長鏈非編碼RNA-重編碼調(diào)控因子與腫瘤的研究進(jìn)展

周晉宇，柳杰，尹冶，輝紅蕾，王玉明

昆明醫(yī)科大學(xué) 第二附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，云南 昆明650000

癌癥是世界范圍內(nèi)一個(gè)主要的公共衛(wèi)生問題，也是美國第二大死亡原因。據(jù)美國癌癥協(xié)會(huì)2018年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，美國將新增1 735 350例癌癥病例，609 640例將死于癌癥，亦即幾乎每天1700人死亡。最常見的癌癥死亡原因包括男性肺癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌，女性肺癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌。這4種癌癥占所有癌癥死亡的45%[1]。除此之外，各類腫瘤的發(fā)病率及死亡率出現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，使對(duì)腫瘤發(fā)病原因和靶向治療的研究迫在眉睫。Hanahan和Weinberg[2]總結(jié)了人類腫瘤多級(jí)發(fā)展過程中形成的10個(gè)生物功能，構(gòu)成了癌癥的特征，這些特征為分析復(fù)雜的腫瘤性疾病提供了一個(gè)組織原則。這10個(gè)特征包括：持續(xù)的增殖信號(hào)；避開生長抑制；逃避免疫破壞；無限增殖；促腫瘤炎癥；激活浸潤和轉(zhuǎn)移；誘導(dǎo)血管生成；基因組的不穩(wěn)定和突變；抵抗細(xì)胞死亡；重構(gòu)能量代謝體系。研究癌癥發(fā)現(xiàn)機(jī)理30年來取得了顯著進(jìn)步，其碩果之一就是通過人類基因組測(cè)序可以部分揭示致癌基因在疾病發(fā)生發(fā)展中所起的作用。人類基因組測(cè)序結(jié)果顯示，具有編碼蛋白質(zhì)功能的基因不到全部基因組序列的2%，而在占據(jù)人類基因組98%以上的非蛋白編碼序列中，絕大多數(shù)為長鏈非編碼RNA（long non-cod?ing RNA，LncRNA）。隨著大量LncRNA的發(fā)現(xiàn)，人們的研究重點(diǎn)從編碼RNA轉(zhuǎn)移到LncRNA，并探討其在生物體內(nèi)的作用機(jī)制。2010年發(fā)現(xiàn)了基因間長鏈非編碼RNA（large intergenic non-cod?ing RNA，LincRNA）-重編碼調(diào)控因子（regulator of reprogramming，ROR），它不僅能夠調(diào)控重編程過程，而且在癌癥發(fā)生、發(fā)展過程中也扮演重要角色。但是，目前已知功能的LncRNA并不多，對(duì)LincRNA-ROR的功能研究更少。為了更全面地揭示其在腫瘤發(fā)病過程中的作用，我們?cè)诖藢?duì)LincRNA-ROR的發(fā)現(xiàn)及其在癌癥及癌癥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要作用做簡要綜述。

1 LincRNA-ROR簡介

LncRNA是一組廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄長度超過200 nt的非編碼序列，通常由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄形成，因其缺少有效開放讀框而很少編碼或不能編碼蛋白質(zhì)[3]。研究表明，它們可以通過與微小RNA（microRNA，miRNA）中的mRNA應(yīng)答元件結(jié)合，競爭性地海綿化miRNA，最終調(diào)控基因表達(dá)，從而發(fā)揮競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNAs，ceRNAs）的競爭作用[4]。有研究表明，LncRNA參與的生物學(xué)過程包括染色質(zhì)重構(gòu)、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)、細(xì)胞間信號(hào)傳遞。更值得注意的是，LncRNA在細(xì)胞異常調(diào)節(jié)、誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生中起關(guān)鍵作用[5]。

LincRNA-ROR是基因間LncRNA的一種，由4個(gè)外顯子組成，位于染色體18q21.31，長2.6 kb。Loewer等[6]最初發(fā)現(xiàn)其在胚胎干細(xì)胞中參與細(xì)胞重編程過程，能夠調(diào)節(jié)分化細(xì)胞轉(zhuǎn)換為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）的重編過程，因此得名。近期研究表明，LincRNAROR是一種重新編程的調(diào)節(jié)劑，與腫瘤發(fā)生有關(guān)，在未分化的腫瘤中過表達(dá)，與腫瘤復(fù)發(fā)和不良的治療反應(yīng)有很強(qiáng)的相關(guān)性。在結(jié)直腸癌、胰腺癌、乳腺癌等組織及細(xì)胞中異常表達(dá)，且已證明與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移等過程相關(guān)[7]。

