牛磺酸提取及檢測方法的研究進(jìn)展

謝昭鵬,姚昱錕,劉斌雄,陳小藝,方 婷

(福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,福建福州 350002)

?；撬?Taurine)是一種含硫的β-氨基酸,其化學(xué)名稱為2-氨基甲烷磺酸(NH2CH2CH2SO3H),于1872年因最先從牛膽汁中發(fā)現(xiàn)而得名。?；撬岵粎⑴c蛋白質(zhì)的生物合成,其化學(xué)結(jié)構(gòu)中不含羧酸部分,而是由一個磺酸基取代,以自由狀態(tài)遍及生物體內(nèi)的各類組織、器官[1-3]。研究發(fā)現(xiàn),?；撬崾蔷S持生物體機(jī)體正常生理活動的重要活性物質(zhì),它可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能,包括抗氧化、滲透調(diào)節(jié)、神經(jīng)調(diào)節(jié)、抗炎癥以及保持細(xì)胞的穩(wěn)定性[4-5]。?；撬岜徽J(rèn)為是治療慢性炎癥和感染的潛在藥物,因?yàn)樗鼘π难芟到y(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和消化系統(tǒng)有一定的保護(hù)和治療作用[6-7]。

人體除通過膳食攝入?；撬嵬?還可自身生物合成,主要途徑是蛋氨酸和半胱氨酸代謝的中間產(chǎn)物半胱亞磺酸經(jīng)半胱亞磺酸脫羧酶(CSAD)脫羧成亞牛磺酸,再經(jīng)氧化成?；撬?。人類CSAD的活性較其他哺乳動物低,可能自身?；撬岬暮铣赡芰σ草^弱[8]。?；撬嵩趧游镏械暮窟h(yuǎn)高于大部分的植物,其中海洋生物是牛磺酸的天然寶庫,特別是貝類、螺類等軟體動物,其牛磺酸含量十分豐富[9]。

本文簡要概述了?；撬岬纳锘钚怨δ芗捌湓诤Ｑ笊镏械姆植记闆r,對現(xiàn)有的天然?；撬岬奶崛z測技術(shù)進(jìn)行介紹分析,為未來天然牛磺酸的研究方向及其提取、檢測技術(shù)的研究開發(fā)提供了一些新思路。

1 ?；撬岬纳锘钚怨δ?/h2>

1.1 牛磺酸對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響

?；撬崾谴嬖谟谥袠猩窠?jīng)系統(tǒng)中最豐富的一種游離氨基酸,在大腦發(fā)育過程中有神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)保護(hù)因子的作用[3]。牛磺酸缺乏會導(dǎo)致大腦發(fā)育受阻,智力低下。早產(chǎn)兒腦中的牛磺酸含量明顯低于足月兒,生長受限胎兒在產(chǎn)前補(bǔ)充?；撬崮軌蝻@著促進(jìn)其腦發(fā)育、白質(zhì)纖維發(fā)育及髓鞘化[10-12]。歐美等一些發(fā)達(dá)國家早已經(jīng)明確規(guī)定,嬰幼兒食品(如奶粉等)中必須添加?；撬?。研究表明,適當(dāng)補(bǔ)充牛磺酸可以提高學(xué)習(xí)記憶速度及準(zhǔn)確性,并且有效延緩神經(jīng)系統(tǒng)的衰老程度[13-14]。

1.2 ?；撬釋σ曈X系統(tǒng)的保護(hù)作用

?；撬峒s占視網(wǎng)膜中氨基酸總量的一半,促進(jìn)光感受器營養(yǎng)發(fā)育,在防止神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)凋亡,減少青光眼的視神經(jīng)傷害的同時,有促進(jìn)視神經(jīng)再生的功能[15-16]。?；撬崾蔷铙w內(nèi)重要的非酶系統(tǒng)抗氧化劑,有調(diào)節(jié)晶體滲透壓和抗氧化等功能,保護(hù)晶狀體免受氧化損傷,晶狀體透明性受兔晶狀體上皮細(xì)胞影響,?；撬峥梢种破涞蛲?延緩白內(nèi)障疾病的發(fā)生[17-18]。此外,?；撬徇€可以提高角膜的修復(fù)能力。

