大腸桿菌生物膜形成特性及控制措施的研究進展

吳麗娜，董鵬程，張一敏，毛衍偉，梁榮蓉，朱立賢,*，羅 欣,2

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018；2.江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095）

大腸桿菌（Escherichia coli）根據(jù)致病性通常分為兩大類：腸內(nèi)大腸桿菌和腸外大腸桿菌。腸內(nèi)大腸桿菌基于其引起的疾病、毒力因子等可分為8 個亞組。這8 種致病型大腸桿菌分別是：與克羅恩氏病相關(guān)的黏附侵襲性大腸桿菌、彌散附著性大腸桿菌、腸聚集性大腸桿菌、腸毒素性大腸桿菌、腸致病性大腸桿菌、腸毒性大腸桿菌、腸侵入性大腸桿菌（包括志賀菌屬）和產(chǎn)生志賀毒素的腸聚集性大腸桿菌[1-2]。腸毒性大腸桿菌具有多種血清型，大腸桿菌O157:H7是其中最典型的一種血清型，其感染劑量低、致病力強、危險性大、臨床癥狀嚴重，其污染和危害已成為全球性廣泛關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。大腸桿菌O157:H7可引起人感染性腹瀉、出血性結(jié)腸炎（hemorrhagic colitis，HC）和溶血性尿毒綜合征（haemolytic-uraemic syndrome，HUS）等疾病，嚴重時可致人死亡[3-4]。食品可以作為大腸桿菌O157:H7污染的源頭，例如牛肉、乳品等都可以作為大腸桿菌O157:H7的載體[3]。在過去的30多年中，我國從牛肉及其相關(guān)產(chǎn)品中分離出的160多種血清型大腸桿菌中，有79 種引發(fā)過人類疾??；從牛的糞便中分離出373 種血清型，有127 種引發(fā)過人類疾病[4]。Sharapov等發(fā)現(xiàn)在感染大腸桿菌O157:H7的176 例患者中，161 例（91%）是由于食用被污染的菠菜從而引起疾病感染[5]。Atnafie等對150 頭健康的待宰牛共630 個樣本進行了大腸桿菌O157:H7鑒定，發(fā)現(xiàn)有15 個樣品呈陽性，總體檢出率為2.4%[6]。其他血清型的大腸桿菌也曾引起嚴重疫情爆發(fā)，2011年德國爆發(fā)的大腸桿菌O104感染，波及16 個國家，近4 000 人感染，其中54 例死亡，22%的患者發(fā)生溶血性尿毒綜合征[7]。Paquette等對加拿大西部牛糞中大腸桿菌O178的流行率進行了調(diào)查，普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)果顯示1 773 個樣品中有873 個檢測出大腸桿菌O178[8]。

生物膜是指微生物為了適應(yīng)環(huán)境，黏附于非生物或活性組織表面，分泌大量的多糖、蛋白質(zhì)和核酸等不均一的胞外基質(zhì)，將菌體自身包裹在其中而形成的大量菌體聚集膜狀物，是菌體在自然界中一種常見的生存狀態(tài)，直接影響著人類生產(chǎn)和生活的各個方面[9]。食品腐敗菌以及食源性致病菌常常通過形成生物膜附著在食品、食品加工設(shè)備、包裝材料等表面，難以殺滅與清除，從而形成持續(xù)性的污染，產(chǎn)生食品安全隱患，造成巨大的經(jīng)濟損失[10-11]。大腸桿菌O157:H7、沙門氏菌、李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌等食源性致病菌，均可在食品或食品器具表面形成生物膜[12-13]。

