鈣離子在鎘誘導(dǎo)的腎毒性中的作用機(jī)理

任 真, 趙金鳳, 張 瑤, 謝益敏, 周 陽, 顧 杰*, 施海峰*

1.江蘇大學(xué)生命科學(xué)研究院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013;2.江蘇大學(xué)附屬宜興醫(yī)院, 江蘇 宜興 214200

鎘是一種有毒重金屬，可長期富集在生物體中，對生物體造成巨大危害。在人體中的生物半衰期可長達(dá)10～30年[1]。鎘通過食物、空氣、水等途徑被人體攝入后會累積于腎臟、肝臟、脾臟和胰腺等器官[2,3]；誘導(dǎo)包括腎臟[4]、肝臟[5]、神經(jīng)元[6]和胸腺[7]等多種器官和組織的凋亡；導(dǎo)致腎臟受損，并導(dǎo)致肺、心血管和肌肉骨骼系統(tǒng)的功能異常[8]。腎臟是鎘暴露和毒性的主要靶器官[9,10]。長期鎘暴露后約50%的鎘會累積于腎臟中，并且大部分蓄積于腎近端小管上皮細(xì)胞，引發(fā)腎臟受損，甚至增加癌癥發(fā)生的幾率[11,12]。

細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)對維持細(xì)胞內(nèi)許多生物過程十分重要[9,10,12]。鎘能夠破壞細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)，并導(dǎo)致包括腎臟細(xì)胞[13,14]在內(nèi)的多種細(xì)胞凋亡[11,15～18]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞中最大的儲存鈣離子的細(xì)胞器，也稱為“鈣庫”[19]。鎘暴露會減少細(xì)胞外鈣離子流入[20,21]，或促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)“鈣庫”的鈣離子釋放[13]，導(dǎo)致胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡。本文就鎘對腎臟細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、鈣離子信號通路和鈣穩(wěn)態(tài)的影響和機(jī)理，以及目前可通過調(diào)節(jié)鈣離子動態(tài)平衡減輕鎘的腎毒性的藥物進(jìn)行綜述，以期為相關(guān)研究提供參考。

1 鎘對細(xì)胞鈣離子濃度的影響

胞漿中鈣離子濃度的升高是由于胞外介質(zhì)中鈣離子流入胞內(nèi)增加，或鈣庫的鈣離子釋放到胞漿增多[18]。雖然細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的上升是所有類型細(xì)胞中的關(guān)鍵信號，可調(diào)控許多細(xì)胞過程，如基因轉(zhuǎn)錄、胞吐作用等[22]；但細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度不受控制的升高通常具有細(xì)胞毒性[17]。

鎘暴露會破壞細(xì)胞中鈣離子的動態(tài)平衡，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在大鼠心肌細(xì)胞中，鎘誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，導(dǎo)致胞漿鈣離子濃度的上升，最終引起細(xì)胞凋亡[11,18]。小鼠腎小球系膜細(xì)胞MES-13中，鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡也是由鈣離子信號通路介導(dǎo)的[2]。亞細(xì)胞鈣的重新分布在重金屬暴露誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中可能扮演著重要的病理介質(zhì)的角色。鎘還會引起細(xì)胞中鈣離子在不同細(xì)胞器間的重新分布。在大鼠腎近端小管細(xì)胞中，鎘暴露后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子濃度下降，而線粒體鈣離子濃度升高[14]，在Wistar大鼠肝臟細(xì)胞[23]和腎臟細(xì)胞HEK293[24]中，鎘暴露后出現(xiàn)胞漿鈣離子濃度升高、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子濃度下降的現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)室在小鼠腎小管上皮細(xì)胞中也證實(shí)鎘能夠誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子的流失，胞漿中鈣離子濃度上升引起細(xì)胞凋亡[25]。為彌補(bǔ)胞內(nèi)鈣庫中鈣離子的大量流失，細(xì)胞會從胞外環(huán)境中吸收鈣離子，然而這反而進(jìn)一步加劇了胞內(nèi)鈣離子的穩(wěn)態(tài)失衡[13]。可見，鎘通過擾亂胞漿和細(xì)胞器中的鈣離子流動破壞了腎臟細(xì)胞內(nèi)鈣離子的動態(tài)平衡。

