載體介導(dǎo)的布魯菌外膜蛋白疫苗研制現(xiàn)狀

李文桂,陳雅棠

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 傳染病寄生蟲病研究所，重慶400016

布魯菌（Brucella）引起的布魯菌病是嚴(yán)重危害人畜健康的傳染性疾病，常引起感染家禽的流產(chǎn)或不孕，還能引起感染人群的波狀熱、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎或骨髓炎。常見的致病菌種為羊種馬耳他布魯菌（B.meliteasis）、牛種流產(chǎn)布魯菌（B.abortus）、豬種布魯菌（B.suis）、綿羊附睪種布魯菌（B.ovis）、犬種布魯菌（B.canis）和沙林鼠種布魯菌（B.neotomae）。布魯菌病常用滅活疫苗、減毒活疫苗、突變株疫苗、亞單位疫苗和DNA 疫苗等進(jìn)行免疫預(yù)防[1-4]。常見的滅活疫苗種類有牛種布魯菌45/20 株、19-B 株 和104M 株 以及 羊種H38 株等，這類疫苗接種劑量大，但誘導(dǎo)的保護(hù)力差。減毒活疫苗的種類有羊種Rev-1 株、M5 株和RB51 株，牛種S19 株以及豬種S2 株，它們均可誘導(dǎo)較好的保護(hù)力，但毒力不穩(wěn)，毒性較大，返祖現(xiàn)象嚴(yán)重，常對(duì)免疫的人和動(dòng)物造成傷害，且很難區(qū)分是自然感染或是人工接種免疫，從而干擾常規(guī)的血清學(xué)診斷?；蛲蛔冎暌呙绫M管可誘導(dǎo)較好的保護(hù)力，但存在毒力返強(qiáng)的可能性；亞單位疫苗的免疫劑量大，成本高，免疫效果不穩(wěn)定；DNA 疫苗在動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)量較低或出現(xiàn)基因沉默不表達(dá)的情況。因此，需要進(jìn)一步研制新型疫苗。外膜蛋白（outer membrane protein，OMP）是布魯菌的脂蛋白，與該菌的毒力密切相關(guān)。其中，OMP16 可作為一個(gè)新的細(xì)菌病原體相關(guān)分子模式，在TLR4-MyD88 信號(hào)傳導(dǎo)通路中具有重要作用，可激活細(xì)胞內(nèi)的樹突狀細(xì)胞，引起Th1 應(yīng)答，可作為佐劑使用；OMP22 屬于OMP25/OMP31家族，具有高度保守性，可分泌表達(dá)于細(xì)菌表面，是一種毒力因子，與布魯菌的侵襲和毒力有關(guān)，可引起Th1 免疫應(yīng)答；OMP25 的保守性較高，與布魯菌的毒力有關(guān)；OMP28 又稱Bp26，是一種由細(xì)胞內(nèi)向外釋放的可溶性周漿蛋白，具有較強(qiáng)的免疫原性；OMP31 是一種有效的免疫原。將這些外膜蛋白的DNA 疫苗或重組蛋白免疫小鼠均可有效對(duì)抗布魯菌有毒株的攻擊感染[5-14]，上述資料表明外膜蛋白可作為有前景的候選抗原分子。

人們發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門菌、卡介苗、根癌農(nóng)桿菌、大腸桿菌、畢赤酵母、禽流感病毒、山羊痘病毒和牛痘病毒等病原體的減毒株經(jīng)過改造可作為載體使用。本文簡(jiǎn)要綜述以細(xì)菌和病毒載體為傳遞載體的布魯菌OMP 疫苗的研制現(xiàn)狀。

