宏組學在發(fā)酵食品微生物群落研究中的應用進展

田露 閔建紅 張帝 龔國利

（陜西科技大學食品與生物工程學院，西安 710021）

發(fā)酵食品是指利用微生物加工制造而成的一類具有獨特風味與營養(yǎng)價值的食品，分布廣泛且制造和食用歷史悠久，同時具有豐富的微生物資源，供研究者探索研究［1］。在過去的20年中，新一代測序技術和質量分析儀，以及其他新技術的出現(xiàn)，大大提高了發(fā)酵食品的研究進展。高通量測序等方法的頻繁應用，為發(fā)酵食品微生物群落分析作出了巨大貢獻，如干酪、葡萄酒的研究。本文通過宏基因組學、宏轉錄組學、宏蛋白質組學和代謝組學對發(fā)酵食品的分子機制進行了探討；著重關注微生物的演替貢獻、功能基因及酶資源的挖掘，討論了現(xiàn)有的局限性，以期對未來食品發(fā)酵研究提供相關線索。

1 宏組學技術

發(fā)酵食品中的微生物是一個復雜系統(tǒng)集合，從這個復雜系統(tǒng)中獲取的DNA、RNA、蛋白質和代謝物進行的研究稱之為宏組學。進入后基因組學時代，測序技術飛速發(fā)展，測序成本明顯下降，形成了涵蓋宏基因組學、宏轉錄組學、宏蛋白質組學和代謝組學在內的宏組學技術，推動了對微生物群落的多樣性、結構及潛在基因功能方面的深入研究。

1.1 宏基因組學

宏基因組［2］，其最初的含義指的是生態(tài)環(huán)境中全部微生物遺傳物質的總和。現(xiàn)在，宏基因組指的是特定環(huán)境中細菌和真菌的遺傳物質的總和。宏基因組學則是一種不依賴于純培養(yǎng)的基因組分析手段，它是通過收集環(huán)境樣品并提取樣品中的優(yōu)質DNA來構建宏基因組文庫，通過高通量測序，對測序結果進行數(shù)據(jù)分析來研究樣品中微生物的一種方法。宏基因組學方法包括全宏基因組技術及16S rDNA 片段擴增技術，借助高通量測序，打破了傳統(tǒng)以培養(yǎng)為主的微生物研究方式，縮短了實驗時間，具有高效性、準確性等特點。目前宏基因組學技術正日臻成熟，也形成了比較完善的研究流程，其中 DNA 測序和數(shù)據(jù)分析是宏基因組學研究的關鍵部分。

宏基因組學研究主要分成兩個層面，一是分析環(huán)境中特定基因，即通過構建宏基因組文庫，基于序列篩選或者基于功能篩選分析某種功能基因，并進一步對篩選到的基因進行深度測序；二是針對環(huán)境中所有DNA進行深度測序，分析該環(huán)境中微生物的組成與相關功能。這兩方面的相關分析都依賴于測序的深度和廣度。宏基因組測序能夠對開菲爾粒中的低豐度物種進行鑒定，表明了其在微生物群落分析中具有更高的分辨率和豐度準確度［3］。借由宏基因組，得以發(fā)現(xiàn)大量不可培養(yǎng)的微生物，以及認知更多新的功能基因或新基因簇，極大地增加了人類對微生物群落組成、演替及其互相作用的認識。

1.2 宏轉錄組學

就環(huán)境樣品微生物研究而言，基因組學的手段無法說明微生物基因的表達量情況，當生境或其他因素變化時，同一微生物個體的基因表達也會由于適應環(huán)境出現(xiàn)變化，這時需結合宏轉錄組學，它將生境中全部RNA作為研究對象，從轉錄組水平分析樣本微生物的組成及活性基因表達情況。宏轉錄組學是指在某個特定條件或特定時空，群落中所有微生物基因轉錄本的總和，可用于原位衡量微生物群落宏基因組表達水平，篩選出高表達活性功能基因和微生物［4］。以前主要采用基因芯片或微陣列技術，而隨著新一代高通量測序技術的快速發(fā)展，生境中的RNA也可以直接利用高通量測序技術進行分析。針對動態(tài)表達的基因，宏轉錄組學在群體RNA逆轉錄后對cDNA進行測序。揭示了特定生境因素，特定時間下微生物基因表達和調控機制，并且更易發(fā)現(xiàn)新的基因，這些基因可在某些特定環(huán)境條件下發(fā)揮很大作用［5］。