2 鎘對鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白的影響

2.1 鎘對細(xì)胞膜上鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白的影響

鎘通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜上的鈣離子吸收蛋白和輸出蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度異常。由于鎘對La3+而不是L型鈣離子通道敏感，因此鎘誘導(dǎo)鈣離子流入胞內(nèi)的過程可能是由非選擇性鈣離子通道介導(dǎo)的[26,27]。Yeh等[13]發(fā)現(xiàn)鎘通過非選擇性鈣離子通道將鈣離子引入，誘導(dǎo)Madin Darby犬腎細(xì)胞引起胞漿鈣離子濃度升高。

鈣離子ATP酶(plasma membrane Ca2+-ATPase，PMCA)屬P型ATPase家族。磷酸化后出現(xiàn)E1和E2兩種構(gòu)象，E2構(gòu)象與鈣離子親和力小于E1構(gòu)象。PMCA通過兩種構(gòu)象的交替存在實(shí)現(xiàn)了鈣離子的轉(zhuǎn)運(yùn)[28]。鈣酶活力的下降會導(dǎo)致鈣離子不能正常被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，導(dǎo)致胞漿中鈣離子累積。腎細(xì)胞中PMCA是主要的鈣離子輸出蛋白。鎘介導(dǎo)的PMCA活性損傷對組織功能的影響是雙重的。首先，通過抑制PCMA, 鎘阻止其自身的排出，導(dǎo)致其在細(xì)胞內(nèi)逐漸積累，并觸發(fā)其本身的促凋亡信號通路。其次，PMCA的抑制作用導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)鈣離子濃度的增加，通過凋亡甚至壞死導(dǎo)致細(xì)胞死亡[29]。由此，鎘通過破壞腎臟細(xì)胞對胞外介質(zhì)中鈣離子正常的吸收和輸出，促進(jìn)胞內(nèi)鈣離子濃度異常升高。

磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C (phosphoinositide-specific phospholipase C，PI-PLC)的激活對胞漿鈣離子水平的升高起著關(guān)鍵作用。該酶催化磷脂酰肌醇4,5-二磷酸水解產(chǎn)生三磷酸肌醇(inositol trisphosphate, IP3)和二酰甘油[30]。三磷酸肌醇與其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的受體結(jié)合，觸發(fā)鈣離子釋放到細(xì)胞質(zhì)中，而二酰甘油參與蛋白激酶C的激活[30,31]。鎘可通過二價(jià)陽離子受體(cation-sensing receptor, CSR)介導(dǎo)的磷脂酶C-三磷酸肌醇(PLC-IP3)信號通路誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[15,32]。此外，大量研究表明，鎘調(diào)節(jié)許多Ca2+依賴性調(diào)節(jié)蛋白的功能，如蛋白激酶C、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)、鈣調(diào)蛋白和鈣/鈣調(diào)蛋白-依賴性蛋白激酶Ⅱ，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)失調(diào)[33～40]。這些細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)蛋白均可由負(fù)責(zé)調(diào)控體液中鈣穩(wěn)態(tài)的G蛋白偶聯(lián)受體-鈣敏感受體(calcium sensing receptor, CaSR)介導(dǎo)[41]。早前Faurskov等[42]發(fā)現(xiàn)CaSR激動劑新霉素減少了非洲爪蟾腎遠(yuǎn)端小管上皮細(xì)胞A6中鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子增加。本實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果證實(shí)激活CaSR可降低鎘誘導(dǎo)的胞漿中上升的鈣離子濃度，修復(fù)鎘破壞的細(xì)胞內(nèi)鈣離子動態(tài)平衡，減輕鎘誘導(dǎo)的腎細(xì)胞毒性[25]。這表明鎘激活的信號通路和鈣離子自身的信號通路對胞內(nèi)鈣離子的動態(tài)平衡可能存在競爭調(diào)節(jié)作用。