1 以細(xì)菌為載體的布魯菌OMP 菌苗

1.1 鼠傷寒沙門菌作為載體

布魯菌細(xì)胞表面蛋白31（Brucellacell surface protein 31，BCSP31）是一種毒力因子，與該菌的胞內(nèi)生存和繁殖相關(guān)；脯氨酸消旋酶亞單位A（proline racemase subunit A，PrpA）具有較好的免疫原性；Cu/Zn 過氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）位于該菌的胞膜和胞質(zhì)中，可影響吞噬細(xì)胞對(duì)布魯菌的殺滅作用。將BCSP31、PrpA或SOD 的DNA 疫苗或重組蛋白質(zhì)肌肉注射C57BL/6 鼠，可產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答[15-18]。

Kim 等[19-20]以布魯菌544 株的基因組DNA 為模板擴(kuò)增BCSP31、OMP22、PrpA 和SOD 基因，分別插入pET28α，與pMMP65 重組得pMMP-BCSP31/OMP22/PrpA/SOD，分別電穿孔轉(zhuǎn)化鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimurium，St）JOL912 株，篩選陽(yáng)性重組菌；免疫印跡提示布病患者的血清可結(jié)合重組鼠傷寒沙門菌（rSt）疫苗表達(dá)31 kD 的CSP31、22 kD 的OMP22 和19 kD 的SOD 抗 原。他 們 將rSt-BCSP31、rSt-OMP22、rSt-SOD 和rSt-prpA 按體積比等量混合成為混合rSt 疫苗，口服接種BALB/c 鼠，接種后3 周發(fā)現(xiàn)血清IgG 上升，脾細(xì)胞釋放高水平TNF-α和IFN-γ等細(xì)胞因子，此時(shí)腹腔注射1×105CFU 布魯菌544 株進(jìn)行攻擊，攻擊后2 周免疫鼠脾的細(xì)菌負(fù)荷均下降至1/75 左右；然后將1.2×104、1.2×105和1.2×106CFU 混合rSt 疫苗腹腔注射BALB/c 鼠，接種后3 周發(fā)現(xiàn)血清IgG 上升，脾細(xì)胞分泌高水平TNF-α和IFN-γ，此時(shí)腹腔注射1×105CFU 流產(chǎn)布魯菌544 株進(jìn)行攻擊，攻擊后2周顯示免疫鼠脾的細(xì)菌負(fù)荷顯著下降，1.2×106CFU 疫苗組的效果最好。

Leya 等[21]將5×1010CFU 混合rSt 疫苗皮下注射10 月齡山羊，血清IgG 在接種后3～6 周上升，接種后6 周達(dá)較高水平，接種后6 周脾細(xì)胞增殖，釋放高水平IFN-γ，此時(shí)用5×108CFU 流產(chǎn)布魯菌544株進(jìn)行點(diǎn)眼攻擊，攻擊后8 周免疫羊肝、脾和肺的細(xì)菌負(fù)荷顯著降低。Lalsiamthara 等[22-23]將2×107CFU 混合rSt 疫苗采用口服、肌肉注射、皮下注射和腹腔注射分別接種BALB/c 鼠，接種后4 周腹腔注射2×105CFU 流產(chǎn)布魯菌544 株進(jìn)行攻擊，攻擊后15 d 提示4 個(gè)免疫組的脾細(xì)菌負(fù)荷均有降低，但以腹腔注射接種組的效果較好，隨后將1×108CFU 混合rSt 疫苗腹腔注射豚鼠，接種后30 d腹腔注射2×107CFU 流產(chǎn)布魯菌544 株進(jìn)行攻擊，攻擊后30 d 提示接種組的脾細(xì)菌負(fù)荷下降至1/100 左右。