1.3 宏蛋白質組學

宏蛋白質組學是在特定時間點對環(huán)境微生物群的所有蛋白質的組成進行大規(guī)模鑒定。宏蛋白質組技術分析因蛋白質復雜多樣的特點，因此對檢測技術要求具有高通量、高靈敏度、動態(tài)范圍廣、質量估計精確等特點，而質譜分析法是最合適條件的檢測平臺。一般而言，宏蛋白質組學依據(jù)宏基因組數(shù)據(jù)，通過質譜技術采集特定環(huán)境條件下微生物種群中全部蛋白質信息，探索微生物組成及代謝方式，揭示環(huán)境中蛋白質的組成與豐度、蛋白質的不同修飾、蛋白質和蛋白質之間的相互關系，可以認識微生物群落的發(fā)展、種內相互關系、營養(yǎng)競爭關系等。宏蛋白質組的研究方法，其流程一般包括蛋白質樣品制備、蛋白分離和蛋白鑒定等。研究策略主要有2 種，一種采用雙向凝膠電泳（Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2-D PAGE） 結 合質譜（Massspectrometry，MS）技術，能對復雜蛋白質混合樣品進行定性和定量分析；另一種是多重色譜分離與 MS 聯(lián)用技術進行宏蛋白質組分析。目前，宏蛋白質組學研究中常用的研究方法是：2-D PAGE與基質輔助激光解析電離串聯(lián)飛行時間質譜（MALDI-TOF/TOF-MS）聯(lián)用［6］和液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用（LC-MS/MS）［7］。特別是新興起的軌道離子阱（Orbitrap）質譜技術，可利用痕量樣品就可以鑒定蛋白質，可以用于環(huán)境樣品中低豐度的蛋白質分析檢測。因此，色譜串聯(lián)質譜法有望在宏蛋白質組學研究中獲得更為廣泛的應用［8］。

在近10年中，宏蛋白質組學技術已經(jīng)應用于多個環(huán)境微生物群落的研究中，從活性污泥、土壤到人類腸道微生物群，對微生物生態(tài)系統(tǒng)功能產生了許多重要見解［9］。在發(fā)酵食品中仍然有一些蛋白質組學和宏蛋白質組學的報告，如在高酸度醋發(fā)酵過程中的乳酸菌、醋酸菌、巴氏醋酸桿菌［10］、普洱茶固態(tài)發(fā)酵及中國白酒類等。宏蛋白質組學仍然是發(fā)酵食品中一個很有前景但尚未充分開發(fā)的領域。

1.4 代謝組學

代謝組學則是對某一生物或細胞在一特定生理時期內所有低分子量代謝產物同時進行定性和定量分析的一門新學科。研究代謝組可以了解生物體的基因型和表型是如何關聯(lián)的，以及外界環(huán)境如何對生物代謝產生影響的。靶向或非靶向代謝組學分析都依賴于代謝物分離、檢測、鑒定和定量以及多元數(shù)據(jù)分析［11］。代謝物的分離與檢測是代謝組學研究的關鍵步驟，目前最常用的代謝組學分析技術是核磁共振（Nuclear magnetic resonance，NMR）、液相色譜串聯(lián)質譜（Liquid chromatographymass spectrometry，LC-MS）和氣相色譜串聯(lián)質譜（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS），這些分析方法都可以鑒定代謝物的結構和測定分子濃度［12-13］。核磁共振技術樣品預處理方法簡單，能夠快速準確地對樣品進行高通量分析。在乳酸菌代謝組學測定分析中應用較為廣泛的是GC-MS和LCMS，這兩種技術可以檢測包括糖、糖醇、有機酸、氨基酸、脂肪酸及大量次級代謝物在內的數(shù)百種化合物［14］。代謝組學能高通量的鑒定和定量代謝物的變化［15］。它已成功應用于各種發(fā)酵食品中的代謝物概況，以評估食品質量、可追溯性、真實性和安全性。當與其他宏組學方法相結合時，代謝組學為揭示發(fā)酵食品生產的潛在機制提供了重要的見解。