2.2 鎘對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)相關(guān)蛋白的影響

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)具有兩個(gè)鈣離子釋放通道：三磷酸肌醇受體(inositol trisphosphate receptor, IP3R)和魚尼丁受體(ryanodine receptor, RyR)，還有一個(gè)鈣離子回流通道：肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶(sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase, SERCA)，這3個(gè)鈣離子通道間的平衡對維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子動態(tài)平衡至關(guān)重要[43]。IP3R主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，是第二信使三磷酸肌醇(IP3)跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)體系的重要成員。IP3R有3種亞型(IP3R1、IP3R2和IP3R3)，以同源四聚體形式存在，胞漿內(nèi)游離的Ca2+能觸發(fā)IP3R通道開放，釋放內(nèi)質(zhì)網(wǎng)貯存的鈣離子，使[Ca2+]i升高[44]。在腎小管近端上皮細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的鈣離子釋放通道主要是IP3R[45,46]。鎘處理后的腎近端小管細(xì)胞，IP3及其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的受體IP3R-1和IP3R-2的蛋白質(zhì)水平顯著增加，IP3激活I(lǐng)P3R后促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子的釋放[14]。

SERCA是一種廣泛存在于動植物細(xì)胞中的能夠?qū)⑩}離子從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的泵[47]。SERCA包括3個(gè)亞型(SERCA1、SERCA2和SERCA3)，SERCA2包括SERCA2a和SERCA2b兩個(gè)亞型，其中SERCA2a在心肌鈣調(diào)控中受到廣泛關(guān)注。當(dāng)[Ca2+]i升高并超過閾值(10 mol/L)時(shí)，SERCA可將胞漿中的鈣離子重新攝取到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，使心肌細(xì)胞舒張，同時(shí)為下一次心肌收縮儲備鈣離子[28]。通過對鈣離子的這種轉(zhuǎn)運(yùn)，SERCA起到了維護(hù)鈣離子穩(wěn)態(tài)的作用[48]。SERCA2b則在各種組織器官中都有表達(dá)，起到將鈣離子輸送回內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能，維護(hù)了鈣離子穩(wěn)態(tài)[49]。在腎臟中，鎘暴露導(dǎo)致SERCA活性降低，抑制胞漿中的鈣離子回流進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡[50]。SERCA介導(dǎo)鈣離子透過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的速率通過受磷蛋白(phospholamban, PLB)來控制。當(dāng)PLB與其結(jié)合時(shí)，SERCA活性降低，鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)的速率降低。磷酸化PLB可減少SERCA和PLB的結(jié)合，當(dāng)SERCA與PLB解離后，鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)增加[51]。因此，鎘也可能通過影響SERCA和PLB的結(jié)合，抑制鈣離子的轉(zhuǎn)運(yùn)。鎘對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)相關(guān)蛋白的影響說明鎘對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)具有雙重毒性，既能夠持續(xù)促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫中鈣離子釋放進(jìn)入胞漿，又能抑制胞漿中的鈣離子回流進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫，加劇內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和胞漿鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡。

3 緩解鎘毒性的方法和藥物

鎘不僅蓄積在腎臟中導(dǎo)致腎功能受損，還會在其他如肝臟、骨骼等組織器官中累積并造成組織損傷或代謝紊亂。鎘暴露后小鼠肝臟會發(fā)生體積腫大、肝葉腫脹、顏色變黑等病理學(xué)變化[52]。同時(shí)，鎘還會引起骨骼毒性導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[53]。近年來，有許多研究致力于尋找減輕甚至完全逆轉(zhuǎn)鎘毒性的方法和藥物，主要是通過緩解鎘暴露誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡等途徑。