1.2 卡介苗作為載體

人們發(fā)現(xiàn)卡介苗（bacille Calmette-Guerin，BCG）作為載體可以表達(dá)曼氏血吸蟲的副肌球蛋白和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶[24-25]。張亞麗等[26]以布魯菌 基 因組DNA 為模板，擴(kuò)增625 bp 的OMP25 基因，插入pMD18-T 得pMD18-OMP25，與pMV261-Ag85B 重組得pMV261-Ag85B-OMP25，采用電穿孔技術(shù)導(dǎo)入BCG，用卡那霉素進(jìn)行選擇，Western印跡提示重組BCG 疫苗表達(dá)的46 kD 的融合抗原可被布病患者的血清所結(jié)合。用腹腔注射途徑將1×106CFU 疫苗接種BALB/c 鼠，流氏細(xì)胞分選技術(shù)（FACS）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)外周血單核細(xì)胞CD4+和CD8+T 細(xì)胞在接種后10～50 d 升高，接種后20 d達(dá)較高水平。諸婷婷等[27]以類似方法構(gòu)建了重組BCG-Bp26 疫 苗，將1×106CFU疫苗皮下注射BALB/c 鼠，接種后30 d 經(jīng)FACS 證實(shí)外周血單核細(xì)胞（PBMC）CD4+和CD8+T 細(xì)胞數(shù)明顯增多。

1.3 根癌農(nóng)桿菌作為載體

植物細(xì)胞可以表達(dá)變形鏈球菌的表面蛋白，這為研制轉(zhuǎn)基因植物疫苗提供了可行性[28-29]。王晶妍等[30]以流產(chǎn)布魯菌16M 基因組DNA 為模板擴(kuò)增OMP31 基因，插入pJG045 得pJG045-OMP31，采用三親融合法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌AGL0 株，葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)染番茄子葉，常規(guī)選育轉(zhuǎn)基因植株，從轉(zhuǎn)基因番茄中抽提基因組DNA 作為模板，PCR 可克隆出755 bp 的OMP31 基因。OMP3148-74是一個(gè)免疫顯性表位，可單獨(dú)引起免疫反應(yīng)。趙亮等[31]將BLS-OMP3148-74基因插入pJG045 得pJG045-BLS-OMP3148-74，常規(guī)導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌AGL0 株，轉(zhuǎn)染紫花苜蓿的子葉，選育轉(zhuǎn)基因植株，從轉(zhuǎn)基因苜蓿中抽提基因組DNA 作為模板，PCR 可克隆出566 bp 的基因片段。廖露等[32]將BLS-OMP3148-74基因插入pJG045 得pJG045-BLS-OMP3148-74，常規(guī)導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌GV3101 株，轉(zhuǎn)染煙草子葉，選育轉(zhuǎn)基因植株，從轉(zhuǎn)基因煙草中抽提總RNA 作為模板，RT-PCR可克隆出534 bp 的BLS-OMP3148-74基因片段，但未報(bào)道免疫動(dòng)物的試驗(yàn)結(jié)果。

1.4 大腸桿菌作為載體

大腸桿菌是一種疫苗載體，可有效表達(dá)外源抗原[33-35]。Guilloteau 等[36]以流產(chǎn)布魯菌16M 基因組的DNA 為模板擴(kuò)增OMP31 基因，插入PCRⅡ得pNV3118，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109 株，常規(guī)抗生素篩選，Western 印跡提示重組菌表達(dá)的31 kD 的OMP31 抗原可被布病患者的血清所結(jié)合。用腹腔注射途徑將1×108CFU 疫苗接種BALB/c 鼠，在第1 次接種后5 周進(jìn)行加強(qiáng)，ELISA 提示免疫鼠的血清IgG 水平在第1 次免疫后2～8 周升高，免疫后8 周有明顯上升；脾細(xì)胞在第1 次免疫后3～6 周明顯增殖，免疫后4 周有明顯提升。在第1 次免疫后9 周腹腔注射1×104CFU 布魯菌H38S 株進(jìn)行攻擊，攻擊后2 周免疫組的脾細(xì)菌負(fù)荷無(wú)明顯減少。Gupta 等[37]以布魯菌16M 株的DNA 為模板分別擴(kuò)增OMP31、OMP16、Bp26 基因，插入pDEST17得pDEST-OMP31/OMP16/Bp26，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21-AI 株，常規(guī)抗生素篩選，Western 印跡提示重組菌表達(dá)的31、16、26 kD 的相應(yīng)蛋白可被布病患者的血清所結(jié)合。用腹腔注射途徑將2×107CFU 疫苗接種BALB/c 鼠，第1 次免疫后2 周加強(qiáng)1 次，在第1 次免疫后4 周免疫鼠的血清IgG 和IgG1 水平上升，脾細(xì)胞明顯增殖，脾細(xì)胞CTL 活性顯著增強(qiáng)，此時(shí)腹腔注射2×104CFU 布魯菌16M株進(jìn)行攻擊，攻擊后3 周免疫鼠脾的細(xì)菌負(fù)荷下降至1/100 左右。