2 宏組學工具在發(fā)酵食品微生物群落研究中的應用

2.1 奶酪

奶酪也稱乳酪或干酪，是動物乳經(jīng)發(fā)酵產生的有機酸或凝乳酶使蛋白質凝固，并經(jīng)進一步成熟而形成的具有不同風味的乳制品。奶酪微生物群落包括細菌、酵母和霉菌等，它們在蛋白質凝固和獨特風味形成過程中發(fā)揮著決定性的作用。

美國哈佛大學學者Wolfe［16］對10個國家的137種奶酪表皮群落進行了宏基因組直接測序，揭示了奶酪表皮中廣泛分布著24種主要的細菌和真菌。測序樣本表明這些奶酪中分布的微生物具有高度可重復性，并將奶酪表皮作為一種模式生態(tài)系統(tǒng)，用來研究微生物之間的相互作用和變化機制。微生物宏基因組研究及數(shù)據(jù)分析很大程度上依賴于參考菌株數(shù)據(jù)庫的豐富度，傳統(tǒng)奶酪發(fā)酵是一個典型微生物群落作用的結果，然而，目前對奶酪發(fā)酵的群落結構、安全性、不同微生物作用等特征的研究還不夠成熟，一個重要原因就是參考菌株數(shù)據(jù)庫的缺乏。Almeida等［17］利用測序技術建立了奶酪菌群數(shù)據(jù)庫，對其67個屬中137個物種的142株菌株進行了基因組測序，并重構117個基因組。其中包括了目前未在公共數(shù)據(jù)庫中出現(xiàn)的克呂沃氏菌屬，藤黃球菌屬和海生乳桿菌屬等微生物，這對乳制品微生物的群落研究起到了重要作用。用這些乳制品基因組作為參考，觀察到傳統(tǒng)奶酪中一些微生物最初并沒有被接種，如假交替單胞菌，或靜止嗜冷桿菌，卻是發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌種，對奶酪產品的特性起作用。宏基因組學方法應用于墨西哥奶酪Cotija微生物群的分類和功能特性中［18］，其中細菌菌群由約98%的厚壁菌門組成，包括3種優(yōu)勢菌屬（乳酸桿菌、明串珠菌和魏斯氏菌）以及500多種非優(yōu)勢屬，分屬細菌和古細菌的31個門。宏基因組數(shù)據(jù)表明，Cotija菌群具有產生特有風味和香味化合物的代謝潛能，主要參與支鏈氨基酸和游離脂肪酸代謝。全面解析奶酪樣品中微生物群落多樣性，比較不同種類奶酪樣品微生物群落結構差異，對解析奶酪蛋白質凝固和風味質構形成具有重要的參考價值。同時，也為發(fā)掘和分離奶酪中的微生物菌株資源奠定基礎。

宏轉錄組學應用于發(fā)酵食品是探索各種微生物在發(fā)酵過程中的代謝途徑，并揭示其特定功能和對風味的貢獻。目前奶酪表皮微生物群落的參考基因組序列較為豐富，為宏轉錄組分析奶酪成熟過程中表皮微生物群落提供了更大可能性，奶酪持續(xù)成為發(fā)酵食品微生物研究的熱點對象。Monnet等［19］分別在第5、14、19和35 d通過宏轉錄組學分析了瑞布羅申奶酪（Reblochon）中微生物的活性。另外，宏轉錄組學也可以揭示高溫驅動奶酪成熟過程中微生物群落及其功能的變化［20］，在奶酪成熟過程中，溫度上升顯著提高了奶酪成熟率，并且與蛋白質水解、脂類分解、氨基酸或脂質分解代謝有關微生物的基因表達也發(fā)生了上調。這些宏轉錄組數(shù)據(jù)分析的結果可應用于工業(yè)生產，通過調控溫度進而達到調節(jié)微生物的代謝產物的目的。因此，宏轉錄組學對優(yōu)化生產效率及提高產品質量有重要的指導意義。