1.3 牛磺酸對肝膽系統(tǒng)的作用

在肝臟中,膽固醇轉(zhuǎn)化成膽汁酸,?；撬崮芎湍懼峤Y(jié)合生成牛黃膽酸,?；悄懰崮艽龠M(jìn)脂質(zhì)和膽固醇溶解,利于膽汁循環(huán),有益于人體對脂類的吸收,抑制膽固醇結(jié)石的形成[19]。?；撬峥梢员Ｗo(hù)肝細(xì)胞膜,降低膜通透性,減少谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)的釋放,當(dāng)肝臟發(fā)炎或者受到機(jī)械損傷時,天然?；撬崮茱@著抑制肝星狀細(xì)胞(HSC)增殖,能夠治療肝纖維化[20-22]。研究發(fā)現(xiàn),?；撬峥杉涌臁耙掖?乙醛→乙酸”的代謝反應(yīng)的進(jìn)行,提高機(jī)體抗氧化和清除氧自由基能力,以此治療酒精所造成的肝損傷[23]。此外,牛磺酸能治療因攝入神經(jīng)毒素-鋁而造成的小鼠肝毒性[24]。

1.4 ?；撬釋π难芟到y(tǒng)的作用

哺乳動物的心肌中總游離氨基酸總量的一半是?；撬醄3],心血管系統(tǒng)中的?；撬嶙饔冒悬c(diǎn)多而廣,因此其作用機(jī)制復(fù)雜,外源性攝入補(bǔ)充?；撬?能夠治療多種心血管疾病[25-26]。?；撬崮鼙Ｗo(hù)血管內(nèi)皮,改善其功能障礙,如通過與高同型半胱氨酸(Hcy)競爭結(jié)合受體/載體,抑制其對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(EC)造成的損傷[27],此外能顯著抑制血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)的增殖和鈣化,有效預(yù)防高血壓、延緩動脈硬化的發(fā)生[28]。

1.5 ?；撬釋?nèi)分泌系統(tǒng)的影響

1.5.1 防治糖尿病 胰島β細(xì)胞功能紊亂是引起糖尿病的主要原因之一,患糖尿病的機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激增強(qiáng),而胰島β細(xì)胞的抗氧化能力相對較弱,容易受到影響,減少胰島素釋放[29-30]。研究發(fā)現(xiàn),胰島β細(xì)胞中存在?；撬嵘锖铣申P(guān)鍵酶—半胱亞磺酸脫羧酶(CSD)表達(dá),牛磺酸作為抗氧化劑,通過降低氧化應(yīng)激反應(yīng),保護(hù)胰島β細(xì)胞,促進(jìn)胰島素的釋放,以此達(dá)到降血糖的作用[31-32]。牛磺酸對糖尿病患者的肝毒性、血管問題和心臟損傷有較好的治療作用,能夠減輕糖尿病及其并發(fā)癥的癥狀[33]。

1.5.2 維持正常生殖功能 動物的乳腺及雄性生殖器官也存在半胱亞磺酸脫羧酶(CSD)表達(dá),可生物合成牛磺酸,研究發(fā)現(xiàn)?；撬崮軌蛞种撇G丸組織細(xì)胞凋亡,保護(hù)生殖細(xì)胞免受損害,維持睪丸正常的結(jié)構(gòu)和功能,增強(qiáng)性能力[23-34]。此外,?；撬嵬ㄟ^抗氧化能力使精子免受氧化損害,提高其生存能力[35]。

1.6 其他作用

杜氏肌營養(yǎng)不良(DMD)是一種無法治愈的衰弱性肌肉萎縮性疾病,抗氧化劑可以輔助治療該病癥,將?；撬嶙鳛樯攀逞a(bǔ)充劑,可以有效改善癥狀的嚴(yán)重性,且成本較低、無副作用[36]。牛磺酸作為重要氨基酸,在腸道內(nèi)可以抑制有害細(xì)菌的生長,加速短鏈脂肪酸的產(chǎn)生,降低脂多糖的濃度,調(diào)節(jié)腸道微生態(tài),有利于腸道微生物代謝[37]。運(yùn)動前補(bǔ)充牛磺酸,可以顯著提高大鼠的運(yùn)動機(jī)能,有利于延緩消除運(yùn)動后產(chǎn)生的疲勞,可作為一種營養(yǎng)補(bǔ)充劑應(yīng)用于運(yùn)動訓(xùn)練[38]。

2 ?；撬嵩诤Ｑ笊镏械姆植?/h2>

2.1 貝類、螺類

海洋生物中的?；撬岫家杂坞x形式存在,其中,貝類、螺類是?；撬岣患孔疃嗟姆N類。表1列出了多種貝類、螺類海洋生物的?；撬岷?其中馬氏珠母貝中牛磺酸含量高達(dá)1383 mg/100 g[39],在海瓜子、芝麻螺中的牛磺酸含量也不低于1000 mg/100 g[9],此外,蟶子、貽貝等其他貝螺類中也含有一定量的?；撬醄9,40-43]。

