空氣等離子體技術(shù)對面包酵母的誘變選育研究

(石家莊學(xué)院化工學(xué)院,河北石家莊 050035)

面包酵母即釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是人類掌握并利用的較早的微生物,幾千年前人類就使用面包酵母來制作主食,現(xiàn)代食品工業(yè)中也被廣泛使用[1]。好的面包酵母應(yīng)具備較高的糖酵解效率和麥芽糖發(fā)酵利用率、快速的底物適應(yīng)性和繁殖能力、適宜的水解能力、較強的耐受性等特點[2-4]。目前,由于冷凍面團的開發(fā)和利用,對于面包酵母的低溫適應(yīng)性能等又有了更高的要求。

空氣等離子體是低溫等離子體的一種,屬于活化放電激發(fā)形成等離子體,其發(fā)生裝置簡單,易于操作[5]。近幾年,有關(guān)等離子體技術(shù)應(yīng)用于微生物育種改良的研究已取得了較大的進展。如李小坤等[6]利用常壓室溫等離子體技術(shù)進行誘變育種,在處理時間為55 s的情況下,篩選出一株高RNA含量的釀酒酵母,并對其培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化。曹綱等[7]利用等離子體誘變技術(shù)處理乳酸克魯維酵母,得到了一株對苯乙酮轉(zhuǎn)化率高達91.8%的菌株。目前,空氣等離子體技術(shù)在面包酵母上的應(yīng)用未見報道。

本文擬使用空氣等離子體技術(shù)對面包酵母進行誘變育種工作,以期得到高發(fā)酵力、高抗葡萄糖阻遏能力和高耐低溫能力的,具有良好傳代穩(wěn)定性的優(yōu)良菌株,同時為空氣等離子體技術(shù)在面包酵母菌種選育中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

面包酵母BY-1、BY-2、BY-3、BY-4、BY-5 實驗室保藏;面包酵母BY-6 分離自安琪干酵母;麥芽糖標準品(94.3%)、葡萄糖標準品(98%) 中國食品藥品檢定研究院;小麥粉 包頭宏基面粉有限公司;酵母膏、蛋白胨、瓊脂粉 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;乙腈(色譜純) 美國Fisher試劑公司。

Agilent 1200series高效液相色譜儀(配備Agilent-380-ELSD蒸發(fā)光檢測器) 美國安捷倫公司;電火花發(fā)射及檢測器 三魚電氣設(shè)備有限公司;HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞爾電器有限公司;3K15高速冷凍離心機 美國Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備

1.2.1.1 YPD培養(yǎng)基的制備 分別稱取質(zhì)量分數(shù)為1%的酵母膏,2%的蛋白胨,2%的葡萄糖,在121 ℃下滅菌20 min(固體培養(yǎng)基需另加入2%瓊脂)。

1.2.1.2 液體發(fā)酵培養(yǎng)基(Liquid Fermentation,LF)的制備 向高純水中分別加入質(zhì)量分數(shù)為1%的葡萄糖、3%的蔗糖、3%的麥芽糖、0.25%的(NH)2SO4、0.50%的尿素、1.6%的KH2PO4、0.50%的Na2HPO4·12H2O、0.06%的MgSO4、0.0225‰的煙酸、0.005‰的泛酸、0.0025‰的VB1、0.00125‰的VB6、0.001‰的VB2、0.0005‰的葉酸,混勻,滅菌后備用[8]。

1.2.1.3 麥芽糖模擬面團培養(yǎng)基的制備 糖類只添加質(zhì)量分數(shù)為3.8%的麥芽糖,其它同1.2.1.2[9]。

1.2.1.4 混合糖模擬面團培養(yǎng)基的制備 糖類只添加質(zhì)量分數(shù)為3.325%的麥芽糖和0.5%的葡萄糖,其它同1.2.1.2[9]。

1.2.2 酵母菌的活化 用接種環(huán)挑取酵母斜面保存菌種一環(huán),接入YPD培養(yǎng)基中,于恒溫搖床上30 ℃,150 r/min培養(yǎng)20 h。3000 r/min離心10 min,將菌體使用無菌水清洗2次,接種于固體培養(yǎng)基,備用[10]。

1.2.3 發(fā)酵力的測定 本研究采用失重法[11-12]測定菌種的發(fā)酵力(F),用量筒量取50 mL LF培養(yǎng)基,加入1.0 g活化后的酵母,將錐形瓶置于30 ℃恒溫搖床上,150 r/min培養(yǎng)3 h,每30 min記錄質(zhì)量,用重量的變化來表示酵母發(fā)酵力大小,見公式(1):

式(1)