隨著組學技術的成熟和成本的降低，研究者們正試圖用多種組學數(shù)據(jù)結合分析來更好地揭示發(fā)酵過程中微生物的功能及其相互作用機制，以期獲得突破性的研究成果。Dugat-Bony等［21］通過宏基因組學，宏轉錄組學和生化分析研究了4周成熟期內6種細菌和3種酵母組成的表面成熟的奶酪群體變化。在成熟初期，乳酸乳球菌和乳酸克魯維酵母迅速消耗乳糖產生大量乳酸。乳酸再被漢遜德巴利酵母和假絲地霉酵母迅速消耗，這表達了高水平的乳酸脫氫酶轉錄本。大多數(shù)的RNA測序片段匹配到假絲地霉酵母的基因上，表明該菌對酪蛋白和脂肪降解起重要作用。測序數(shù)據(jù)表明與氨基酸降解相關的轉錄本源于假絲地霉酵母、干酪棒桿菌和蜂房哈夫尼亞菌，這一數(shù)據(jù)結果與假絲地霉酵母、干酪棒桿菌和蜂房哈夫尼亞菌在后期奶酪表皮旺盛生長相符。在這篇報道中作者結合不同的數(shù)據(jù)分析，獲得了奶酪成熟過程中各種微生物的代謝產物及其可能的相互作用機制。此外，還采用差異表達分析提供了一組用于監(jiān)測奶酪制作過程的生物標記基因，為監(jiān)控奶酪制作過程提供了有價值的工具。

2.2 發(fā)酵酒精飲料

發(fā)酵酒精飲料是以糧食、水果等為主要原料通過發(fā)酵或半發(fā)酵手段制成的可食用型飲料酒。研究者利用微生物培養(yǎng)法和分子生物學方法對發(fā)酵過程中生產環(huán)境和原料中的各種微生物群落進行了研究，如日本的清酒［22］、中國濃香型酒［23］和葡萄酒［24］等。

在印度米酒酒曲研究中，Bora等［25］首次應用宏基因組學揭示了更為全面的微生物群落特征，其中微生物包括以乳酸菌為主的細菌、根霉、毛霉和曲霉等產淀粉酶菌株，季也蒙畢赤酵母、威克漢姆西弗酵母、釀酒酵母等產乙醇菌株。但對于所獲得的宏基因組數(shù)據(jù)，作者僅報道了分類學研究結果，并沒有進一步分析功能基因組和其代謝途徑。

微生物群落在酒發(fā)酵過程中扮演著不同的角色，對酒的發(fā)酵起著至關重要的作用。研究者們利用宏基因組數(shù)據(jù)，構建代謝途徑，能夠為微生物群落的代謝特征提供更加詳細的解析。例如，在醬香型白酒發(fā)酵過程中，Chen等［26］報道，宛氏擬青霉具有最高的葡糖淀粉酶活性，米曲霉在可培養(yǎng)的真菌物種中顯示出最高的a-淀粉酶活性。此外，在宛氏擬青霉和米曲霉生長與堆積發(fā)酵過程中淀粉和還原糖含量變化是一致的，表明它們在提供淀粉酶水解淀粉方面發(fā)揮著重要作用。在中國濃香型白酒中，克氏梭菌被認為是主要風味化合物己酸乙酯前體己酸的主要生產者［27］。在越南米酒的微生物演替和功能特性研究中，根霉被確定為主要的淀粉降解菌，釀酒酵母為主要的乙醇生產者。

釀酒酵母長期用于制備發(fā)酵酒精飲料和其他發(fā)酵食品，對其基因組學進行分析有助于研究其在發(fā)酵酒精飲料中的功能和演替特性。有研究者通過宏基因組學和宏轉錄組學對從茅臺酒制造環(huán)境中分離出的釀酒酵母MT1［28］進行研究，結果表明MT1具有獨特的多碳協(xié)同作用，它可以同時利用各種糖，包括葡萄糖、蔗糖、半乳糖、麥芽糖、蜜二糖、海藻糖、棉子糖和松二糖。并且在低濃度葡萄糖存在下，己糖轉運蛋白HXT5和HXT13的基因在MT1中的表達也會受到抑制。Song等［29］對酵母研究群體中常用的25種釀酒酵母菌株的基因組進行了重新測定，并開發(fā)了一套自動化泛基因組分析。他們還將11種替代釀酒酵母參考菌株的基因組序列和相應的注釋整合到酵母基因組數(shù)據(jù)庫中，為進一步研究提供數(shù)據(jù)庫。

