氟喹諾酮類藥物耐藥，以及3種二線注射類藥物(卷曲霉素、卡那霉素和阿米卡星)中的至少1種耐藥的結核病。全敏MTB是指使用BACTEC MGIT 960法檢測對所有檢測的藥物(異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇、氧氟沙星、卷曲霉素、阿米卡星)均敏感[9]。

1.2主要試劑與儀器 環(huán)絲氨酸藥物、吐溫-80購自美國 Sigma公司；藥敏培養(yǎng)基所用的藥物Middlebrook 7H9 Broth、Middlebrook OADC Enrichment均購自美國Becton, Dickinson and Company；結核分枝桿菌的分離培養(yǎng)中所用的營養(yǎng)增菌液參考《結核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》[6]于實驗室中自制；注射用青霉素鈉購自華北制藥股份有限公司；GNP一92700 隔水式培養(yǎng)箱購自上海精宏實驗設備有限公司。

2 方 法

2.1試劑配置 液體培養(yǎng)基的配置：向270 mL Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基中加30 mL Middlebrook OADC Enrichment、750 μL 5%的吐溫-80、加入青霉素使其終濃度為100單位/mL。藥物配置：環(huán)絲氨酸用上述液體培養(yǎng)基配制，然后用0.22 μm無菌濾器(美國Millpore 公司)過濾除菌 ，分裝保存于-70 ℃，實驗前將含環(huán)絲氨酸的液體培養(yǎng)基加入96孔U型培養(yǎng)板中，每孔100 μL，將配好的藥敏板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱過夜，若沒有污染，則可進行下一步實驗。

2.2MIC檢測 按《結核病診斷細菌學檢驗規(guī)程》規(guī)定要求進行分離培養(yǎng)、分枝桿菌菌種初步鑒定。將待檢結核分枝桿菌臨床分離株轉接到5 mL的Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩周后，加人玻璃珠在渦旋振蕩器上磨菌5～10 min后靜置10～15 min，取上層均勻的懸濁液用Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基比濁至1 mg/mL待用。在含藥96孔U型板中，每孔加入稀釋后的100 μL含有菌液的液體培養(yǎng)基，使菌液終濃度為10-2mg/mL，加入菌液后藥物的終濃度為128，64，32，16，8，4，2，1 μg/mL，同時設置100%菌量生長對照孔、10%菌量生長對照孔、1%菌量生長對照孔和陰性對照孔，貼上封板膜 ，37 ℃恒溫培養(yǎng)，每天觀察 1 次結果，2周后記錄每株菌的MIC結果。

2.3結果讀取 用放大鏡觀察并記錄結果，孔底出現(xiàn)肉眼可見白色菌體沉淀的為陽性，無肉眼可見菌體沉淀的為陰性，每個藥物出現(xiàn)陰性的最低藥物濃度為 MIC值。

2.4質量控制 每次實驗均以H37Rv為質量控制，同一菌株的 MIC 值重復檢測 3 次。

2.5PCR基因擴增及測序 根據MIC結果，篩選出3株對環(huán)絲氨酸耐藥MTB菌株和53株對環(huán)絲氨酸敏感的MTB菌株，與H37Rv標準株進行培養(yǎng)兩周后抽提基因組DNA。運用PrimeSTAR PCR反應試劑(購自Takara公司)，配制50.0 μL反應體系：10.0 μL 5×PS Buffer，4.0 μL dNTP Mix，0.5 μL Prime STAR，正向、反向引物(10 μmol/L，引物序列見表1)各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，補加ddH2O至50.0 μL，于PCR儀器上運行程序：95 ℃ 10 s，65 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s×35；72 ℃ 7 min×1；4 ℃ ∞。制作1%的瓊脂糖凝膠，擴增結束后，進行電泳檢測，擴增成功的送華大基因公司進行基因測序。運用BioEdit、DNAMAN和Chromas軟件對測序成功的序列進行比對分析。

表1 PCR擴增引物序列
Tab.1 Primer sequence of PCR amplification

基因名稱引物名稱引物序列(5'→3')片段大小Ald2780F:CCTCATCAAGTTCAGCGGGT1 216 bpR:CTTCCCTTACTCCCGACGTGAlr3423F:CACTGCAACTGTTTCCTGCC1 327 bpR:CTTTCGGTCGTCTGCGGATAddlA2981F:TGCGTCGTCGAGATACTTGG1 000 bpR:TCATAAAGGGCTGTCGGTGG