1.5 酵母作為載體

楊春華等[38]以布魯菌S2 株的DNA 為模板擴(kuò)增471 bp 的OMP25 基 因，插入pGEM-T 得pGEMOMP25，與pPIC9K 重組得pPIC9K-OMP25，將其電穿孔轉(zhuǎn)化畢赤酵母，篩選陽(yáng)性菌株，免疫印跡提示布病患者的血清結(jié)合重組酵母表達(dá)的25 kD 的OMP25 蛋白。王勇等[39]以布魯菌S19 株的DNA 為模板擴(kuò)增650 bp 的OMP25 基因，插 入pGM-T 得pGM-OMP25，與pGBKT7-Lam重組得pGBKT7-OMP25，用電穿孔技術(shù)導(dǎo)入釀酒酵母Y187 株，常規(guī)選育重組酵母，從重組酵母中抽提基因組DNA作為模板，用PCR 方法可克隆出650 bp 的OMP25基因，保護(hù)力試驗(yàn)正在進(jìn)行中。

2 以病毒為載體的布魯菌OMP 疫苗

2.1 禽流感病毒作為載體

禽流感病毒的基因組含有大量非必需區(qū)，刪除后基本不影響病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，可以作為載體使用[40]。L7/L12 蛋白是布魯菌的核糖體蛋白，參與該菌的胞內(nèi)蛋白合成，將L7/L12 重組蛋白或其脂質(zhì)體接種BALB/c 鼠可有效對(duì)抗布魯菌544株的攻擊感染[41-42]。Tabynov 等[43-45]將布魯菌OMP16 和L7/L12 基因分別插入禽流感病毒H5N1和H1N1 株的非結(jié)構(gòu)蛋白1（nonstructural protein 1，NS1）的開放讀框后轉(zhuǎn)染Vero 細(xì)胞，篩選重組病毒Flu-NS11-24-OMP16-H5N1、Flu-NS11-24-L7/L12-H5N1、Flu-NS11-24-OMP16-H1N1 和Flu-NS11-24-L7/L12-H1N1，然 后 將Flu-NS11-24-OMP16-H5N1 和Flu-NS11-24-L7/L12-H5N1 混合為重組H5N1 病毒，將Flu-NS11-24-OMP16-H1N1 和Flu-NS11-24-L7/L12-H1N1 混合為重組H1N1 病毒。接著，將106EID50混合重組H5N1 病毒采用滴鼻、點(diǎn)眼和皮下注射分別接種豚鼠，初次接種后28 d 用106EID50混合重組H1N1 病毒進(jìn)行加強(qiáng)，初次接種后60 d用5×108CFU 布魯菌544 株皮下注射進(jìn)行攻擊，攻擊后30 d 發(fā)現(xiàn)滴鼻組、點(diǎn)眼組和皮下注射組的脾細(xì)菌負(fù)荷分別下降至1/1000、1/10 000 和1/100 左右，提示點(diǎn)眼接種是較好的免疫途徑。隨后，將108EID50混合重組H5N1 病毒采用點(diǎn)眼和皮下注射分別免疫懷孕的小母牛，初次接種后28 d 用108EID50混合重組H1N1 病毒進(jìn)行相應(yīng)加強(qiáng)，初次接種后60 d 腹腔注射5×108CFU 布魯菌544 株進(jìn)行攻擊，攻擊后30 d 發(fā)現(xiàn)皮下注射組脾的細(xì)菌負(fù)荷顯著低于點(diǎn)眼組，阻止流產(chǎn)率為80%（8/10）。最后，將108.5EID50混合重組H5N1 病毒點(diǎn)眼免疫小牛，初次接種后28 d 用108.5EID50混合重組H1N1 病毒進(jìn)行加強(qiáng)，初次接種后56 d 血清IgG、IgG1 和IgG2a 上升，淋巴結(jié)細(xì)胞分泌高水平IFN-γ，F(xiàn)ACS 提示淋巴結(jié)內(nèi)CD4+和CD8+T 細(xì)胞數(shù)顯著增加；初次接種后60 d 用5×108CFU 布魯菌544株皮下注射進(jìn)行攻擊，攻擊后30 d 免疫牛淋巴結(jié)的細(xì)菌負(fù)荷下降至1/1000 左右。