宏蛋白質組學方法在發(fā)酵酒精飲料中也有相關應用，它提高了人們對發(fā)酵酒精飲料的認識。有研究者對使用30年和300年的中國濃香型白酒窖泥采用宏蛋白質組學方法進行比較，鑒定出63種差異表達蛋白；59種蛋白在300年的窖泥種高度表達［30］，這些蛋白參與甲烷生成，形成己酸和丁酸，因此它們在300年窖泥發(fā)酵過程中可能有助于產生更多的有機化合物。

在酒同步糖化發(fā)酵過程中，像絲狀真菌類的微生物能分泌水解酶，使淀粉降解成可發(fā)酵糖，而釀酒酵母使糖轉化為乙醇和風味物質。在茅臺酒生產中，通過代謝物譜比較和分析，發(fā)現(xiàn)米曲霉不僅為釀酒酵母提供可發(fā)酵糖，而且在糖消耗中與釀酒酵母互相競爭，導致茅臺酒形成了不同的風味成分［31］。白酒易被鏈霉菌屬［Streptomyces（St.）spp.］污染，從而產生土腥素導致白酒帶有泥土味，這是白酒發(fā)酵生產中普遍存在的問題。研究人員從茅臺大曲中分離出的拮抗芽孢桿菌菌株［32］具有顯著抑制土腥素主要生產者St. sampsoni的生長，并且在模擬發(fā)酵實驗中有效地降低了土腥素的產生。最后通過超高相液相色譜串聯(lián)質譜儀（UPLC-ESI/Q-TOF MS）鑒定了芽孢桿菌中的抗菌物質為脂肽。這兩項研究強調了基于綜合代謝組學方法分析白酒發(fā)酵的條件優(yōu)化和生物防治的潛力，可以為中國白酒的工藝改良和品質的提高提供必要的理論依據(jù)和奠定技術基礎。

2.3 發(fā)酵蔬菜

發(fā)酵蔬菜種類繁多，如豆瓣醬、泡菜等。在蔬菜起始發(fā)酵和主發(fā)酵階段，占優(yōu)勢的細菌包括腸膜狀明串珠菌、短乳桿菌、啤酒片球菌、植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌及糞鏈球菌等，其中乳酸菌是發(fā)酵的主體。近年來，宏組學方法已應用于蔬菜發(fā)酵過程中的微生物群落研究。

泡菜是用蔬菜（卷心菜、韭菜和蘿卜等）和各種香料（紅辣椒粉、大蒜和姜等）混合發(fā)酵制得，有時添加發(fā)酵劑。泡菜中的代謝物在發(fā)酵或長期儲存過程中會發(fā)生變化，這與微生物的演替有關［33］。核磁共振氫譜（1H nuclear magnetic resonance，1H NMR）分析表明，泡菜發(fā)酵過程中會產生有機酸、甘露醇和γ-氨基丁酸（Gamma- aminobutyric acid，GABA），明串珠菌和沙克乳桿菌分別被確定為甘露醇和GABA的生產者。為了評價泡菜中發(fā)酵劑植物乳桿菌的發(fā)酵特性，采用了GC-MS和主成分分析（Principal component analysis，PCA）方法，揭示了植物乳桿菌對代謝組學的影響，在發(fā)酵過程中植物乳桿菌引起乳酸和甘油增加，也導致了纈氨酸、亮氨酸、檸檬酸和蔗糖減少［34］。