表1 不同的貝類、螺類海洋生物中牛磺酸的含量Table 1 Contents of taurine in different shellfish and snails

2.2 魚類

魚類、貝類、螺類三種海洋生物相比較,魚類中?；撬岷肯鄬ζ?但魚類不同部位牛磺酸的含量有所不同。表2[9，44-45]列舉了一些常見魚類的不同部位牛磺酸含量,從中可以看出,大部分魚類的魚肉?；撬岷勘绕渌课桓?如大黃魚,魚肉中?；撬岷繛?80 mg/100 g,而鰓中含量僅有魚肉的1/6,此外,?；撬嵩诓煌~類的內(nèi)臟組織中的分布存在較大差異,如美國紅魚、阿拉斯加綠鱘中腸、肝、鰓等內(nèi)臟的牛磺酸含量差異不大,而海鱸魚、金槍魚、鮐魚等的心臟、腸、肝、鰓4種內(nèi)臟中,心臟中牛磺酸的含量普遍比其他臟器高,鰓的含量最少。

表2 不同魚類的不同部位中?；撬岬暮?mg/100 g)Table 2 Contents of taurine in different parts of different fish(mg/100 g)

2.3 其他種類

?；撬嵩诩讱ゎ惡Ｑ笊镏幸灿幸欢ǖ暮?據(jù)文獻(xiàn)報道,日本對蝦、雪蟹中?；撬岷糠謩e為199、450 mg/100 g[44]。此外,從海產(chǎn)品的加工副產(chǎn)物中提取?；撬嵋惨恢笔切袠I(yè)的研究熱點(diǎn),石珠成等[46]從珍珠副產(chǎn)物中獲得純度為97.3%的天然牛磺酸;郭正昭[47]從章魚內(nèi)臟中提取得到?；撬岷繛?37 mg/100 g;章騫等[48]的研究表明1 kg的鮑魚內(nèi)臟至少含有3.07 g?；撬?。除了海洋動物外,一些海藻中也含有一定的?；撬?Fen等[49]從紅藻紫菜中最高獲得含量為1300 mg/100 g的?；撬?。

對于同一種海洋生物來說,不同研究人員可能得到不一樣的結(jié)果,甚至?xí)霈F(xiàn)很大的差異,這種情況主要可能由以下幾方面造成:實(shí)驗(yàn)人員操作誤差;實(shí)驗(yàn)材料來源誤差,海洋生物的個體狀況和它們生長的水域環(huán)境、季節(jié)等外部條件有關(guān);實(shí)驗(yàn)材料利用部位誤差,不同部位?；撬岷坎町愝^大;實(shí)驗(yàn)處理方式不一致,即提取檢測方法不同,可能得到不一樣的結(jié)果。如王順年等[50]在測定牡蠣肉中牛磺酸含量時,采用不同的兩種方法進(jìn)行處理,所測得的?；撬岷坎顒e達(dá)到35.4%。

3 海洋生物中?；撬岬奶崛》椒?/h2>

目前常用的?；撬崽崛》椒ㄖ饕ㄋ蠓ā⑷軇┨崛》?、酶解法、超聲波輔助法、超高壓處理法等。

3.1 水煮法

海洋生物體細(xì)胞液及組織間的液體中存在豐富的游離?；撬?依據(jù)其高水溶性特性,一般可用熱水作為溶劑直接提取,操作工藝簡單、快速,成本較低,影響提取效率的因素主要為料液比、提取溫度、提取時間等[51]。冷波等[52]采用熱水浸提法,從魚廢料中制備?；撬?通過單因素實(shí)驗(yàn)及正交試驗(yàn)確定最佳提取條件為料液比6∶1、提取溫度60 ℃、提取時間50 min、提取液pH5.2,該法提取率高達(dá)2793 mg/100 g。

采用自溶破壁水對?；撬徇M(jìn)行處理是水煮法的一種改進(jìn)。錢俊青等[53]研究不同破壁方案提取效果發(fā)現(xiàn),經(jīng)保溫自溶破壁獲得的提取液中牛磺酸含量明顯較高。李和生等[54]的研究表明,先將蛤蜊在pH5.5、45 ℃下培養(yǎng)24 h,再進(jìn)行水煮處理,牛磺酸的溶出較多。水煮法提取的牛磺酸中含有水溶性的游離氨基酸,一般需要利用離子交換純化,較多使用強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂進(jìn)行分離純化[55]。