大腸桿菌的生物膜形成經(jīng)歷可逆黏附、不可逆黏附、成熟、分散4 個階段，在不同時期，其組成比例、結(jié)構(gòu)形態(tài)、耐藥性和清理難易程度都不同。在形成生物膜的過程中，首先菌體可逆地附著于表面，相互聚集，隨著菌體繼續(xù)生長繁殖，細菌與表面產(chǎn)生強烈的相互作用，發(fā)生不可逆的附著，細菌從浮游狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣潭顟B(tài)，然后細菌繼續(xù)繁殖并產(chǎn)生胞外基質(zhì)，胞外基質(zhì)被大量分泌。最后，細菌從成熟狀態(tài)變?yōu)榉稚顟B(tài)，尋找新的表面定植。大腸桿菌O157:H7可以通過形成生物膜的復(fù)雜細胞群落而定植在生物和非生物表面，并對細菌形成一層保護層，這種現(xiàn)象對于食品工業(yè)來說應(yīng)引起重視，因為原材料的洗滌處理及設(shè)備衛(wèi)生的清潔和消毒程序可能對此無效。在食品加工工廠中，牛肉胴體污染通常發(fā)生在不同的加工階段，這與加工時設(shè)備表面形成的生物膜有關(guān)[14]。生物膜增強細菌對外界不良環(huán)境抗性的能力，更增加了大腸桿菌O157:H7在食品加工過程中的交叉污染。根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院統(tǒng)計，大約有65%的微生物感染和80%的慢性感染與生物膜有關(guān)[15]。因此，研究生物膜形成和發(fā)展的分子機制以及尋找有效的生物膜控制和清除策略是目前研究的重點。本文在前期學(xué)者研究的基礎(chǔ)上，綜述了大腸桿菌生物膜的形成機制及影響因素，并提出了一些消減措施，以期對大腸桿菌生物膜的控制提供一定幫助。

1 大腸桿菌生物膜形成的分子機制

大腸桿菌生物膜形成的遺傳機制是一個復(fù)雜的過程，涉及到許多相關(guān)的途徑以及基因，需要復(fù)雜和協(xié)調(diào)一致的調(diào)控，以在空間和時間上實現(xiàn)高效率。

1.1 基于細菌黏附的形成機制

細菌具有多種黏附機制，這是生物膜形成的初始步驟，大腸桿菌通過特異性毒力因子如卷曲菌毛、鞭毛、I型菌毛、黏附素等附著于非生物和生物表面是開始附著和生物膜形成的關(guān)鍵步驟。

鞭毛的驅(qū)動力與生物膜形成有關(guān)，是生物膜初始形成階段所必需的，它可以使細菌運動，并具有克服生物或非生物表面和細胞之間可能存在靜電斥力的能力。CsrA控制著多種生理過程，如碳代謝、生物膜形成、運動、群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）、上皮細胞侵襲和毒力因子的產(chǎn)生[16]。Wang Shaomeng等通過RNA-seq分析顯示，與大腸桿菌O157:H7野生型菌株相比，參與鞭毛生物合成的53 個基因在csrA::kan突變體中的檢出率顯著降低，這些差異調(diào)節(jié)的基因包括合成鞭毛所需的基因以及鞭毛基因表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。在對大腸桿菌O157:H7野生型菌株、csrA::kan突變體、csrA補充菌株和csrA過表達菌株在半固體LB瓊脂上的運動性研究中發(fā)現(xiàn)突變體不能產(chǎn)生生長暈，而csrA的過表達導(dǎo)致細菌運動增強，證明csrA可以調(diào)控大腸桿菌O157:H7的鞭毛生物合成和運動[17]。

卷曲菌毛是一種不同長度的薄而盤繞的纖維，它們在細胞外聚集形成無定形基質(zhì)，參與定植和生物膜的發(fā)育，有助于大腸桿菌O157:H7在不銹鋼表面的附著[18]，在附著過程中，基于轉(zhuǎn)錄分析，調(diào)控卷曲菌毛產(chǎn)生的基因被上調(diào)，從而為不利環(huán)境中生存的菌株提供保護[19]。卷曲菌毛是高度黏附的功能性淀粉類似物，由不同轉(zhuǎn)錄的csgBAC和csgDEFG操縱子編碼，通過促進最初的細菌-基質(zhì)相互作用和隨后的細胞-細胞聚集而在生物膜形成中起重要作用[20]。CsgD可以促進大腸桿菌從浮游生物轉(zhuǎn)化為生物膜的存在形式[21]。在生物膜狀態(tài)，調(diào)節(jié)生物膜形成的CsgD（卷曲菌毛基因的正調(diào)節(jié)子）、BssR（生物膜形成調(diào)節(jié)蛋白）、FlhDC（轉(zhuǎn)錄激活因子）表達上調(diào)，QseB（轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子）、YkgK（動力負調(diào)節(jié)器）、Bdm（生物膜依賴性調(diào)節(jié)蛋白）表達下調(diào)[22]。其中，F(xiàn)lhDC和CsgD調(diào)控驅(qū)動力和卷曲菌毛的產(chǎn)生，Hha調(diào)控FlhDC和CsgD，F(xiàn)lhDC和CsgD調(diào)控生物膜卷曲菌毛基因的表達，影響在大腸桿菌O157:H7中生物膜的形成，與野生型菌株相比，hha突變體在30 ℃和37 ℃下形成大量的生物膜[23]。Carter等發(fā)現(xiàn)卷曲菌毛使大腸桿菌O157:H7在菠菜葉和不銹鋼表面的初始附著量顯著增加5 倍，而在LB無鹽肉湯中玻璃上的生物膜生成量增加了19～27 倍[18]。