2.6Real-time PCR 根據MIC結果，篩選出3株環(huán)絲氨酸耐藥株及53株環(huán)絲氨酸敏感株，與H37Rv標準株一起進行培養(yǎng)2周后抽提RNA。運用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(購自Takara公司)，根據說明書配制反應體系并對RNA進行逆轉錄，得到cDNA。再運用SuperReal PreMix(SYBR Green)試劑盒(購自TIANGEN公司)，進行Real-time PCR反應。首先向每支2×SuperReal PreMix Plus中加入50 μL 50×ROX Reference Dye，之后于冰上配制20.0 μL 反應體系：10.0 μL 2×SuperReal PreMix Plus，正向、反向引物(10 μmol/L，引物序列見表2)各0.6 μL，5.0 μL cDNA，補加RNase Free ddH2O至20.0 μL。配制好后，于熒光定量PCR儀(ABI 7500)中運行程序：95 ℃ 15 min×1；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min×40。

表2 Real-time PCR引物序列
Tab.2 Primer sequence of real-time PCR

引物名稱引物序列(5'→3')SIGAF:GAGATCGGCCAGGTCTACGGCGTGR:CTGACATGGGGGCCCGCTACGTTGmRNA2780F:GCACCACGTCAATTGCCTACR:GGGTTCGCATCAGGTGGTAAmRNA3423F:TCGCATATGGTTTACGCCGAR:GATAGATGCGCCACCTCGAAmRNA2981F:AATGCGGTGTGCTCGAAATGR:TGCGTCGTCGAGATACTTGG

2.7統(tǒng)計學分析 運用Origin 9.0對177株MTB臨床分離株的MIC結果進行作圖分析。采用SPSS 19.0對數據進行統(tǒng)計學分析。

3 結 果

3.1MTB臨床分離株的MIC結果 100株MDR-TB、40株XDR-TB及37株全敏MTB的MIC結果顯示，由表3及圖1可見，耐藥和全敏MTB的MIC值大小及分布沒有太大的差別，對其進行統(tǒng)計學分析，P=0.681>0.05，表明差異不存在統(tǒng)計學意義。與敏感MTB菌株比較，兩組的MIC無明顯差異，證明目前大多數的MDR的結核分枝桿菌菌株大部分也對環(huán)絲氨酸敏感，在MIC檢測數值中發(fā)現(xiàn)耐藥菌株中(MDR-MTB、XDR-MTB)僅有幾株MIC值較高，最高達32 μg/mL，大部分耐藥菌株的MIC值介于8～16 μg/mL之間，因此，本研究將微量液體藥敏方法中界定結核菌對環(huán)絲氨酸耐藥的藥物濃度值初步定為32 μg/mL，即MIC≥32 μg/mL的MTB菌株為對環(huán)絲氨酸耐藥，反之則敏感。根據這個結果，計算得出在140株耐藥MTB臨床分離株對環(huán)絲氨酸的耐藥率僅為4.28%。由此推測，目前臨床上病例即便是MDR-TB和XDR-TB對環(huán)絲氨酸仍然敏感，將環(huán)絲氨酸用于MDR-TB和XDR-TB治療理論上具有較高的療效。

3.2PCR基因擴增測序結果 根據MIC結果，篩選出3株對環(huán)絲氨酸耐藥的MTB和53株對環(huán)絲氨酸敏感的MTB以及H37Rv標準株，對Ald、Alr、ddlA基因位點進行PCR擴增及測序，結果表明，無論是對環(huán)絲氨酸耐藥的MTB還是敏感的MTB，Alr和ddlA基因點皆無突變；而Ald啟動子處大部分MTB都發(fā)生了突變(見表4)。因此，我們對Ald啟動子處的突變和MTB是否對環(huán)絲氨酸耐藥進行了Fisher相關性分析，P=0.155>0.05，由此進行推測，該點的突變與菌株是否對環(huán)絲氨酸耐藥可能不相關。

表3 140株耐藥MTB和37株全敏MTB菌株MIC值分布(株)
Tab.3 MICs of 140 strains of drug-resistant and 37 strains of drug-susceptible MTB

種類株數MIC值(μg/mL)1248163264128敏感菌37001727100MDR-MTB1000003959200XDR-MTB400001124400