據(jù)Loewer等[6]報(bào)道，LincRNA-ROR是多能干細(xì)胞重編程衍生的啟動(dòng)子，是核心轉(zhuǎn)錄因子（tran?scription factors，TFs）Oct4、Sox2和Nanog的結(jié)合位點(diǎn)，被認(rèn)為是調(diào)控這些TFs表達(dá)的一種ceRNA。LincRNA-ROR通過在轉(zhuǎn)錄后水平吸附miR-145，對(duì)人類胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cells，hESCs）的自我更新和分化有巨大影響。此外有研究表明，LincRNA-ROR的表達(dá)水平限制在低分化細(xì)胞群中，與干細(xì)胞或具有干細(xì)胞樣功能的細(xì)胞相比，所有體細(xì)胞的LincRNA-ROR表達(dá)都較低，提示LincRNA-ROR的表達(dá)可能與干細(xì)胞樣特性有關(guān)[8]。

2 LincRNA-ROR的作用機(jī)制

LincRNA-ROR是一種典型的LncRNA，它在與miRNA的相互作用和維持干細(xì)胞多能性方面起著重要的調(diào)控作用，同時(shí)也可觸發(fā)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epi-to-mesenchymal transition，EMT）。LincRNA-ROR在缺氧條件下也發(fā)揮了各種關(guān)鍵作用，且對(duì)腫瘤的發(fā)生有著促進(jìn)作用。Takahashi等[9]研究發(fā)現(xiàn)，LincRNA-ROR能夠在低氧環(huán)境中通過調(diào)節(jié)低氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia inducible fac?tor-1α，HIF-1α）及其下游基因來調(diào)控肝癌細(xì)胞的生長增殖。除此之外，雖然LincRNA-ROR主要促進(jìn)腫瘤發(fā)生，但它部分通過阻斷KLF4的表達(dá)，也可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖和膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（glio?ma stem cells，GSCs）自我更新[10]。

2.1 LincRNA-ROR作為ceRNA調(diào)節(jié)細(xì)胞進(jìn)程

ceRNA通過與miRNA應(yīng)答元件（miRNA re?spond elements，MREs）相互作用，在轉(zhuǎn)錄組的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中扮演重要角色。有研究表明，LncRNA在調(diào)控miRNA的濃度和生物學(xué)功能方面可能作為ceRNA發(fā)揮作用[11]，LincRNA-ROR也如此，其過表達(dá)可能逆轉(zhuǎn)miRNA與其靶基因之間的負(fù)調(diào)控。Wang等[7]在LincRNA-ROR與相關(guān)miRNA之間建立了一個(gè)調(diào)控反饋循環(huán)的模型，他們發(fā)現(xiàn)LincRNA-ROR作為ceRNA來調(diào)控包括Oct4、Sox2和Nanog在內(nèi)的TFs的表達(dá)，以及通過分子海綿吸附hESCs中差異相關(guān)的miRNA來調(diào)控同源域蛋白，特別是miR-145。這些TFs已被證實(shí)在各種腫瘤中表達(dá)，并與未分化表型相關(guān)。通過外源性方式將TFs導(dǎo)入小鼠或成人細(xì)胞中，并將其重新編程為iPSCs，從而誘導(dǎo)多能性。此外，LincRNAROR不僅對(duì)多能細(xì)胞有影響，對(duì)癌癥干細(xì)胞（can?cer stem cells，CSCs）也有影響，敲低LincRNAROR可以降低CSCs成為癌癥起源的可能性，從而促進(jìn)相關(guān)研究和細(xì)胞治療。在以上研究基礎(chǔ)上，Gao等[12]指出沉默LincRNA-ROR可以抑制胰腺癌干細(xì)胞（pancreatic cancer stem cells，PCSCs）的增殖、侵襲和致癌性，從而降低PCSCs的惡性特征。因此LincRNA-ROR可以作為胰腺癌的預(yù)后判斷因子。此外，有研究已經(jīng)證實(shí)，在三陰性乳腺癌中，LincRNA-ROR的功能與ceRNA類似，它會(huì)海綿化miR-145，從而上調(diào)ARF6的表達(dá)。ARF6通過E-鈣黏蛋白調(diào)控乳腺腫瘤細(xì)胞的黏附和侵襲特性。值得注意的是，Duru等[13]認(rèn)為來自CD49f+/CD44+/CD24-單細(xì)胞的侵襲性克隆激活Oct4/Sox2/LincRNA-ROR信號(hào)軸，從而維持癌癥干細(xì)胞的自我更新，并調(diào)節(jié)乳腺癌的分化。另外，LincRNAROR被確認(rèn)為預(yù)后判斷生物標(biāo)志物，并與miR-145相關(guān)，在結(jié)腸癌中發(fā)揮作用[14]。Zou等[15-16]研究表明，LincRNA-ROR可以作為分子海綿，競爭性地通過miR-145調(diào)控Sox2的表達(dá)，從而維持人類羊膜上皮細(xì)胞（HuAECs）多能性和提高它們分化成胰島β細(xì)胞的效率，這已被移植到糖尿病患者或動(dòng)物模型證明它們可以幫助恢復(fù)胰島功能，因此有可能是潛在的治療方法。此外，有證據(jù)表明，LincRNA-ROR通過類ceRNA功能抑制miR-133的表達(dá)和功能，從而促進(jìn)了胎兒基因（ANP和BNP）和心肌細(xì)胞肥大相關(guān)基因的再表達(dá)[17]。Lin?cRNA-ROR通過抑制miRNAs，在發(fā)育和組織再生過程中調(diào)控遺傳網(wǎng)絡(luò)，并有可能成為許多疾病的新療法。