宏基因組學方法也應用于泡菜中，并有了一定的成果。Jung等［35］運用宏基因組學研究了泡菜29 d發(fā)酵過程中的微生物群落。通過宏基因組的16S rRNA基因數(shù)據(jù)構建的系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明泡菜中優(yōu)勢菌屬為明串珠菌屬、乳桿菌屬和魏斯氏菌屬。在基因功能注釋方面，采用宏基因組注釋技術，揭示了一系列碳水化合物異型乳酸發(fā)酵的相關基因，這與檢測到的發(fā)酵產物甘露醇、乳酸、乙酸乙酯和乙醇等相一致。大多數(shù)泡菜的宏基因組序列與腸膜明串珠菌和沙克乳桿菌基因有很高的同源性，說明這兩種菌在泡菜發(fā)酵中發(fā)揮著重要作用。在宏基因組數(shù)據(jù)庫中也鑒定出了大量的噬菌體DNA序列，說明發(fā)酵過程中微生物群落受到了噬菌體感染。這些結果不僅深入揭示泡菜發(fā)酵中微生物的功能，也揭示了微生物群落對泡菜發(fā)酵過程的影響。

這些代謝組學和宏基因組學報告使我們更好地認識各種微生物在泡菜發(fā)酵過程中發(fā)揮的重要作用，其結果有益于提高發(fā)酵蔬菜的質量和安全性。

2.4 發(fā)酵茶

發(fā)酵茶因其有益健康而一直深受世界各地人們的喜愛。例如，中國普洱茶、茯磚茶和泰國的Miang［36］。普洱茶是一種典型的發(fā)酵茶，它分為生茶和熟茶兩種，是在較高溫度和濕度下加速發(fā)酵制得［37］。Tian 等［38］通過微生物培養(yǎng)和 PCR-DGGE 方法研究了普洱茶生長和成熟不同時間段（從＜1-192個月）樣品中的細菌和真菌群落。研究結果表明，普洱茶貯存時間和質量之間的關系很復雜，涉及多酚含量、微生物豐度和多樣性變化。真菌和細菌豐度隨著貯存時間延長而降低，且熟茶微生物種類顯著多于生茶。細菌多樣性與老化時間呈正相關，老化前60個月生茶和熟茶的真菌多樣性增加，隨后下降，這與多酚含量變化有關。Lyu等［39］通過普洱熟茶發(fā)酵的初步宏基因組學研究劃定了微生物群落的分類和功能特性，確定了3個優(yōu)勢細菌門（變形桿菌，放線菌和厚壁菌門）和一個處于主導地位的真菌門（子囊菌門）。鑒定并分析了涉及16種途徑的69個酶基因，如萜類化合物和聚酮化合物的代謝以及其他次生代謝物的生物合成。這些宏基因組數(shù)據(jù)表明普洱茶發(fā)酵的主要微生物包含細菌和酵母，功能基因的挖掘和代謝途徑的分析有利于在分子水平上對普洱茶發(fā)酵機理作進一步研究。

通過細菌16S rRNA和真菌18S rRNA基因的擴增子測序，在普洱茶中鑒定出變形桿菌（48.42%）、厚壁菌門（19.91%）、放線菌（16.91%）和藍藻（9.95%）為主要細菌，曲霉菌（94.98%）為主要真菌［40］。通過液相色譜-質譜聯(lián)用儀或質譜儀（LC-MS/ MS）進一步對相同樣品進行宏蛋白質組學分析，確定了至少有兩種獨特肽的335種蛋白質。在曲霉菌中發(fā)現(xiàn)了一半已鑒定的蛋白質，這進一步說明曲霉是優(yōu)勢真菌和固態(tài)發(fā)酵的主要貢獻者。鑒定出的蛋白質，包括涉及降解植物細胞壁的酶和過氧化物的氧化還原酶等與普洱茶發(fā)酵密切相關的酶，以及與兒茶素氧化有關的過氧化氫酶和過氧化物酶。另外，代謝組學也被應用在發(fā)酵茶揮發(fā)性和非揮發(fā)性化學成分動態(tài)變化的研究中。研究者通過超高效液相色譜質譜聯(lián)用儀（UPLC-MS）的非靶向代謝組學方法分析了紅茶茶樹某品種在發(fā)酵14 h期間代謝產物的變化［41］，并鑒定出61種代謝產物。這項研究提供了紅茶發(fā)酵過程中非揮發(fā)性代謝物變化的綜合概況［42］。

在對發(fā)酵茶的研究過程中，宏組學技術為闡明微生物在發(fā)酵過程中的作用提供了全面而系統(tǒng)的概述。使人們更好地了解了普洱茶發(fā)酵過程中微生物的消亡規(guī)律和其對普洱茶品質的影響。