3.1 通過緩解鎘引起的氧化應(yīng)激緩解鎘毒性

鎘暴露后可導(dǎo)致組織和細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激造成組織損傷和細(xì)胞凋亡，而減輕氧化應(yīng)激可減輕鎘的毒性。周慶彪等[54]發(fā)現(xiàn)硒能有效拮抗慢性鎘暴露導(dǎo)致的大鼠腎臟毒性，其作用機(jī)制可能是氧化應(yīng)激條件下，硒通過抑制SETD6促進(jìn)DJ-1蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)抗氧化轉(zhuǎn)錄因子Nrf2表達(dá)，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，減輕鎘暴露誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。硫化鋅(ZnSO4)對鎘毒性也具有拮抗作用，鋅可誘導(dǎo)體內(nèi)鋅金屬硫蛋白(ZnMT)合成，ZnMT可通過增加抗氧化酶活性、清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化等途徑對鎘致肝腎損傷起到拮抗作用[55]。有研究表明金屬硫蛋白(metallothionein，MT)除了在金屬代謝、儲存及解毒等方面有重要作用外，還是體內(nèi)清除自由基能力很強(qiáng)的一種蛋白質(zhì)[56]。MT可通過拮抗氧化應(yīng)激減弱鎘對骨的損傷[57]。甘草酸二銨是甘草的主要成分，甘草次酸的衍生物，具有抗氧自由基作用。可通過提高被鎘抑制的抗氧化酶的活性而對肝臟起防護(hù)作用，提高機(jī)體抗氧化能力，清除體內(nèi)自由基，減少自由基對組織和細(xì)胞的損害[58]。

3.2 通過調(diào)節(jié)鈣離子穩(wěn)態(tài)緩解鎘腎毒性

鎘暴露可導(dǎo)致組織和細(xì)胞中鈣穩(wěn)態(tài)失衡而造成的組織損傷和細(xì)胞凋亡，而通過調(diào)節(jié)細(xì)胞中鈣離子水平可減輕鎘的毒性。BAPTA-AM作為一種胞內(nèi)游離鈣離子螯合劑，可顯著降低鎘誘導(dǎo)的胞漿中鈣離子濃度的上升，減輕鎘誘導(dǎo)大鼠腎近端小管細(xì)胞的凋亡[14]。2-APB是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子通道IP3R的一種阻斷劑，可抑制鎘誘導(dǎo)大鼠腎近端小管細(xì)胞胞漿和線粒體內(nèi)鈣離子濃度的升高[14]。槲皮素作為一種廣泛存在的膳食抗氧化劑，具有預(yù)防鎘誘導(dǎo)的大鼠腎小管細(xì)胞毒性的作用，且可以顯著抑制鎘誘導(dǎo)的胞漿鈣離子濃度的上升[59]。本實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果表明擬鈣劑NPS R-467作為鈣敏感受體CaSR的激動劑，既可以維持小鼠腎小管細(xì)胞內(nèi)鈣離子的動態(tài)平衡，減輕鎘引起的腎小管細(xì)胞毒性，還能增加鎘抑制的腎小管細(xì)胞的增殖[25]。雖然直接抑制鈣離子釋放和螯合超載的鈣離子可以減輕鎘誘導(dǎo)的腎臟毒性，但是并不能徹底修復(fù)鎘破壞的腎小管細(xì)胞內(nèi)鈣離子的動態(tài)平衡、腎臟細(xì)胞對胞外介質(zhì)中鈣離子的吸收與釋放，以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫正常生理水平的鈣離子輸出和回流。而通過調(diào)控可動態(tài)調(diào)節(jié)鈣離子動態(tài)平衡的作用靶點(diǎn)，或可更有效地維持和改善細(xì)胞內(nèi)外的鈣離子動態(tài)平衡，以防治重金屬等誘導(dǎo)的腎臟受損，并減少副作用。