注：敏感菌和XDR-MTB中各有一株未長

圖1 140株耐藥結核分枝桿菌和37株全敏結核分枝桿菌的MIC值Fig.1 MICs of 140 strains of drug-resistant and 37 strains of drug-susceptible mycobacterium

表4 結核分枝桿菌對環(huán)絲氨酸耐藥性×Ald啟動子有無突變交叉制表
Tab.4 Tuberculosis resistance to cycloserine in the mutation ofAldcross tabulation

Ald啟動子合計有突變無突變結核分枝桿菌對環(huán)絲耐藥2(2.84)1(0.16)3氨酸的敏感性敏感51(50.16)2(2.84)53合計53356

3.3Real-time PCR擴增結果 根據圖2，可以明確的看到對環(huán)絲氨酸耐藥及敏感的MTB在Ald、Alr及ddlA處基因表達量的對比，對其進行統(tǒng)計學分析(見表5)，結果表明，對環(huán)絲氨酸耐藥及敏感的MTB在Ald、ddlA處基因表達量無統(tǒng)計學差異，環(huán)絲氨酸耐藥菌Alr基因表達量高于環(huán)絲氨酸敏感菌,差異具有統(tǒng)計學意義，P=0.0003。因此，結核分枝桿菌中Alr基因的過表達可作為提示環(huán)絲氨酸耐藥的標志。

圖2 (a)(b)(c)分別為對環(huán)絲氨酸耐藥和敏感結核分枝桿菌的Ald、Alr、ddlA點基因表達量Fig.2 (a) (b) (c) is the gene expression of D-cycloserine-resistant and susceptible in Ald, Alr, ddlA respectively

表5 對環(huán)絲氨酸耐藥和敏感的MTB基因表達量統(tǒng)計學差異
Tab.5 Statistically differences in gene expression level between D-cycloserine-resistant and D-cycloserine-susceptible mycobacterium

P值Ald表達量Alr表達量ddlA表達量對環(huán)絲氨酸耐藥的MTB0.536>0.050.0003<0.050.454>0.05對環(huán)絲氨酸敏感的MTB

4 討 論

結核病是危害人類健康的重大傳染病之一，我國的結核病疫情位居全球第3，最近數據顯示全球新發(fā)結核病人1 040萬[10]。由于管理、藥物、患者方面以及HIV/AIDS流行、缺乏抗結核新藥等因素的存在，造成了耐藥結核病的發(fā)生及流行，這對結核病有效護理和預防結核病全球化產生了一定程度的阻礙。MDR-TB及XDR-TB治療成功率低下。我國仍然是MDR-TB高負擔國家。臨床上需要一種有效藥來對治耐藥結核病，環(huán)絲氨酸是美國于上世紀70年代研制出的產品，由于其具有精神、神經系統(tǒng)的副作用，長期以來得不到臨床的廣泛應用。該藥在近五年的時間內逐步在國內外得到廣泛應用，本研究則是從大批量的來自臨床的MDR-TB菌株進行環(huán)絲氨酸耐藥檢測及機制方面的初探。

首先從耐藥檢測方法的探索方面，目前對MTB環(huán)絲氨酸的藥敏檢測方法是以羅氏固體培養(yǎng)基為基礎的絕對濃度法和比例法，近年來國內外有少數研究進行了對該藥的耐藥率檢測，比如俄羅斯一項研究[3]2001-2002年間采用比例法測得69株MDR-TB對環(huán)絲氨酸的耐藥率為7.4%。韓國[5]2010-2014年間用絕對濃度法測得378例MDR-TB對環(huán)絲氨酸的耐藥率僅為7.1%。陳松華等[11]使用絕對濃度法，對浙江省30個縣區(qū)抽取的1077株結核分枝桿菌測得的環(huán)絲氨酸耐藥率僅為5.77%，趙冰等[12]采用比例法，對從耐藥基線調查點選取的126株MDR-TB測得的環(huán)絲氨酸耐藥率為13.5%，相比于其他抗結核藥物MTB對環(huán)絲氨酸的耐藥率是較低的。但絕對濃度法和比例法無法準確判斷MTB對環(huán)絲氨酸耐藥的臨界值并且藥物存在熱損失，本研究針對上述問題，建立了微量MIC法檢測結核分枝桿菌的耐藥性，并用臨床分離株進行初步驗證。通過對177株MTB臨床分離株的微量MIC值判斷結果顯示，耐藥MTB和全敏MTB的MIC值無統(tǒng)計學差異，且絕大部分菌株的MIC都介于8μg/mL-16μg/mL之間，只有個別菌株的MIC值為32 μg/mL，因此，將微量MIC法中界定MTB對環(huán)絲氨酸耐藥的藥物濃度值初步定為32 μg/mL，即MIC值高于或等于32 μg/mL的為耐藥，反之則敏感，從而計算出140株耐藥MTB臨床分離株對環(huán)絲氨酸的耐藥率僅為4.28%，這說明環(huán)絲氨酸在治療耐藥性結核分枝桿菌中有應用價值，值得在臨床上推廣應用。