式中:F為菌種的發(fā)酵力,mg/(h·g);X前為發(fā)酵前錐形瓶的重量,mg;X后為發(fā)酵后錐形瓶的重量,mg;T為發(fā)酵時間,h;m為添加酵母的重量,g。

1.2.4 初始菌種的選擇 取面包酵母BY-1、BY-2、BY-3、BY-4、BY-5、BY-6,采用失重法測定其發(fā)酵力的大小,擇優(yōu)選擇初始菌種。

1.2.5 空氣等離子體對初始菌種的誘變 把等離子體裝置放置于超凈臺中,取滅菌后的5枚小鐵片分別標號為0、1、2、3、4、5置于5個平板中。用移液槍分別移取1.2.4所挑選的初始酵母菌液10 μL于小鐵片上,使小鐵片距電火花發(fā)射端約1 cm,開啟設(shè)備,分別作用0、5、10、15、20、25 s,將作用后的鐵片放入盛有適量無菌生理鹽水的離心管中,震蕩洗脫菌液,將洗脫后的菌液進行適當稀釋,并進行平板涂布,30 ℃培養(yǎng)20 h,計算致死率。

從每批處理后的菌株中隨機挑取50株菌株進行斜面保藏,同時測定其發(fā)酵力,以發(fā)酵力高于初始菌株發(fā)酵力的5%以上為正突變,計算正突變率。

1.2.6 高發(fā)酵力菌種篩選及傳代穩(wěn)定性的測定 測定篩選得到的正突變菌株發(fā)酵力，從而得到高發(fā)酵力菌株；選取篩選得到的發(fā)酵力較高的面包酵母菌株在菌種斜面培養(yǎng)基上進行傳代,取1、3、6、9、15代的菌株進行發(fā)酵力的測定。

1.2.7 蔗糖酶活力的測定 為了保持細胞的通透性及活性,在高糖環(huán)境中面包酵母應(yīng)具備較低的蔗糖酶活力[13-14]。

1.2.7.1 葡萄糖標準曲線的制作 取6支干燥潔凈的試管,分別加入0.01 mol/L的葡萄糖標準液0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mL,加水至2 mL,混勻后加入DNS顯色液2 mL,然后置入沸水浴中加熱5 min,冷卻后加水至20 mL,以未加入葡萄糖標準液的試管為空白,在540 nm處測定吸光度值并繪制標準曲線。

1.2.7.2 酵母干物質(zhì)含量的測定 準確稱取1.0 g待測酵母于電熱干燥箱中,95 ℃干燥4 h,然后置于干燥器中冷卻,稱重,并根據(jù)公式(2)計算干物質(zhì)含量。

式(2)

式中:m1為未烘干前的鮮酵母質(zhì)量,g;m2為烘干后干物質(zhì)的質(zhì)量,g。

1.2.7.3 蔗糖酶活力的測定 取潔凈試管加入0.1 mol/L的蔗糖溶液1.0 mL,NaAc-HAc緩沖液(pH=5.2)2.0 mL,水6.5 mL,混勻后于30 ℃水浴中平衡5 min,加入0.5 mL已知濃度的酵母液,迅速混勻后繼續(xù)在30 ℃下恒溫5 min,取1 mL反應(yīng)液于先加入2 mL DNS溶液的試管中,沸水浴5 min,冷卻后測定吸光度值[9],并根據(jù)標準曲線求得葡萄糖含量。見公式(3)

式(3)

式中:蔗糖酶活力為在30 ℃,pH為5.2的條件下,每分鐘每g酵母干物質(zhì)分解蔗糖產(chǎn)生1 mg葡萄糖為一個活力單位,U;A為根據(jù)標準曲線方程求得的葡萄糖含量,μmol;0.180為1 μmol葡萄糖的摩爾質(zhì)量,mg;5為顯色反應(yīng)時間,min;0.5為加入的酵母液的體積,mL;c為酵母液濃度,g/mL。

1.2.8 葡萄糖阻遏能力的測定 酵母對面團的發(fā)酵作用存在葡萄糖阻遏效應(yīng)[15-16],優(yōu)良的面包酵母應(yīng)具備較低的葡萄糖阻遏,這樣才能縮短發(fā)酵過程的延滯期,提升酵母的發(fā)酵能力。

1.2.8.1 液相色譜檢測條件 色譜柱:Carbohydrate柱(4.6×150 mm,5 μm);柱溫:30 ℃;流動相:乙腈∶水=75∶25;流速:0.7 mL/min;進樣量:3.0 μL;ELSD氣化室溫度:80 ℃;氣體壓力:3.5 bar。