I型菌毛也在大腸桿菌的黏附中起著重要作用，fim基因編碼的I型菌毛可以促進細菌在表面的黏附，還可以通過增強細胞與表面的相互作用提供對非生物表面的黏附力，促進細胞與細胞的通訊[24]。

但是關(guān)于黏附素分泌信號的性質(zhì)或不同類型黏附素之間的相互作用，支持或調(diào)節(jié)黏附素與表面之間相互作用的確切分子機制仍然尚不明確，加強對黏附素黏附特性的理解對控制細菌表面附著十分重要。

1.2 基于胞外多糖的形成機制

細菌在表面黏附后會分泌胞外多糖，可作為調(diào)節(jié)薄膜及在非生物表面（不銹鋼等）上的黏合劑，從而影響細胞附著和形成生物膜結(jié)構(gòu)[25]。大腸桿菌生物膜含有3 種主要的胞外多糖：β-1,6-N-乙酰-D-葡糖胺聚合物（β-1,6-N-acetyl-D-glucosamine polymer，PGA）、纖維素和莢膜異多糖酸[24]。

PGA通過介導(dǎo)細胞間黏附和附著到生物或非生物表面幫助生物膜形成，可以作為穩(wěn)定大腸桿菌生物膜的黏附素。大腸桿菌pgaABCD操縱子編碼包括參與PGA聚合物的合成、運輸和定位的PgaC糖基轉(zhuǎn)移酶的蛋白質(zhì)[22]。Kang Jiamu等發(fā)現(xiàn)可以通過抑制pgaABCD基因來抑制大腸桿菌生物膜的形成[26]。

纖維素的合成是生物膜形成的原因之一。Uhlich等發(fā)現(xiàn)纖維素產(chǎn)生與生物膜形成相關(guān)，然而，纖維素產(chǎn)生是可變的，并且取決于細菌菌株和環(huán)境條件[27]。Park等發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生相對較低量纖維素的菌株在其接觸表面上產(chǎn)生較少的生物膜[28]。

莢膜異多糖酸在細菌周圍形成莢膜并保護它們免受特定的環(huán)境條件影響，它的產(chǎn)生可以保護大腸桿菌O157:H7免于滲透和氧化應(yīng)激，這表明莢膜異多糖酸可能與大腸桿菌O157:H7生物膜形成有關(guān)[29]。Lord等的研究表明MqsR控制的莢膜異多糖酸和生物膜調(diào)節(jié)劑（McbR，也稱為YncC）是早期大腸桿菌生物膜發(fā)育中高度誘導(dǎo)基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，并被認為是阻斷生物膜形成的靶標(biāo)[30]。mcbR的缺失導(dǎo)致莢膜異多糖酸過量產(chǎn)生，因此導(dǎo)致生物膜形成量的減少[31]。Vogeleer等也發(fā)現(xiàn)，莢膜異多糖酸可以通過掩蓋抗原43和AidA，顯示出對生物膜形成的抑制作用[14]。

1.3 基于QS系統(tǒng)的形成機制

細菌通常通過被稱為QS的細胞-細胞信號傳導(dǎo)機制相互溝通，QS是生物膜發(fā)育過程中的主要行為者[32]。這種細菌細胞間信號傳導(dǎo)涉及稱為自誘導(dǎo)物（autoinducer substances，AI）的細胞外信號分子的產(chǎn)生、檢測和響應(yīng)。細菌分泌AI到細胞外環(huán)境，當(dāng)達到所需的濃度時，促進生物膜形成。QS是細菌用來溝通和協(xié)調(diào)其行為和功能的過程，像多細胞生物一樣，它也控制生物膜形成和成熟過程中的基因表達。一旦AI達到一定濃度，就會與調(diào)節(jié)毒力因子基因表達的調(diào)節(jié)蛋白相互作用，并增加運動性、菌毛和熱不穩(wěn)定毒素的表達[33]。