3.3 其他方式緩解鎘毒性

除上述兩個(gè)緩解鎘毒性的途徑外，其他方法也在不斷研究中。Boyce等[60]在篩選細(xì)胞免受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的小分子時(shí)發(fā)現(xiàn)，Salubrinal可抑制真核翻譯起始因子2亞基α (eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α)的去磷酸化，從而保護(hù)非洲綠猴腎細(xì)胞Vero免受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Komoike等[61]的研究結(jié)果表明，Salubrinal可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并通過抑制細(xì)胞死亡信號通路減少鎘誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞HK-2凋亡。王林等[62]的研究結(jié)果表明，葛根素puerarin可通過恢復(fù)自噬、阻斷溶酶體膜透化作用、抑制Nrf2通路，減輕鎘誘導(dǎo)的大鼠腎小管細(xì)胞的細(xì)胞毒性。早前，Liu等[63]在大鼠腎小管細(xì)胞中的研究表明，鎘通過抑制鈣依賴型的自噬體-溶酶體融合破壞自噬流。本實(shí)驗(yàn)室的研究證明，鈣離子介導(dǎo)了鎘破壞的小鼠腎小管細(xì)胞的自噬，這加劇了細(xì)胞凋亡；而擬鈣劑NPS R-467激活鈣敏感受體CaSR后，恢復(fù)了胞內(nèi)鈣離子的動態(tài)平衡和自噬，對減輕鎘引起的腎小管細(xì)胞毒性也發(fā)揮了作用[25]。

鎘會破壞細(xì)胞內(nèi)的多種途徑，如活性氧和ROS途徑[64]、細(xì)胞自噬途徑[65]、未折疊蛋白質(zhì)應(yīng)答反應(yīng)(UPR)途徑[66]、線粒體介導(dǎo)的Caspase依賴性和非Caspase依賴性途徑[67]等。這些途徑與鈣離子穩(wěn)態(tài)及鈣離子信號具有緊密的聯(lián)系。維持好鈣離子動態(tài)平衡或可阻滯鎘誘導(dǎo)的這些途徑，對減輕鎘誘導(dǎo)的腎毒性具有一定的保護(hù)作用。

4 展望

鎘是一種環(huán)境污染物，鎘暴露與腎臟疾病[68]、骨質(zhì)疏松癥和骨折[69]、動脈粥樣硬化[70]和心血管疾病有關(guān)[71]。鎘進(jìn)入人體后主要積聚于腎臟。在腎臟中，鎘主要貯存在腎小管細(xì)胞中，引發(fā)腎臟受損，加之致癌特性，在一定條件下會導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞癌變[72]。

鎘引起腎小管上皮細(xì)胞的鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡：一方面，鎘通過調(diào)節(jié)腎細(xì)胞膜上的鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道，增加鈣離子流入，阻止鈣離子流出，導(dǎo)致胞內(nèi)鈣離子濃度劇增。另一方面，鎘激活PLC-IP3信號通路促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子通過流出通道IP3R流入胞漿；同時(shí)，鎘抑制SERCA阻止胞漿中的鈣離子回流入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫。由此加劇內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。針對該過程，早前在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，使用一些鈣離子信號通路抑制劑和螯合劑可減輕鎘誘導(dǎo)的腎毒性。目前，通過調(diào)控可動態(tài)調(diào)節(jié)鈣離子動態(tài)平衡的作用靶點(diǎn)，而不是簡單的抑制和螯合，或可更有效地防治重金屬等誘導(dǎo)的腎臟受損，并減少副作用，其作用機(jī)理仍在深入發(fā)掘中。這些研究為鎘和其他重金屬或其他應(yīng)激所引發(fā)的毒性機(jī)制相關(guān)研究與人類健康的后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)并提供了新方向。