2.2 LincRNA-ROR觸發(fā)EMT進(jìn)程

EMT是上皮細(xì)胞失去細(xì)胞極性和細(xì)胞黏附，獲得遷移和侵襲特性，成為間充質(zhì)干細(xì)胞的過程。LincRNA-ROR在上皮腫瘤發(fā)生中的作用涉及EMT觸發(fā)和干細(xì)胞獲得，抑制LincRNA-ROR可能逆轉(zhuǎn)EMT過程[18]。LincRNA-ROR可以阻止miR-205靶基因的降解，從而誘導(dǎo)EMT，促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。此外，Chen等[19]發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)的LincRNA-ROR能夠降低乳腺癌細(xì)胞系對(duì)抗癌藥物5-氟尿嘧啶（5-FU）和紫杉醇的敏感性。通過誘導(dǎo)與5-FU和紫杉醇耐藥相關(guān)的EMT，證實(shí)了LincRNA-ROR是乳腺癌多重耐藥的重要標(biāo)志。此外，LincRNA-ROR能夠通過上調(diào)E盒結(jié)合鋅指蛋白（zinc finger E-box-binding protein 1，ZEB1）而誘導(dǎo)啟動(dòng)EMT程序，維持胰腺癌的干性，從而能夠促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[20]。

2.3 LincRNA-ROR誘騙基因特異性組蛋白甲基化促進(jìn)腫瘤發(fā)生

組蛋白經(jīng)過翻譯后修飾，改變了其與DNA和核蛋白的相互作用，這些修飾包括甲基化、乙?；⒘姿峄?、泛素化、亞?；?、瓜氨酸化和ADP-核糖基化。組蛋白修飾影響基因調(diào)控、DNA修復(fù)、染色體濃縮和精子形成等生物過程。Fan等[21]首先報(bào)道了LincRNA-ROR作為誘騙oncoRNA阻止染色質(zhì)調(diào)節(jié)因子（G9A甲基轉(zhuǎn)移酶）的招募行為，進(jìn)一步消除組蛋白H3K9修飾的啟動(dòng)子TESC，并誘導(dǎo)異常的腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。而在沒有Lin?cRNA-ROR表達(dá)的情況下，G9A甲基轉(zhuǎn)移酶恢復(fù)到TESC啟動(dòng)子，從而通過靶向組蛋白H3K9甲基化沉默TESC的表達(dá)，顯著抑制腫瘤進(jìn)展。此研究結(jié)果揭示了在腫瘤發(fā)生中LincRNA-ROR作為誘騙oncoRNA與組蛋白修飾的全新機(jī)制。

3 LincRNA-ROR與癌癥

3.1 LincRNA-ROR與結(jié)直腸癌（colorectal can?cer，CRC）

CRC是最常見的惡性腫瘤之一，惡性程度高，預(yù)后差，在全球癌癥相關(guān)死亡人數(shù)中排名第三，每年死亡人數(shù)約有69萬[22]。Li等[23]研究發(fā)現(xiàn)，CRC組織中LincRNA-ROR表達(dá)水平比相鄰組織明顯升高，敲減LincRNA-ROR能顯著降低HT29細(xì)胞增殖、觸發(fā)細(xì)胞周期阻滯、增強(qiáng)細(xì)胞凋亡，而LincRNA-ROR過表達(dá)對(duì)M5細(xì)胞系有顯著的相反作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)LincRNA-ROR下調(diào)可抑制CRC細(xì)胞的生長和增殖。因此，認(rèn)為LincRNAROR可能在CRC中作為一種促癌基因發(fā)揮作用。此外，在CRC中敲減LincRNA-ROR能顯著增加p53及其靶基因的蛋白表達(dá)水平，而Linc-ROR過表達(dá)則相反。p53蛋白水平與體內(nèi)LincRNA-ROR呈負(fù)相關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明，在CRC發(fā)生和發(fā)展中，LincRNA-ROR的機(jī)制可能部分通過p53的信號(hào)通路起作用。綜上所述，LincRNA-ROR有可能成為CRC的一種創(chuàng)新性和前瞻性的治療靶點(diǎn)。