2.2 山羊痘病毒作為載體

山羊痘病毒的宿主范圍窄，不感染人類，是一種理想的疫苗載體，已成功表達(dá)牛瘟病毒的血凝素[46]。魏鳳等[47]以布魯菌DNA 為模板擴(kuò)增OMP25 基因，插入pGM-TK-GPT1 得pGM-OMP25，將重組質(zhì)粒加入山羊痘病毒的基因組共同轉(zhuǎn)染綿羊成纖維細(xì)胞，篩選重組病毒，從重組病毒中抽提基因組DNA 作為模板，用PCR 方法可克隆出642 bp 的OMP25 基因，但未報(bào)道保護(hù)力的結(jié)果。

2.3 牛痘病毒作為載體

Tine 等[48]報(bào)道牛痘病毒的MVA 減毒株可表達(dá)惡性瘧原蟲的PfCSP、PfSSP2、PfMSP1 和PfS25 等，可作為一種有用的載體。Vemulapalli 等[49]以布魯菌S19 株的DNA 為模板擴(kuò)增OMP18 基因，插入pMCOZ 得pMCOZ-OMP18，將重組質(zhì)粒加入牛痘病毒的WR 株后共同轉(zhuǎn)染Vero 細(xì)胞，篩選重組病毒，免疫印跡提示布病患者的血清結(jié)合重組病毒表達(dá)的18 kD 的OMP18 蛋白。

3 結(jié)語(yǔ)

以細(xì)菌和病毒作為載體的布魯菌OMP 菌苗接種小鼠可有效對(duì)抗該菌有毒株的攻擊，但報(bào)道的保護(hù)力水平差強(qiáng)人意，需要進(jìn)一步的研究。隨著對(duì)布魯菌組學(xué)研究的深入以及表觀遺傳學(xué)的探索，人們必將弄清布魯菌外膜抗原結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，從而在候選基因或編碼該基因的相關(guān)表位選擇上占據(jù)有利位置；現(xiàn)有的表達(dá)載體存在不足，這就需要摸索新的表達(dá)途徑；混合基因疫苗或多表位疫苗的研制還不理想；尚未解決疫苗的轉(zhuǎn)化效率低、免疫原性不足和MHC 限制性等諸多問題；疫苗的生產(chǎn)工藝和質(zhì)量控制還未進(jìn)行規(guī)范；能否引入納米微粒技術(shù)研制布魯菌疫苗，從而延長(zhǎng)免疫應(yīng)答的時(shí)間，誘導(dǎo)記憶性T 細(xì)胞的產(chǎn)生。深入思考這些問題，有助于細(xì)菌和病毒作為載體的布魯菌OMP 菌苗的研制，從而為布魯菌的免疫預(yù)防提供新途徑。