在革蘭氏陰性菌中，AI-1（N-?；呓z氨酸內(nèi)酯）和AI-2（呋喃糖基硼酸二酯）兩種AI都存在。AI-1調(diào)節(jié)系統(tǒng)由兩個結(jié)構(gòu)基因組成：luxI編碼AI-1合酶和luxR編碼AI-1應(yīng)答調(diào)節(jié)子。LuxI和LuxR同系物存在于各種革蘭氏陰性菌中，并控制從毒力到生物膜形成的許多過程[24]。大腸桿菌中不能合成N-?；呓z氨酸內(nèi)酯，但其基因組可以編碼SdiA，SdiA是AI-1傳感器，可以編碼LuxR的同源蛋白，大腸桿菌可以通過編碼SdiA上調(diào)uvrY和csrA基因，增強大腸桿菌的生物膜形成、運動性和毒力[34]。

AI-2的合成途徑涉及兩個酶促步驟：5'-甲基硫代腺苷核酸酶或S-腺苷高半胱氨酸核酸酶催化S-腺苷高半胱氨酸轉(zhuǎn)化為S-核糖高半胱氨酸和腺嘌呤；然后AI-2合成酶（LuxS）將S-核糖高半胱氨酸轉(zhuǎn)化為高半胱氨酸和4,5-二羥基-2,3-戊二酮[35]。Jani等發(fā)現(xiàn)缺乏AI-2結(jié)合蛋白LsrB和化學(xué)感受器Tsr的大腸桿菌更不容易自聚集和形成表面黏附結(jié)構(gòu)[36]。此外，AI-2對腸出血性大腸桿菌的趨化性吸引受兩種受體的調(diào)節(jié)：用于運動的表型功能、介導(dǎo)細胞基質(zhì)附著和生物膜形成的LsrB和LsrR[37]，LsrR可以通過直接結(jié)合lsr啟動子區(qū)域內(nèi)的兩個LsrR結(jié)合框來抑制操縱子和其自身的轉(zhuǎn)錄[38]。AI-2在革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌中的信號傳導(dǎo)特性增加了對不同環(huán)境條件的適應(yīng)性、黏附能力以及生物膜形成量。由于AI-2在細菌中廣泛存在，因此從這一途徑入手成為研究生物膜的熱點之一。

此外，也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)qseBC編碼的QS系統(tǒng)調(diào)節(jié)大腸桿菌O157:H7對細菌AI-3、哺乳動物應(yīng)激激素腎上腺素和去甲腎上腺素應(yīng)答的運動性。qseC編碼感應(yīng)激酶響應(yīng)于AI-3、哺乳動物應(yīng)激激素腎上腺素或去甲腎上腺素而自磷酸化，隨后使其同源響應(yīng)調(diào)節(jié)劑QseB磷酸化。在沒有QseC的情況下，QseB會下調(diào)動物模型中的細菌動力和毒力[39]。而且，與野生型培養(yǎng)相比，qseC缺失菌株的運動性和生物膜形成量降低了一半[40]。

2 影響大腸桿菌生物膜形成的因素

生物膜的形成受到許多因素的影響，比如菌株特性、黏附材料特性以及pH值、溫度、營養(yǎng)條件和其他條件等，尤其是在食品加工中，所處環(huán)境更是復(fù)雜多樣。

2.1 菌體特性

有研究顯示菌株特性如自聚性、泳動性、疏水性會顯著影響細菌的成膜能力，而且生物膜形成能力是高度依賴于菌株的，并且與細胞外聚合物結(jié)構(gòu)的細胞表面表達有關(guān)[41]。此外，血清型也能夠影響菌株的黏附性能，例如，Wang Rong等對大腸桿菌O157:H7與Non-O157在玻璃表面氣-液界面上成膜效力的研究發(fā)現(xiàn)，Non-O157表現(xiàn)出更高的成膜效力[42]。但是也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)生物膜形成在產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌菌株之間具有很大的變異性，并且不能與特定的脈沖型相關(guān)，甚至不與血清型或毒力基因存在相關(guān)性[43]。