3.2 LincRNA-ROR與胰腺癌

胰腺癌是惡性率最高的腫瘤之一，死亡率極高。Gao等[12]發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織中的LincRNA-ROR明顯上調(diào)，且與腫瘤大小有關(guān)。此外，LincRNAROR表達(dá)水平較低的患者的總生存時(shí)間明顯長于中等或較強(qiáng)LincRNA-ROR表達(dá)的患者。通過RNA干擾敲減LincRNA-ROR可抑制PCSCs的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，減少遷移。裸鼠實(shí)驗(yàn)表明，LincRNA-ROR沉默導(dǎo)致PCSCs的腫瘤發(fā)生率顯著低于對(duì)照組。致癌機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，LincRNAROR可能作為ceRNA發(fā)揮作用，其通過干擾miR-145的功能而激活核心轉(zhuǎn)錄因子Nanog的表達(dá)。Nanog和LincRNA-ROR的表達(dá)都與PCSCs中的miR-145水平呈負(fù)相關(guān)，抑制LincRNA-ROR的表達(dá)能促進(jìn)內(nèi)源性miR-145上調(diào)及沉默Nanog的表達(dá)。LincRNA-ROR、miR-145和Nanog之間的上述關(guān)系可以定義為相互競爭、相互制約，平衡這種“LincRNA-ROR-miR-145-Nanog”關(guān)系是PCSCs維持其高增殖、侵襲和腫瘤發(fā)生率的重要機(jī)制之一。總之，在胰腺癌中LincRNA-ROR低表達(dá)可以抑制細(xì)胞增殖、侵襲和腫瘤發(fā)生，LincRNA-ROR在調(diào)控多重致癌性和胰腺癌進(jìn)展方面發(fā)揮著直接作用。因此，LincRNA-ROR是預(yù)測(cè)胰腺癌患者術(shù)后臨床結(jié)果的一種新的預(yù)后標(biāo)志物，也可能是治療的合理靶點(diǎn)。

3.3 LincRNA-ROR與乳腺癌（breast cancer，BC）

BC是最常見的癌癥類型，也是女性癌癥相關(guān)死亡的第二大原因，全球每年約100萬新增病例，超過40萬人死亡。Hou等[18]發(fā)現(xiàn)LincRNA-ROR可能是EMT的重要調(diào)控因子，通過調(diào)控miRNA表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。該研究表明乳腺腫瘤標(biāo)本中LincRNA-ROR上調(diào)，且能增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。相反，沉默的LincRNA-ROR抑制乳腺腫瘤生長和體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移。LincRNA-ROR作為miR-205的ceRNA，通過抑制miR-205的表達(dá)而降低其對(duì)靶基因ZEB1和ZEB2的抑制作用，進(jìn)而促進(jìn)EMT的過程。因此，LincRNA-ROR作為EMT的重要調(diào)節(jié)因子，可以通過調(diào)控miRNAs促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。同時(shí)提示LincRNAROR可能是侵襲性和轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療靶點(diǎn)。

Wan等[24]研究發(fā)現(xiàn)LincRNA-ROR可以作為一種誘餌oncoRNA來促進(jìn)雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽性乳腺癌的雌激素獨(dú)立生長。在雌激素缺乏的情況下，LincRNA-ROR會(huì)導(dǎo)致磷酸化MAPK/ERK通路的上調(diào)，進(jìn)而激活ER信號(hào)。當(dāng)LincRNA-ROR敲除后，雌激素缺失誘導(dǎo)的ERK激活和ER磷酸化消失，而LincRNA-ROR的重新表達(dá)可恢復(fù)上述所有表型。此外，還發(fā)現(xiàn)雙特異性磷酸酶7（DUSP7）參與了LincRNA-ROR敲除誘導(dǎo)的MAPK/ERK信號(hào)抑制。LincRNA-ROR敲除增加了DUSP7的蛋白穩(wěn)定性，抑制ERK磷酸化。臨床數(shù)據(jù)分析顯示，ER陽性乳腺癌樣品中DUSP7表達(dá)低于ER陰性乳腺癌，且DUSP7表達(dá)下調(diào)與患者生存狀況不佳有關(guān)。

