超高效液相色譜法測定紫錐菊根末中單咖啡酰酒石酸和菊苣酸的含量

魏秀麗,張志民,張傳津*,李有志,李美娣

（1.山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所，濟(jì)南250022；2.山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測與風(fēng)險(xiǎn)評估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南250022；3.廣州華農(nóng)大實(shí)驗(yàn)獸藥有限公司，廣州510642）

紫錐菊（Echinacea purpurea）是原產(chǎn)美洲的一類菊科植物，因其具有顯著的免疫刺激功效，是目前國際上普遍關(guān)注的一種免疫促進(jìn)劑和免疫調(diào)節(jié)劑。紫錐菊根末為國家二類新中獸藥，是由紫錐菊的根，經(jīng)揀選洗凈干燥粉碎過篩制備的粉末，藥理研究表明，其活性物質(zhì)主要包括咖啡酸衍生物、多糖、烷基酰胺類成分，根據(jù)新獸藥相關(guān)技術(shù)要求對其進(jìn)行了藥學(xué)、藥理毒理和臨床研究[1－3]，證明其安全、有效，在提高豬、雞免疫功能方面具有顯著的臨床效果[4－6]，并對肉質(zhì)和口感具有一定的改善作用。紫錐菊根末中活性成分主要包括單咖啡酰酒石酸、菊苣酸，還有少量的綠原酸和咖啡酸，在豬、雞臨床上經(jīng)飼料拌勻的方式給藥，安全有效。美國、英國、歐洲藥典和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2171號公告關(guān)于紫錐菊根末含量測定均采用普通高效液相色譜方法[1，7－11]，檢測時(shí)間長。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了超高效液相色譜－紫外檢測法測定紫錐菊根末中單咖啡酰酒石酸和菊苣酸含量的方法學(xué)研究。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑 菊苣酸對照品，批號11152－201703，含量97.6%，中國食品藥品檢定研究院。單咖啡酰酒石酸對照品，批號 18101022，含量98%，上海同田生物技術(shù)有限公司。乙腈、磷酸均為色譜純；乙醇分析純；超純水。紫錐菊根末，產(chǎn)地來自廣東、云南、河北，分別作為樣品1、樣品2、樣品3，除去藥材中殘留的泥沙、葉子、莖等，水洗至無雜物，40℃以下干燥至含水量低于6%，粉碎過5號篩，置V型混合機(jī)中混合10 min，分裝。

1.2 儀器 分析天平:感量0.00001 g；Waters AcquityTMUltra performance LC超高效液相色譜儀；waters2695高效液相色譜儀。

1.3 方法

1.3.1 供試品溶液制備 取本品粉末（過5號篩）約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，稱定重量，加熱回流15 min，取出，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備 精密稱取單咖啡酰酒石酸對照品、菊苣酸對照品適量，精密稱定，加70%乙醇分別制成每1 mL含單咖啡酰酒石酸400μg、菊苣酸100μg的溶液，即得。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備 取4 mL菊苣酸儲備液和0.5 mL單咖啡酰酒石酸儲備液，加3.5 mL 70%乙醇，制成每1 mL含單咖啡酰酒石酸25μg、菊苣酸50μg的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

依次倍比稀釋得一系列標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液:20μg/mL單咖啡酰酒石酸 40μg/mL菊苣酸、10μg/mL單咖啡酰酒石酸 20μg/mL菊苣酸、5μg/mL單咖啡酰酒石酸10μg/mL菊苣酸、2μg/mL單咖啡酰酒石酸4μg/mL菊苣酸、1μg/mL單咖啡酰酒石酸2μg/mL菊苣酸、0.5μg/mL單咖啡酰酒石酸1μg/mL菊苣酸。

1.3.4 色譜操作條件及參數(shù) 色譜柱:C18色譜柱（2.1 mm ×100 mm，1.7 μm）；流動相 A:乙腈；流動相B:0.4%磷酸水溶液，進(jìn)行梯度洗脫；流速:0.35 mL/min；進(jìn)樣量:1 μL；柱溫:35 ℃，進(jìn)樣室溫度10℃。二極管陣列檢測器，檢測波長為330 nm。液相色譜梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫條件表Tab 1 Gradient elution condition