3.2 溶劑提取法

乙醇也常作為溶劑來提取?；撬?姜新發(fā)[56]采用60%乙醇從翡翠貽貝中提取牛磺酸,在提取溫度80 ℃,提取時間60 min,料液比1∶5等條件下,反復(fù)提取3次,得到提取率為0.92%的?；撬?。紀(jì)蕾等[42]利用乙醇回流法在魁蚶中提取?；撬?確定最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)75%,料液比1∶12 g/mL,提取溫度70 ℃、時間50 min,測得?；撬岬奶崛×繛?36 mg/100 g。錢愛萍等[57]比較了70%乙醇沸水浴提取法、0.02 mol/L鹽酸提取法、6%磺基水楊酸熱水浴提取法3種方法對牛磺酸提取率的影響,發(fā)現(xiàn)6%磺基水楊酸熱水浴提取法相比其他兩種方法效果較好,但差別不大。

根據(jù)當(dāng)前的研究發(fā)現(xiàn),采用不同的溶劑進(jìn)行提取,對牛磺酸的提取率影響不大,與其他溶劑提取法相比,水提法則較為安全、操作簡單,且成本較低,適于工業(yè)化生產(chǎn)[55]。

3.3 酶解法

生物酶也常常被應(yīng)用在活性物質(zhì)的提取過程當(dāng)中,劉芳等[58]選取酸性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶等對南海海洋珍珠貝肉進(jìn)行處理,發(fā)現(xiàn)蛋白酶可以破壞蛋白結(jié)構(gòu),促進(jìn)其水解,提高?；撬岖@得率。此外,采用復(fù)合酶進(jìn)行處理也能顯著影響牛磺酸的提取效果[59]。

酶解法一般與水煮法相結(jié)合,粟桂嬌等[60]研究發(fā)現(xiàn),在車螺肉提取?；撬岬倪^程中,將酸性蛋白酶與水煮法相結(jié)合處理車螺肉的效果比單純水煮或單純酶解的效果好。劉亞南等[61]利用中性蛋白酶在牡蠣提取液中提取牛磺酸,結(jié)果表明,影響?；撬崽崛÷实囊蛩赜纱蟮叫》謩e為:加酶量、pH、溫度。

酶解法存在一定的缺陷。一方面,采用生物酶直接水解,會使海洋生物中的微量元素、游離氨基酸、多肽等都溶于酶解液中,不易分離[62];另一方面,處理好的酶解液需進(jìn)行滅酶,而且酶解液顏色一般會較深,需要用活性炭等進(jìn)行脫色處理,增加了整個提取工藝的復(fù)雜性[51]。

3.4 超聲波輔助法

為了提高?；撬岬奶崛⌒?可用超聲波技術(shù)進(jìn)行輔助提取。超聲波提取是利用超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)等,有效地破碎空化中心附近的細(xì)胞,并增大提取溶劑分子的運(yùn)動速度及穿透力,便于?；撬釓募?xì)胞中溶出,與提取溶劑充分接觸而被分離,從而有效地提高?；撬岬奶崛⌒蔥63]。超聲波提取技術(shù)具有操作簡便易行、低溫不破壞活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)、提取物易分離、提取率高等特點(diǎn),廣泛應(yīng)用于動植物中天然活性物質(zhì)的提取[64]。

周燕霞等[65]研究發(fā)現(xiàn)將超聲波破碎與乙醇回流法相結(jié)合,有利于?；撬岢浞秩艹?相較于單純機(jī)械破碎后進(jìn)行乙醇回流處理的牛磺酸提取量平均高出26.9%。萬鵬等[66]從巨牡蠣中提取?；撬岬膶?shí)驗(yàn)結(jié)果表明,超聲輔助酶解提取法的提取率比單純超聲法提取或單純堿性蛋白酶酶解法高。超聲波提取技術(shù)有許多影響因素,提高提取率的關(guān)鍵在于找到合適的聲學(xué)參數(shù),如超聲頻率、聲強(qiáng)度、空占比等,其工業(yè)設(shè)備的制作難度高,成本較大,目前主要用于實(shí)驗(yàn)室研究上[64]。

表3 不同?；撬釞z測分析方法比較Table 3 Comparison of different detection and analysis methods of taurine