2.2 生存環(huán)境

菌體的生存環(huán)境對生物膜有很大的影響，生存環(huán)境中的營養(yǎng)條件、pH值、離子種類與含量以及溫度和時間等因素都影響著生物膜的形成。在食品加工過程中，不同工序所處的溫度不同，對大腸桿菌O157:H7生物膜形成有影響，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)大腸桿菌在30 ℃和37 ℃時生物膜形成能力比在25 ℃高，在較高的溫度下會促進生物膜的形成[27]。不僅溫度影響生物膜的形成，菌株所處環(huán)境的營養(yǎng)條件不同，形成的生物膜數(shù)量也不一致。Beauchamp等研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌O157:H7在胰蛋白胨大豆肉湯、牛肉脂肪/瘦肉組織勻漿、輸送帶沖洗液、碎牛肉、牛肉脂肪等生長基質(zhì)中的黏附量不同，牛肉脂肪上黏附量最大，其次是碎牛肉、牛肉脂肪/瘦肉組織勻漿、胰蛋白胨大豆肉湯、輸送帶沖洗液，這可能是由于基質(zhì)中營養(yǎng)物質(zhì)的組成與含量的差別所致[13]。另外，附著基因（adrA、bapA、csgB、csgD和csrA）的相對表達水平也受到生長培養(yǎng)基類型的影響，這也表明生物膜形成的機制與細胞的生長環(huán)境有關(guān)[44]。大多數(shù)關(guān)于生存環(huán)境對生物膜形成的研究是在實驗室中以標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基（如胰蛋白胨大豆肉湯、LB培養(yǎng)基等）為生長基質(zhì)，并不能很好地模擬工廠實際生產(chǎn)條件，關(guān)于這方面的研究還有待加強。

2.3 接觸面

食品加工接觸面的材質(zhì)也是影響細菌黏附的關(guān)鍵因素，不同的表面特性會顯著影響菌體的黏附效果。Carter等發(fā)現(xiàn)大腸桿菌O157:H7菌株在不銹鋼、玻璃、塑料上生物膜形成能力并不相同[18]。聚合物表面的疏水性顯著影響生物膜形成的動力學(xué)和結(jié)構(gòu)，在聚偏二氟乙烯的疏水表面上快速形成均勻、平坦和薄的生物膜，親水性表面的聚乙烯醇防止細菌黏附和生物膜形成；然而，在200 h的長期孵育中形成局部粗糙和厚的生物膜，中等疏水性的聚醚砜在68 h時觀察到粗糙和厚的生物膜，并且其厚度和覆蓋度隨著孵育時間延長而增加[45]。另有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在不同的接觸面上，大腸桿菌O157:H7對氯化氫和二氧化氯兩種殺菌劑的抗性不同，以木材＞塑料＞玻璃＞不銹鋼的順序增加[46]。這表明在不同的接觸面生物膜形成能力不同，而且對消毒劑的抗性也不同，選擇適當(dāng)類型的食品接觸表面，確定合適的消毒劑對抑制大腸桿菌的生長非常有效。

2.4 其他細菌的拮抗作用

關(guān)于單一細菌生物膜的研究已有較多，許多學(xué)者開始研究混合菌種的相互作用。食品加工環(huán)境中存在各種各樣的細菌物種，它們可以在接觸面上形成生物膜，但表面相關(guān)的群落通常是不同物種的復(fù)雜關(guān)聯(lián)，有著不同的相互作用方式，這種相互作用在形成生物膜結(jié)構(gòu)中起著關(guān)鍵作用，并對特定功能負責(zé)。Visvalingam等發(fā)現(xiàn)將大腸桿菌O157:H7與沙門氏菌或其他大腸桿菌共同培養(yǎng)時會產(chǎn)生拮抗作用，這可能部分歸因于它們密切相關(guān)的營養(yǎng)需求，當(dāng)營養(yǎng)物質(zhì)有限時會導(dǎo)致競爭，產(chǎn)生有毒代謝物如大腸菌素等抑制性物質(zhì)[47]。但是也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)大腸桿菌O157:H7和石竹伯克霍爾德氏菌（Burkholderia caryophylli）、危險羅爾斯頓菌（Ralstonia insidiosa）這類生物膜形成能力強的細菌在生物膜形成中發(fā)生協(xié)同作用[48]。