2.5 發(fā)酵豆制品

發(fā)酵豆制品主要有兩種，一種是黏性大豆食品，如日本納豆、韓國chungkookjang；另一種是由絲狀霉菌如曲霉、毛霉和根霉發(fā)酵的咸大豆產品。

各種黏性性大豆制品的黏性是由聚-γ-谷氨酸（Poly-gamma-glutamic acid，PGA）產生，其最主要的細菌通常是枯草芽孢桿菌［43］，且印度Kinema的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和索諾拉沙漠芽孢桿菌［Bacillus（B.）sonorensis］均產生 PGA［44］。Jung等［45］通過16S rRNA基因擴增子測序和1H NMR專門研究了韓國大豆醬發(fā)酵中的細菌群落，發(fā)現(xiàn)主要的芽孢桿菌屬和腸球菌屬的豐度與代謝物變化無關，而四聯(lián)球菌是產生有機酸和生物胺的主要原因，并且乳桿菌是γ-氨基丁酸的主要生產者。從韓國chungkookjang中分離出的Bacillussp.LM7抗菌菌株［46］，其分泌的抗菌物質具有極高穩(wěn)定性和廣泛抗菌譜。通過LC-MS分析確定該物質為4種桿菌霉素D和4種表面活性素類似物的脂肽混合物。

另一個重要的發(fā)酵豆制品是醬油，工業(yè)上常用曲霉菌發(fā)酵制得。將醬油菌株米曲霉3.042與米曲霉RIB40的基因組測序比較［47］，分析鑒定了與細胞生長、耐鹽性、環(huán)境抗性和風味形成相關的特異性基因，這基因的發(fā)現(xiàn)能夠解釋菌株產生不同風味醬油的原因。米曲霉100-8及其親本菌株米曲霉3.042用于醬油發(fā)酵，在30、36和42 h的早期發(fā)酵中通過轉錄組和實時定量PCR分析比較它們的基因表達［48］，結果顯示米曲霉100-8中參與活性氧、細胞內Ca2+濃度和孢子形成有關的基因表達較低，而與糖酵解、氧化磷酸化、氨基酸代謝和β-氧化相關的基因表達較高。這種基因調控說明在米曲霉100-8發(fā)酵中高活性的酶是參與糖酵解、氧化磷酸化、氨基酸代謝和β-氧化相關的酶。除真菌外，16S rRNA基因的DGGE和1H NMR代謝物分析鑒定出色鹽桿菌在韓國醬油發(fā)酵過程中會產生有機酸和腐胺。在對醬油鹵水發(fā)酵過程中微生物演替及其功能的研究中，Sulaiman等［49］通過宏基因組研究傳統(tǒng)醬油發(fā)酵過程的微生物群落演替和基因功能，并分析了優(yōu)勢菌群代謝與鹵水特性變化的關聯(lián)。該研究發(fā)現(xiàn)在6個月的發(fā)酵過程中，中國醬油鹵水是先以魏斯氏菌屬為主，后由真菌念珠菌屬發(fā)酵制得。通過宏基因組序列的代謝重建，揭示了蛋白質和碳水化合物異型發(fā)酵的特征，與檢測到乙醇和pH值下降相符。這些研究深入剖析了豆制品發(fā)酵過程中微生物群落結構以及多種優(yōu)勢微生物的基因組和代謝途徑特性，為今后豆制品優(yōu)質發(fā)酵提供了有效的依據(jù)。

2.6 食醋

食醋是由含糖底物發(fā)酵產生的傳統(tǒng)醋酸產品。其品質取決于多種因素，包括酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵階段的原料和微生物多樣性［50］。目前，許多微生物學研究已揭示了傳統(tǒng)發(fā)酵食醋釀造過程中微生物群落的多樣性和形成規(guī)律，但是對群落中微生物的相互作用及主要代謝產物形成之間的關系仍不清楚?；诤昊蚪M測序分析等技術的應用是有效解決上述問題的重要手段。