1.2.8.2 待測溶液的處理與測定 稱取1.0 g酵母,在超凈臺中操作分別接入100 mL麥芽糖模擬面團培養(yǎng)基和混合糖模擬面團培養(yǎng)基中,置于30 ℃培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵3 h,每隔30 min按照1.2.8.1中的方法進行測定,繪制耗糖曲線[9],并根據(jù)公式(4)計算葡萄糖阻遏能力。

式(4)

式中:發(fā)酵結(jié)束時混合糖發(fā)酵液中總糖糖耗為u1;麥芽糖發(fā)酵液中糖耗為u2。

1.2.9 菌種耐冷凍性的測定 冷凍面團技術(shù)是一種極為方便的食品工業(yè)技術(shù),而面包酵母對低溫的耐受性直接決定了冷凍面團的質(zhì)量[17-19]。對高發(fā)酵力的誘變菌株進行耐冷凍性能測定,測定方法如下:

取1.0 g酵母加入50 mL LP培養(yǎng)基中,30 ℃下保溫30 min,測定未冷凍酵母發(fā)酵力。取1.0 g酵母加入50 mL LP培養(yǎng)基中,-20 ℃冰箱中冷凍兩周,解凍至30 ℃后測定菌株冷凍發(fā)酵力。取新鮮酵母泥于-20 ℃冰箱中冷凍兩周,解凍至30 ℃后,測定酵母泥冷凍發(fā)酵力。

相對發(fā)酵力(%)=冷凍后發(fā)酵力×100/冷凍前發(fā)酵力

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗進行3個平行樣,每個平行實驗測定3次取其平均值,結(jié)果用“平均值±標準差表示”。數(shù)據(jù)差異顯著性采用SPSS 18.0軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 初始菌株的確定

對不同來源的6株菌種進行發(fā)酵力測定實驗,并采用失重法測定其發(fā)酵力數(shù)值,實驗結(jié)果見圖1。由實驗結(jié)果可知,在6株酵母菌種中,BY-3的發(fā)酵力達到(140.906±0.539) mg/(h·g),均高于其它5株酵母菌種,因此選擇BY-3為初始菌株,進行空氣等離子體誘變。

圖1 不同菌株的發(fā)酵力測定Fig.1 Fermentation ability of different strains注:圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2、圖3、圖5、圖7、圖8同。

2.2 空氣等離子體對面包酵母菌株的篩選

2.2.1 作用時間對致死率影響 如圖2所示,在空氣等離子體的作用下,隨著作用時間增加,細胞致死率明顯升高,作用10 s時其致死率達到61.807%±0.881%,作用25 s時,致死率為100%。因此下文正突變率選擇作用時間為5～20 s。

圖2 作用時間和致死率的關(guān)系Fig.2 Relationship of treatment time and lethality rate

2.2.2 作用時間與正突變率的關(guān)系 結(jié)果如圖3所示,正突變菌種多出現(xiàn)在作用10 s時,該點正突變率達到22.000%±0.592%。因此,選擇10 s為最佳的作用時間。

圖3 作用時間和正突變率的關(guān)系Fig.3 Relationship of treatment time and positive mutation rate

2.2.3 高發(fā)酵力菌株的獲得 以酵母菌BY-3為出發(fā)菌株,在10 s下反復(fù)誘變[20],得到正突變菌株22株,并測其發(fā)酵力，結(jié)果如圖4所示,以改良菌株3G-10和3G-28的發(fā)酵力提高最為顯著(P<0.05),其中3G-28的發(fā)酵力達到209.347 mg/(h·g),較初始菌株BY-3的140.906 mg/(h·g)高出了48.57%。

圖4 正突變菌株發(fā)酵力對比Fig.4 Fermentation ability of positive mutation strains

2.2.4 傳代穩(wěn)定性測定 將BY-3和篩選得到的3G-10和3G-28進行傳代穩(wěn)定性測試對比,測定結(jié)果如圖5所示,在傳代過程中發(fā)現(xiàn),3株菌種的發(fā)酵力均出現(xiàn)波動,相比較其它兩株菌種,3G-28的發(fā)酵力浮動較平穩(wěn),發(fā)酵力衰退較慢,傳代15次,其發(fā)酵力仍可保持87.5%?？梢?菌種3G-28在傳代穩(wěn)定性方面表現(xiàn)優(yōu)異。

圖5 不同傳代次數(shù)下菌株的發(fā)酵力Fig.5 Fermenting power of different strains at different passage number

2.3 蔗糖酶活力的測定

2.3.1 標準曲線的繪制 在540 nm下所測定的葡萄糖標準曲線如圖6所示,標準方程為y=0.1023x+0.0409,R2=0.9992,線性關(guān)系良好。