3.4 LincRNA-ROR與三陰性乳腺癌（triple-nega?tive breast cancer，TNBC）

TNBC約占BC病例的20%，特別是在年輕女性中經(jīng)常發(fā)生。臨床上常常通過全身性治療來降低TNBC的特異性死亡率，但其復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率仍然高，這意味著急需開發(fā)有效的治療方法。Eades等[25]研究發(fā)現(xiàn)LincRNA-ROR在TNBC細(xì)胞系和組織樣品中上調(diào)，其作為miR-145的ceRNA過表達(dá)，并下調(diào)miR-145的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控三磷酸鳥苷（GTP）結(jié)合蛋白ARF6的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞的黏附和轉(zhuǎn)移。miR-145下調(diào)是TNBC的一個(gè)標(biāo)志，miR-145并不影響增殖或凋亡，而是調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲，且對(duì)參與腫瘤侵襲的miR-145調(diào)控通路的研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的靶點(diǎn)GTP結(jié)合蛋白ARF6。ARF6是一個(gè)已知的乳腺腫瘤細(xì)胞侵襲的調(diào)節(jié)因子，在TNBC和BC轉(zhuǎn)移中被顯著上調(diào)。ARF6的過表達(dá)導(dǎo)致E-鈣黏蛋白定位丟失，細(xì)胞連接中斷。這些研究結(jié)果揭示了LincRNA-ROR/miR-145/ARF6通路調(diào)控TNBC的侵襲。

Ma等[26]發(fā)現(xiàn)LincRNA-ROR/miR-145與TNBC細(xì)胞系MDA-MB-231中的靶基因MUC1相關(guān)。Mucin1（MUC1）是黏蛋白（mucin）家族的一員，通常在腺器官中表達(dá)。在乳腺癌中，MUC1通過誘導(dǎo)EMT增強(qiáng)癌細(xì)胞的侵襲性，其表達(dá)增加與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后較差有關(guān)[27-28]。據(jù)研究，LincRNAROR的異常表達(dá)會(huì)增加MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移和功能喪失。LincRNA-ROR作為ceRNA作用于miR-145，上調(diào)MUC1的表達(dá)且影響E-鈣黏蛋白膜的定位，進(jìn)而誘導(dǎo)EMT增強(qiáng)癌細(xì)胞的侵襲性。綜上，LincRNA-ROR/miR-145參與調(diào)控TNBC細(xì)胞侵襲和遷移的靶基因MUC1，提示Lin?cRNA-ROR可能是TNBC潛在的治療靶點(diǎn)。

4 結(jié)語

本文初步探討了LincRNA-ROR在癌組織中的異常表達(dá)，及其在癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲等生物學(xué)功能中的重要調(diào)節(jié)作用。許多證據(jù)表明，LincRNA-ROR是一種有效的腫瘤啟動(dòng)子，在不同的癌癥中存在異常的表達(dá)。其腫瘤促進(jìn)功能可歸因于其調(diào)控的靶基因涉及多種途徑，包括增殖、侵襲、血管生成和癌癥干細(xì)胞。LincRNAROR與許多信號(hào)通路密切相關(guān)，因此，要全面了解LincRNA-ROR的生物學(xué)作用，還需要發(fā)現(xiàn)新的靶點(diǎn)。LincRNA-ROR與腫瘤的惡性生物學(xué)行為明顯相關(guān)，這為進(jìn)一步篩選腫瘤分子標(biāo)志物奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為腫瘤尋找分子治療靶標(biāo)提供了依據(jù)。然而，有關(guān)LincRNA-ROR在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的分子調(diào)控機(jī)制，有待進(jìn)一步深入研究。

LincRNA-ROR在眾多腫瘤中異常表達(dá)，可作為一些腫瘤早期篩查診斷依據(jù)。通過RNA干擾等實(shí)驗(yàn)技術(shù)影響其在腫瘤組織中的表達(dá)，從而引起腫瘤細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移、凋亡等生物學(xué)行為以及對(duì)化療藥物敏感性的改變，為腫瘤的靶向治療及療效評(píng)估提供新思路。目前對(duì)LincRNAROR的研究尚處于初級(jí)階段，其作用機(jī)制等尚不明確。隨著研究的深入，相信LincRNA-ROR在腫瘤診斷、治療及預(yù)后中將發(fā)揮重要作用。