3 大腸桿菌生物膜的控制措施

大腸桿菌生物膜可以在食品設(shè)備表面形成，降低消毒劑的有效性。而且因為生物膜的脫落，細菌會釋放到食品或加工環(huán)境中，對設(shè)備上的生物膜進行徹底地去除特別困難。生物膜不僅可以保護工業(yè)設(shè)施中的細菌，增加對臨床抗生素和殺菌劑的抵抗力，而且還可以幫助細菌抵抗人體的免疫清除效果。20多年來，國內(nèi)外學(xué)者一直致力于研究有效的生物膜靶向治療。但是，由于生物膜不是由同代微生物菌落形成的單層細胞結(jié)構(gòu)，而是由在時間和空間上世代交替的菌落共殖，因此對于細菌具有強保護作用，需要采取有效的預(yù)防和消除生物膜措施。

3.1 化學(xué)殺菌

在屠宰場或食品加工廠，大多使用乳酸、過氧乙酸、季銨鹽類消毒液、二氧化氯、乙醇等進行消毒殺菌處理，其可以對生物膜起到一定的抑制作用，但并不能使生物膜完全滅活，菌株消毒處理后在不同的水平上表現(xiàn)出恢復(fù)生長的跡象[49]，且長期使用可能會使細菌產(chǎn)生抗性[50]。Park等在分別用體積分數(shù)2%乙酸、乳酸和酸性消毒劑（活性成分是磷酸）、堿性消毒劑（活性成分是氫氧化鉀、磷酸和次氯酸鉀）對聚苯乙烯和不銹鋼表面的生物膜處理后，菌株沒有得到完全去除，這可能是由于生物膜和所用試劑之間的接觸時間不足或試劑對生物膜表面區(qū)域的不適當(dāng)覆蓋造成的[28]。也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)細菌生物膜的胞外結(jié)構(gòu)可能會限制氯處理功效[51]。生物膜的剛性網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)使得消毒劑難以進入關(guān)鍵的目標(biāo)區(qū)域，并且生物膜基質(zhì)可以中和氯等不穩(wěn)定的消毒劑，從而減弱消毒劑的消毒效果[52]。另外Corcoran等發(fā)現(xiàn)生物膜對次氯酸鈉、氫氧化鈉和苯扎氯銨這些試劑的敏感性與生物膜的形成時間有關(guān)，因為隨著生物膜成熟度的增加，試劑通過生物膜三維結(jié)構(gòu)的擴散效率會降低[53]。因此，應(yīng)該在早期進行適當(dāng)?shù)叵?，以防止生物膜成熟?/p>

3.2 QS系統(tǒng)抑制劑

QS系統(tǒng)在生物膜形成過程中發(fā)揮重要作用，尋找能夠阻斷QS系統(tǒng)信號的物質(zhì)有利于抑制生物膜的形成。目前有很多學(xué)者對關(guān)于從QS方向抑制生物膜形成進行了研究。吲哚可以通過QS調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子SdiA降低大腸桿菌生物膜，sdiA突變可以使生物膜形成量增加50 倍[54]。從楝樹種子制備的粗提取物可通過干擾由SdiA調(diào)節(jié)的QS途徑來抑制大腸桿菌中的生物膜形成和群集運動，當(dāng)培養(yǎng)基中添加30 mg/mL的乙醇提取物時，發(fā)現(xiàn)生物膜形成量和群集運動能力分別被抑制92.1%和48.52%[55]。據(jù)報道，泡菜乳酸桿菌NR28也可以抑制AI-2信號途徑[56]。雖然這方面的研究有很多，但是大多數(shù)都是關(guān)于單一菌株的研究，而從實際加工環(huán)境來說，對混合菌株的研究還很少，對混合菌膜的QS系統(tǒng)還不是很明確。