谷物酸固態(tài)醋酸發(fā)酵是一種混合培養(yǎng)發(fā)酵過程［51］。研究者發(fā)現(xiàn)鎮(zhèn)江香醋的細菌群落演替和風味形成相關［52］，其主要風味物質是通過在群落中微生物的代謝和相互作用而產生。通過rRNA基因擴增子測序和風味分析發(fā)現(xiàn)，鎮(zhèn)江香醋在18 d發(fā)酵過程中產生風味的核心微生物主要有醋酸桿菌、乳桿菌、曲霉菌和交鏈孢霉［53］。同時應用雙向正交偏最小二乘法（Bidirectional orthogonal partial least squares，O2PLS）的微生物演替與風味動力學相關性分析強調了細菌的重要性。根據(jù)其在微生物群落中的主導地位和功能，建議將醋酸桿菌、乳酸桿菌、腸球菌、乳酸球菌、葡萄糖酸桿菌、芽孢桿菌和葡萄球菌7個屬作為食醋風味的功能性核心菌群。通過宏組學技術研究微生物在食醋發(fā)酵中的功能可能有助于弄清其代謝所產生的益處，提高食醋的營養(yǎng)價值。

3 總結與展望

如上所述，近年來，隨著高通量測序技術迅速發(fā)展，以其為主要手段的宏基因組、宏轉錄組和宏蛋白質組等技術在大量的食品微生物中應用，對食品微生物的研究方法和研究內容產生了深遠的影響。然而，目前的宏組學分析仍存在一些局限性。例如，宏基因組技術依賴于總DNA提取與測序深度。天然環(huán)境復雜多樣，環(huán)境中的核酸酶及腐殖質都會影響總DNA提取，因此需要根據(jù)不同環(huán)境樣品優(yōu)化提取條件與提取方法?，F(xiàn)有的測序技術如Illumin適用高通量測序，但是序列片段短，拼接具有一定難度；宏轉錄組學也存在許多技術上的挑戰(zhàn)，如mRNA半衰期短、富集非常困難、cDNA合成和擴增存在偏差等；宏基因組和宏轉錄組測序數(shù)據(jù)量較大，測序數(shù)據(jù)的后續(xù)分析也依賴于硬件系統(tǒng)與算法程序的精確性，因此后續(xù)數(shù)據(jù)處理結果的準確性取決于硬件系統(tǒng)和算法程序的開發(fā)。另外，由于測序費用昂貴導致測序重復樣本較少，降低了實驗結果的可靠性和再現(xiàn)性；宏蛋白質組學在研究環(huán)境中微生物區(qū)系的活動中具有很大潛力，但是環(huán)境樣品（如土壤和沉積物等）成分復雜，蛋白質提取是該技術最大挑戰(zhàn)，而且蛋白質不能擴增，穩(wěn)定性差，環(huán)境中蛋白質含量少等因素，影響提取效果與提取效率。

隨著宏組學技術提取方法的改進和高通量測序技術的發(fā)展，相信這些技術的缺點將會逐漸被解決，并在多種生態(tài)領域得到快速的發(fā)展和應用。目前，具有更多優(yōu)勢的三代測序技術也已經(jīng)應運而生，如太平洋測序生物科學公司Pac Bio RS平臺具有超長讀取長度（10 kb）和極低的鳥嘌呤核酸和胞嘧啶核酸（Guanylic acid andcytidylic acid，GC）偏好性，有利于基因組的組裝［54］；在高等動植物基因組和轉錄組的研究中測序技術和光學圖譜技術的結合使用，為發(fā)酵食品微生物群落結構的研究提供了更加準確的方法。隨著測序、MS技術的進步和統(tǒng)計算法軟件快速的更新?lián)Q代，相信包括宏基因組學、宏轉錄組學、宏蛋白質組學和代謝學在內的綜合宏組學技術的聯(lián)系將會更加緊密。宏基因組學提供環(huán)境總DNA信息，宏轉錄組學提供環(huán)境總RNA信息，宏蛋白質組學提供實時狀況下環(huán)境功能信息，代謝組學提供環(huán)境代謝產物的總體信息。將這些“組學”有效地結合起來并用于研究復雜的發(fā)酵食品體系中的微生物資源，可使人們從系統(tǒng)角度全面認識微生物群落與其功能，利用其規(guī)律、挖掘新的微生物菌種及其酶資源等，這將是未來微生物生態(tài)學研究的新趨勢。