圖6 葡萄糖標準曲線Fig.6 Standard curve of glucose

表1 菌株BY-3和3G-28在混合糖液體培養(yǎng)基中的麥芽糖耗糖結(jié)果Table 1 Maltose consumption curve of BY-3 and 3G-28 in liquid medium of mixed sugar

注:同列間不同的字母表示差異顯著(P<0.05);表2～表3同。

表2 BY-3和3G-28菌株在混合糖液體培養(yǎng)基中的葡萄糖糖耗糖結(jié)果Table 2 Glucose consumption curve of BY-3 and 3G-28 in liquid medium of mixed sugar

表3 BY-3和3G-28菌株在麥芽糖液體培養(yǎng)基中的耗糖結(jié)果Table 3 Consumption curve of BY-3 and 3G-28 in liquid medium of maltose

2.3.2 蔗糖酶活力測定結(jié)果 蔗糖酶酶活是影響高糖面團中酵母發(fā)酵力的主要因素,對誘變得到的高發(fā)酵力菌株3G-28及原始菌株BY-3進行蔗糖酶活力測定,結(jié)果如圖7所示,3G-28的蔗糖酶活力為10.944 U/g酵母干物質(zhì),較對照株BY-3降低了71.89%。說明與出發(fā)菌株相比,經(jīng)誘變后的菌株3G-28具有更好的耐高糖性能。

圖7 不同菌株的蔗糖酶活力Fig.7 Invertase activity of different strains

2.4 葡萄糖阻遏能力的測定

2.4.1 菌株在混合糖模擬面團液體培養(yǎng)基中的耗糖曲線 菌株BY-3和3G-28在混合糖模擬面團液體培養(yǎng)基中3 h內(nèi)的耗糖實驗結(jié)果如表1、表2所示,菌株3G-28與BY-3對混合糖液中麥芽糖的消耗量存在顯著性差異(P<0.05),而對葡萄糖的消耗沒有顯著性差異,造成該現(xiàn)象的原因可能是葡萄糖總量含量較低,但發(fā)酵結(jié)束時,菌株3G-28對麥芽糖和葡萄糖的消耗速率均高于菌株BY-3。

2.4.2 菌株在單獨糖模擬面團液體培養(yǎng)基中的耗糖曲線 由表3可知,在發(fā)酵1 h內(nèi)，菌株3G-28與BY-3對于麥芽糖的消耗量存在顯著性差異(P<0.05),當發(fā)酵結(jié)束時,二者糖耗趨于一致,但3 h總耗糖量較混合糖液培養(yǎng)基明顯增加,其原因可能是存在葡萄糖阻遏現(xiàn)象。

2.4.3 菌株的葡萄糖阻遏現(xiàn)象對比 BY-3和3G-28的葡萄糖阻遏能力對比如圖8所示,篩選菌株3G-28與初始菌株BY-3相比，抗葡萄糖阻遏現(xiàn)象的能力有明顯增加,提高了34.84%。

圖8 BY-3和3G-28菌株的葡萄糖阻遏程度Fig.8 Glucose repression of BY-3 and 3G-28

2.5 菌株耐冷凍性的測定

測定結(jié)果如表4所示。從表中可以看出,無論是直接冷凍酵母泥還是冷凍發(fā)酵液，3G-28的相對發(fā)酵力均高于BY-3。可見3G-28具有較好的耐低溫性能。

表4 BY-3和3G-28菌株的相對發(fā)酵力Table 4 Relative fermenting power of BY-3 and 3G-28

3 結(jié)論

本文將空氣等離子體技術(shù)應(yīng)用于面包酵母菌種選育工作中,以酵母菌BY-3為初始菌株,經(jīng)過誘變得到高發(fā)酵力菌株3G-28,該菌傳代穩(wěn)定性良好,其發(fā)酵力較初始菌株BY-3提高了48.57%。對該菌株的性能進行測定,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過空氣等離子體誘變后,3G-28菌株在高糖面團和無糖面團中均能保持較高的酵母活力,其蔗糖酶活力較初始菌株BY-3降低了71.89%;抗葡萄糖阻遏現(xiàn)象的能力提高了34.84%。除此之外,3G-28菌株在低溫耐受性方面優(yōu)于初始菌株BY-3:在-20 ℃低溫下進行保藏,兩周后,其菌株的相對發(fā)酵力可達到76.10%,酵母泥的相對發(fā)酵力為83.91%。本實驗為面包酵母的菌種選育提供了一定依據(jù),但突變株3G-28性能提高的機理尚不清楚,有待研究。