3.5 其他方法

超高壓技術(shù)是一種非熱力提取技術(shù),近些年在食品領(lǐng)域中逐步普及利用。在常溫條件下,以100～1000 MPa的超高流體靜壓力為手段對目標(biāo)物施加壓力保持一定時間,使原料細(xì)胞內(nèi)外壓力達(dá)到平衡后快速卸除壓力,使細(xì)胞內(nèi)外滲透壓差突然增大,以便于目標(biāo)萃取物從細(xì)胞中溶出,轉(zhuǎn)移到提取溶劑中,進(jìn)而完成整個提取過程[67]。超高壓提取技術(shù)在水產(chǎn)品活性物質(zhì)提取中具有常溫、高效、能耗少等特點(diǎn)[68]。徐成等[69]利用超高壓法提取牡蠣中的?；撬?實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,壓力大小、保壓時間、溫度以及料液比等都對?；撬岬奶崛÷视休^大影響,且超高壓提取法的得率要高于傳統(tǒng)的水煮法。

?；撬釋儆趦尚晕镔|(zhì),其等電點(diǎn)為pI=(pk1+pk2)/2=(1.50+8.47)/2=5.00。由兩性物質(zhì)的特性可知,當(dāng)溶液的pH與兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)一致使,其極易沉淀析出[51]。姜傳福等[70]利用等電點(diǎn)法從文蛤中提取?；撬?即調(diào)節(jié)提取溶劑的pH,當(dāng)pH=5時,?；撬崽崛÷首罡?為1.3%。等電點(diǎn)法簡單快捷、條件易控、投入少而產(chǎn)出高,且無污染,是提取?；撬岬囊环N新途徑。

4 牛磺酸的檢測分析方法

?；撬岬难芯空诓粩嗌钊?其相應(yīng)的配套檢測技術(shù)也得到逐步的發(fā)展與應(yīng)用。當(dāng)前國內(nèi)外有關(guān)牛磺酸的檢測方法主要有中和滴定法、分光光度法、薄層掃描法、液相色譜法和氨基酸分析儀測定法等，比較結(jié)果見表3[71-79]。不同的方法有各自的優(yōu)缺點(diǎn),可以根據(jù)檢測需要選擇適宜的測定方法。

4.1 中和滴定法

牛磺酸是一種弱有機(jī)酸,可以利用堿性化合物如氫氧化鈉、氫氧化鉀進(jìn)行中和反應(yīng),根據(jù)堿性化合物的消耗量計(jì)算?；撬岷?。盧忠等[71]用中和酸堿滴定法測定?；撬岷?滴定前測得0.1 mol/L?；撬崛芤旱膒H為5.63(25 ℃),滴定至終點(diǎn)后,測得溶液pH為9.62(25 ℃)。根據(jù)酸堿滴定理論,該滴定體系的滴定突躍范圍足夠大,指示劑能明顯變化以指示終點(diǎn)。此外,?；撬釣槿跛?采用常規(guī)滴定法終點(diǎn)較難判斷,檢測精確度低,因此衍生出自動電位滴定法[80]、庫侖滴定法[81]等利用H+電位滴定的精度較高的方法。滴定法設(shè)備簡單、操作方便,但影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素較多,穩(wěn)定性和精確性不足。

4.2 分光光度法

?；撬崾且环N氨基酸,本身不具備紫外吸收特性,與特定的試劑反應(yīng),可生成顯色物質(zhì),分光光度法是在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)測定該生成物對光的吸收度,以此對該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。如在醋酸鈉環(huán)境中,?；撬崤c乙酰丙酮和甲醛進(jìn)行加熱反應(yīng),生成N-取代基-2,6-二甲基-3,5-二乙酰基-1,4-二氫吡啶,此生成物顯黃色,在400 nm左右出現(xiàn)峰值,其吸收值與?；撬釢舛仍谝欢ǚ秶鷥?nèi)呈線性關(guān)系[82]。分光光度法的應(yīng)用光區(qū)包括紫外光區(qū),可見光區(qū),紅外光區(qū),所用的顯色劑主要有茚三酮、酚試劑、鄰苯二甲醛(OPA)等[83-84]。

劉天紅等[85]對分光光度法進(jìn)行優(yōu)化,檢測魁蚶中?；撬岬暮?確定檢測條件為:顯色劑為乙酰丙酮:37%甲醛:1 mol/L乙酸鈉(1∶0.3∶4,V∶V∶V),顯色時間9 min,顯色溫度60 ℃,檢測波長330 nm。