3.3 植物提取物

植物提取物在防止生物膜形成和抑制現(xiàn)有的生物膜方面顯示出巨大的潛力，其因生物膜出現(xiàn)抗生素抗性而被開發(fā)作為常規(guī)抗生素的替代品。作為生物活性分子和可持續(xù)來源的綠色植物已經(jīng)被用于治療許多疾病和研發(fā)通過靶向細菌QS系統(tǒng)、基因抑制和減少表面結(jié)構(gòu)產(chǎn)生抑制生物膜的新藥物[57]。0.01%（體積分數(shù)）的肉桂皮油、肉桂醛和丁香酚能夠顯著降低大腸桿菌O157:H7的生物膜形成，轉(zhuǎn)錄分析顯示肉桂皮油下調(diào)腸毒性大腸桿菌中的卷曲菌毛基因和志賀毒素基因stx2[58]。銀杏酸和銀杏提取物可以通過下調(diào)卷曲菌毛和原噬菌體基因顯示出對大腸桿菌O157:H7生物膜形成的顯著抑制作用[59]。從具有抗病毒和抗微生物特性的植物中分離的生物活性化合物香豆素和香草酮，可以通過抑制卷曲菌毛和運動基因減少大腸桿菌O157:H7群集運動、菌毛產(chǎn)生和生物膜形成的能力[60]。精油是來自植物材料的芳香油性液體，在體外實驗中發(fā)現(xiàn)精油可以抑制大腸桿菌和沙門氏菌菌株的生物膜形成，而且單一精油的效果優(yōu)于混合精油[61]。在另一項研究中，Maisuria等對富含酚類物質(zhì)的楓糖漿提取物進行了包括大腸桿菌在內(nèi)的致病菌的抗菌膜活性的測試，轉(zhuǎn)錄組分析揭示富含酚類物質(zhì)的楓糖漿提取物有效地抑制多種耐藥基因和與運動、黏附和生物膜形成相關(guān)的基因表達[62]。

3.4 物理殺菌

除了以上措施之外，其他方法也可以減少生物膜的形成。例如，使用極低頻電磁場、超聲波去除細菌生物膜[63-64]。除此之外，等離子體對于大腸桿菌O157:H7生物膜也有較好的清除作用，有學(xué)者研究表明在作用功率500 W、連續(xù)作用4 min時，生物膜清除率達到99.99%；且激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，在等離子體作用后，菌落數(shù)量和細菌生物膜厚度比對照組小，場發(fā)射掃描電子顯微鏡的觀察結(jié)果也顯示等離子組處理后細菌群落附著量顯著減少[65]。

目前關(guān)于消毒劑對大腸桿菌生物膜控制及其機理方面的研究尚不深入，且長期使用可能會使細菌產(chǎn)生抗性，而一些植物精油或是其他天然提取物由于價格等方面的因素，目前還不能大規(guī)模的工業(yè)化應(yīng)用，因此，亟待開發(fā)并深入研究能夠應(yīng)用于食品領(lǐng)域的新的控制生物膜的手段。

4 結(jié) 語

生物膜形成是細菌在不利環(huán)境條件下生存的重要手段，對食品、醫(yī)療、環(huán)境、機械等方面有著顯著的影響，而且生物膜細菌對抗微生物劑具有高度的耐受性，難以根除。在食品加工過程中，生物膜一旦附著，很容易從上游產(chǎn)品污染下游產(chǎn)品，造成整個加工過程的污染，但在工廠中清除生物膜的相應(yīng)手段還很少。大腸桿菌生物膜的形成是一個復(fù)雜的過程，涉及多種蛋白、核酸和多糖等因素，同時也受到各種調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的共同作用。目前對與大腸桿菌生物膜形成相關(guān)的多糖、生物膜成熟過程的調(diào)控機制等方面的研究相對缺乏。研究環(huán)境因素對大腸桿菌生物膜基質(zhì)組成的影響，通過觀察環(huán)境因素對生物膜中蛋白質(zhì)、胞外多糖、胞外DNA組成的影響，進一步探究大腸桿菌生物膜的形成機制。對生物膜形成的營養(yǎng)多樣性和生長條件的研究有助于設(shè)計有效的抗生物膜措施。同時，深入研究大腸桿菌生物膜形成和調(diào)控的分子機制對尋找特異性干預(yù)或檢測靶點及評估其危害風(fēng)險具有重要意義。