其次從耐藥機制的探索方面，環(huán)絲氨酸是D-丙氨酸類似物，與其他藥物無交叉耐藥性，作為二線抗結核藥物用于MDR-TB和XDR-TB的治療[13]。Ald、Alr和ddlA基因分別編碼L-丙氨酸脫氫酶、丙氨酸消旋酶和D-ala-D-ala連接酶，與MTB細胞壁的形成有關，Ald在NADH的參與下催化丙酮酸轉化為L-丙氨酸，Alr將L-丙氨酸轉換為D-丙氨酸，兩個D-丙氨酸分子通過ddlA連接成二肽，進一步形成細胞壁的肽聚糖肽鏈，環(huán)絲氨酸可能通過作用于Ald、Alr及ddlA基因，抑制L-丙氨酸脫氫酶、D-Ala-D-Ala連接酶和D-丙氨酸的消旋酶的作用，阻礙肽多糖的生物合成，進而使結核分枝桿菌的細胞壁缺損[13-15]。研究表明在BCG和恥垢分枝桿菌中過表達Alr基因和ddlA基因可以提高對環(huán)絲氨酸的耐藥[8, 16]，當Alr基因和ddlA基因失活后恥垢分枝桿菌對環(huán)絲氨酸的易感性增加[17]。于霞[18]等人指出Alr編碼基因的突變會影響細菌對環(huán)絲氨酸的耐藥性。Desjardins C A[19]等人檢測敏感MTB菌株、耐藥菌株、Ald敲除菌株的環(huán)絲氨酸MIC，結果顯示Ald敲除菌株的環(huán)絲氨酸MIC值大于敏感MTB菌株的MIC，小于耐藥菌株的MIC，表明Ald基因缺失增加MTB對環(huán)絲氨酸的耐藥性。Gareth A[20]等人用基于代謝組學的穩(wěn)定同位素質譜方法研究發(fā)現(xiàn)，D-環(huán)絲氨酸的異構體L-環(huán)絲氨酸可以抑制Alr基因的表達，對ddlA基因沒有影響，當外源補充D-丙氨酸或L-丙氨酸時可緩解L-環(huán)絲氨酸對Alr基因的作用，說明L-丙氨酸可以與Alr競爭結合L-環(huán)絲氨酸。CycA是細菌絲氨酸/L -丙氨酸/甘氨酸/ D-環(huán)絲氨酸的質子轉運體，含有12個氨基酸轉運子形成的螺旋跨膜區(qū)，屬于AAT家族[21]，Jeffrey M. Chen[22]等人研究發(fā)現(xiàn)CycA位點突變可導致BCG疫苗株對D-環(huán)絲氨酸產生耐藥性。我們根據177株MTB的MIC測定結果，篩選出對環(huán)絲氨酸耐藥/敏感的MTB，對Ald、Alr、ddlA基因位點進行PCR擴增及Real-time PCR擴增，分析得出，對環(huán)絲氨酸耐藥的MTB確實存在Alr基因的過表達，但是并沒有發(fā)現(xiàn)明確的基因突變點。

從該研究的結果看出，微量MIC法檢測MTB對環(huán)絲氨酸的耐藥率僅為4.28%，因此目前臨床使用環(huán)絲氨酸用來治療MDR-TB應該非常有效。尚未發(fā)現(xiàn)環(huán)絲氨酸明確的耐藥突變位點，但Alr基因的過表達與MTB環(huán)絲氨酸耐藥高度相關，其可能是環(huán)絲氨酸耐藥的新機制。未來的研究需要進一步尋找與MTB環(huán)絲氨酸耐藥相關的基因新位點。

利益沖突：無