分光光度法具有設(shè)備廉價、操作方便快捷等特點(diǎn),同時也存在檢測靈敏度較低、試劑毒性大等不足,不適用于低濃度?；撬岬臏y定[72]。此外,分光光度法只能檢測出一種或一類氨基酸的總量,并不適用于氨基酸的分離分析實(shí)驗(yàn)[78]。

表4 不同高效液相色譜衍生試劑的特點(diǎn)Table 4 Characteristics of different derivatives of high performance liquid chromatography

4.3 薄層色譜法

利用薄層色譜法測定食物中?；撬岷康闹饕襟E為:制備離子交換柱對樣品中的牛磺酸進(jìn)行提純處理后進(jìn)行測定,通過制備薄層板、點(diǎn)樣、展開、顯色,樣品Rf值為定性指標(biāo),通過斑點(diǎn)大小及顏色深淺則可進(jìn)行粗糙定量[86]。

劉春美等[87]建立了測量牡蠣軟體中?；撬岷康谋訏呙璺?具體內(nèi)容為:以乙醇-水(7∶3)為展開劑,展距8 cm;利用0.2%茚三酮乙醇液的顯色作用,在105 ℃條件下進(jìn)行加熱,直至斑點(diǎn)清晰;反射法線性掃描:λs=519 nm,λR=618 nm,狹縫:10.0×0.4 mm,Sx=3。以此方法測定的?；撬崞骄繛?58.57 mg/100 g。呂雯等[88]利用薄層色譜法考察國內(nèi)?；撬岙a(chǎn)品的質(zhì)量,篩選比較 3 種展開體系、4 種顯色方式,發(fā)現(xiàn)以水-無水乙醇-正丁醇-冰醋酸(150∶150∶100∶1)為展開劑,茚三酮的丙酮溶液(1→50)為顯色劑,檢測效果最佳。

薄層色譜法能同時進(jìn)行定量、定性檢測,對樣品前處理要求低,設(shè)備操作便捷,檢測成本低,但是精密度較差,在定性鑒定、半定量等分析檢測中有著重要作用[73]。

4.4 氨基酸自動分析法

不同氨基酸其結(jié)構(gòu)和所攜帶的離子不盡相同,氨基酸自動分析法是以陽離子交換樹脂為固定相,酸性緩沖液為流動相,將茚三酮與氨基酸以柱后衍生的方式生成具有可見光吸收特性的衍生物,再通過氨基酸自動分析儀進(jìn)行測定[89]。

?；撬峥膳c茚三酮反應(yīng),衍生物為藍(lán)紫色,在儀器的第一通道570 nm左右有最大吸收峰,衍生物的光吸收度與濃度在一定范圍內(nèi)成正比,即符合朗伯比爾定律[90]。王洪健等[91]利用氨基酸自動分析儀測定牡蠣、貝類、功能性飲料等中的?；撬岷?建立相應(yīng)的測定方法,該法相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.27%,回收率為100.4%～102.0%。

氨基酸自動分析法快速、精準(zhǔn),具有重復(fù)性好、儀器穩(wěn)定、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn),但是所需儀器設(shè)備昂貴[89]。此外,Kaspar等[92]分別用氨基酸分析儀、液-質(zhì)法、氣-質(zhì)法測定尿液中氨基酸,對比42種氨基酸的檢測效果,發(fā)現(xiàn)氨基酸分析儀耗時最長(130 min),且靈敏度低于其它兩種方法。

4.5 高效液相(HPLC)色譜法

?；撬岜旧聿淮嬖诎l(fā)色基團(tuán),無法直接使用高效液相檢測器進(jìn)行測定,必須先經(jīng)過衍生化處理,使?；撬釘y帶發(fā)色基團(tuán),以達(dá)到檢測目的[93]。早期主要使用茚三酮作為柱后衍生化試劑,但該方法檢測牛磺酸時精確度較低?，F(xiàn)如今,?；撬岬母咝б合嗌V檢測主要有柱前衍生和柱后衍生兩種,柱前衍生法衍生試劑包括2,4-二硝基氟苯(DNFB)、異硫氰酸苯酯(PITC)、丹磺酰氯法(dansyl-Cl)、鄰苯二甲醛(OPA)、熒光胺、二甲基萘胺-5-磺酰氯(DMS-Cl)、2,3-萘基二縮醛(NDA)等;柱后衍生法主要以鄰苯二甲醛(OPA)作為衍生試劑[94]。

表4[43,94,96,98-101]列出了幾種主要衍生試劑的特點(diǎn),其中OPA是測定游離氨基酸最常用的一種衍生化試劑,其靈敏度高,但是存在衍生物不穩(wěn)定、衍生化時間要求苛刻等缺陷。王海澍[95]采用高效液相色譜法檢測牡蠣提取液中?；撬岷?結(jié)果表明該法穩(wěn)定性較高、重現(xiàn)性好。周欣蕊等[96]優(yōu)化了國標(biāo)第二法對功能飲料中的?；撬徇M(jìn)行測定,以甲醇替換乙腈作為流動相,減輕毒性、縮短了衍生時長,檢測結(jié)果符合要求。孟冰冰等[97]建立了程序進(jìn)樣-柱前衍生-超高效液相色譜法,解決了衍生物不穩(wěn)定的難題,減少了實(shí)驗(yàn)誤差,靈敏度和回收率高。

4.6 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)

液相色譜能夠?qū)?fù)雜基體化合物進(jìn)行高效分離,但需相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品才能進(jìn)行定性,而質(zhì)譜則是確定化合物結(jié)構(gòu)的有效方法,兩者聯(lián)用,樣品無需衍生化即可直接測定,適用于快速定性定量分析[102]。

高極性水溶性特點(diǎn)使得利用親水色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測?；撬岢蔀榭赡?有機(jī)溶劑在親水作用體系中具有弱洗脫強(qiáng)度,而水一般作為強(qiáng)洗脫溶液,通過增加有機(jī)相比例,有效提高在質(zhì)譜中的揮發(fā)性,并且改善分離度[94]。陳曉峰等[103]改善樣品處理方法,探明基質(zhì)效應(yīng)及影響電噴霧離子源的電離因素,從而改進(jìn)超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù),建立了操作簡便、基質(zhì)效應(yīng)低、靈敏度高的檢測方法。

隨著超高效液相色譜的發(fā)展,LC-MS聯(lián)用技術(shù)以快速定性、定量分析的優(yōu)勢受到廣大氨基酸研究者的青睞,氨基酸分析的時間大大縮短,檢測效率得到明顯提高[78]。LC-MS的檢測精度高、檢出限低等特點(diǎn)使得其更適用于奶粉、飲料等食品中添加劑的分析檢測[104]。

4.7 毛細(xì)管電泳法

?；撬岜旧頉]有電化學(xué)活性,不能直接進(jìn)行電化學(xué)檢測,通過萘-2,3-二甲醛(NDA)、鄰苯二甲醛(OPA)等衍生化處理,如在CN-存在情況下,NDA可以與牛磺酸生成具有電化學(xué)活性的產(chǎn)物,當(dāng)兩電極具有一定恒壓時,其在電極表面發(fā)生氧化,產(chǎn)生的電子數(shù)轉(zhuǎn)移形成電信號變化,以此測定?；撬岷縖105]。

毛細(xì)管電泳法(capillary electrophoresis,CE)是一種以高壓直流電場為驅(qū)動力、以毛細(xì)管為分離通道的高效分離技術(shù)[106]。毛細(xì)管電泳儀將樣品中氨基酸分離后,結(jié)合紫外、質(zhì)譜、電化學(xué)等檢測器對不同種氨基酸進(jìn)行定性和定量分析,此法操作簡便、分離效率高、溶劑消耗少、成本低,特別適合氨基酸的手性分離[107]。

薛勇等[108]采用鄰苯二甲醛(OPA)柱前衍生牛磺酸,通過毛細(xì)管電泳-紫外檢測建立乳制品、功能食品等樣品中?；撬岬目焖贆z測方法,結(jié)果準(zhǔn)確性高。

毛細(xì)管電泳法有多種分離模式,應(yīng)用范圍十分廣泛,但是由于毛細(xì)管直徑小,使光路太短,使用某些檢測方法(如紫外檢測等)時,靈敏度較低,結(jié)果不精確[107]。

4.8 紅外光譜分析法

近紅外光譜分析技術(shù)是近年來發(fā)展較快速的一種物理檢測技術(shù),不同有機(jī)物中存在不同基團(tuán),各個基團(tuán)的能級也有所差別,置于不同化學(xué)環(huán)境中,每個基因產(chǎn)生的振動和倍頻不同,以此呈現(xiàn)檢測圖譜以確定物質(zhì)的二級結(jié)構(gòu),能反映樣品的化學(xué)全貌,該法操作簡單快速、成本低,但被測樣品純度要求高[109-110]。張慧恩等[110]利用近紅外光譜技術(shù)測定海洋生物?；撬岷?并建立一整套的快速檢測技術(shù)方法。

近紅外光譜與其他傳統(tǒng)分析技術(shù)相比,檢測時只需要采集1次樣品信息,即可進(jìn)行多項(xiàng)指標(biāo)的測定,簡便高效,適合大批量樣品的快速檢測。但是在建立分析方法時,需要以統(tǒng)計(jì)學(xué)方法為基礎(chǔ),建立相應(yīng)的定量分析模型,且不同種類、結(jié)構(gòu)的樣品建立的模型有所差異[79]。

5 討論

牛磺酸具有十分廣泛的生理作用,在食品、藥品、飼料添加劑等領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。人工合成與天然提取的?；撬醿r格相差好幾倍,由于技術(shù)限制,天然制備?；撬岷茈y實(shí)現(xiàn)量產(chǎn)。目前對?；撬岬臋C(jī)理研究較少涉及天然提取與人工合成的差別,對于兩種類型的?；撬嵩谧饔脵C(jī)制或者產(chǎn)生毒副作用等方面是否存在差異尚不明確,未來應(yīng)更加深入研究探索兩者的異同點(diǎn),為?；撬岬膽?yīng)用提供更多的可靠參考文獻(xiàn)。

目前主要是從魚貝類中提取天然?；撬?進(jìn)而研究魚貝類中不同部位的牛磺酸含量。如太平洋褶柔魚中內(nèi)臟中牛磺酸的含量比其他部位高[45]。未來可側(cè)重研究從魚貝類廢棄物中提取牛磺酸,對其進(jìn)行綜合利用,提高產(chǎn)業(yè)價值。此外,部分藻類中也含有一定的牛磺酸,但相關(guān)研究較少,因此研究海洋植物中?；撬岷恳灿幸欢ǖ囊饬x。

牛磺酸的天然提取有兩個要點(diǎn):提高提取率及分離純化。天然?；撬岬膬r格比化學(xué)合成的?；撬岣叩枚?但受限于提取技術(shù)等,其產(chǎn)量一直不高。為了提高產(chǎn)量、縮短提取時間,今后的研究趨勢將是多種提取技術(shù)的協(xié)同發(fā)展,通過物理和化學(xué)手段,聯(lián)合幾種不同的提取方法,可以有效地提高?；撬崽崛÷?是重要的研究方向之一。隨著天然?；撬嵩诒＝?、醫(yī)療行業(yè)的廣泛研究應(yīng)用,如何純化提取的?；撬嵋渤闪搜芯繜狳c(diǎn),現(xiàn)有的醇提、膜分離、結(jié)晶等提純方法都存在一定的缺陷,研究幾種技術(shù)的聯(lián)合使用或者開發(fā)新技術(shù)都有極大的工業(yè)意義。

?；撬釞z測技術(shù)作為其生理功能研究的輔助手段極為重要,如何建立方便、有效、精確的?；撬岱治龇椒ㄊ钱?dāng)前氨基酸分析方法課題研究中不可或缺的一部分。目前,“高效液相色譜—柱前衍生法”在實(shí)際研究生產(chǎn)中應(yīng)用率最高,但是衍生物穩(wěn)定性、衍生時間、衍生副產(chǎn)物等因素一直影響著檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,未來可通過探索靈敏度高、特異性強(qiáng)的衍生試劑來提高該檢測技術(shù)。此外,多項(xiàng)檢測技術(shù)的高效集成化、模塊化也是?；撬釞z測的發(fā)展方向之一,如液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS),樣品不需衍化就可直接測定,更加簡便、快捷。

6 展望

隨著人們對天然安全食品的追求,對天然?；撬岷腿斯せ瘜W(xué)合成?；撬岬淖饔脵C(jī)制或者可能產(chǎn)生的毒副作用等方面的研究顯得尤為重要。研究?；撬嵩谏镏械姆植记闆r能提供更多的天然?；撬岖@取途徑,而對天然提取技術(shù)的研究開發(fā)則能夠更有效地提高天然?；撬岬闹苽洚a(chǎn)量。此外,方便、有效、精確的?；撬徼b定分析方法也應(yīng)隨之建立,通過對多項(xiàng)檢測技術(shù)的集成聯(lián)用可以有效提高檢測效率,適用范圍更加廣泛。