1.3.5 重復(fù)性試驗(yàn)和精密度試驗(yàn) 精密吸取單咖啡酰酒石酸對照品溶液和菊苣酸對照品溶液，制成每1 mL含單咖啡酰酒石酸10μg、菊苣酸20μg的混合對照品溶液，重復(fù)配置6份，進(jìn)樣，計(jì)算單咖啡酰酒石酸、菊苣酸峰面積RSD。精密吸取單咖啡酰酒石酸對照品溶液和菊苣酸對照品溶液，制成每1 mL含單咖啡酰酒石酸10μg、菊苣酸20μg的混合對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算單咖啡酰酒石酸、菊苣酸峰面積RSD。

1.3.6 檢測限和定量限的測定 對單咖啡酰酒石酸、菊苣酸的標(biāo)準(zhǔn)工作液，進(jìn)行UPLC的分析，并逐級降低其濃度，以溶液檢測時(shí)的信噪比（S/N）分別大于等于3和10作為藥物的檢測限和定量限。

1.3.7 不同色譜條件樣品檢測比較 使用高效液相色譜儀和超高效液相色譜儀在不同的色譜條件下運(yùn)行，對同一樣品中兩主成分單咖啡酰酒石酸、菊苣酸的含量和出峰時(shí)間分別進(jìn)行比較。

1.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 進(jìn)樣室溫度設(shè)置到10℃。取“1.3.5”項(xiàng)下10μg/mL單咖啡酰酒石酸20μg/mL菊苣酸溶液，在 10 ℃ 放置 3、6、12、24 h，各進(jìn)樣1μL，計(jì)算單咖啡酰酒石酸、菊苣酸各自的峰面積RSD。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分離 在優(yōu)化的色譜條件下，測得單咖啡酰酒石酸、菊苣酸色譜峰峰形良好，且均達(dá)到基線分離，在1.3.4項(xiàng)條件下，菊苣酸、單咖啡酰酒石酸對照品和紫錐菊根末樣品待測液，色譜保留時(shí)間為2.02 min、6.92 min左右，分離度均滿足要求。

2.2 線性 在選定色譜條件下，使用梯度洗脫方法，可以有效分離目的峰，單咖啡酰酒石酸在0.5～25μg/mL范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y＝8.392668e2＋8.83837e3，R2＞0.999。 菊苣酸在1～50 μg/mL范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y＝1.938706e3＋1.281296e4，R2＞0.999。校正曲線結(jié)果見圖1和圖2。理論塔板數(shù):菊苣酸 83000～87000，單咖啡酰酒石酸51000～54000，分離度3.9～4.8，對稱因子1.18～1.27，拖尾因子1.10～1.13。

圖1 單咖啡酰酒石酸校正曲線Fig 1 Caftaric acid correction curve

圖2 菊苣酸校正曲線Fig 2 Chicory acid correction curve

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)和精密度試驗(yàn) 配制10μg/mL單咖啡酰酒石酸20μg/mL菊苣酸對照品溶液，重復(fù)配置6份，進(jìn)樣，計(jì)算單咖啡酰酒石酸、菊苣酸峰面積RSD為0.73%、0.66%，滿足實(shí)驗(yàn)要求。

取10μg/mL單咖啡酰酒石酸20μg/mL菊苣酸對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算落單咖啡酰酒石酸、菊苣酸峰面積RSD分別為0.33%、0.29%，滿足實(shí)驗(yàn)要求。

2.4 檢測限和定量限 0.5μg/mL單咖啡酰酒石酸1μg/mL菊苣酸對照品溶液S/N≥3為檢出限，1μg/mL單咖啡酰酒石酸2μg/mL菊苣酸對照品溶液S/N≥10為定量限。

2.5 不同色譜條件樣品檢測結(jié)果比較 使用waters超高效液相色譜儀和高效液相色譜儀，對同一樣品中兩主成分單咖啡酰酒石酸、菊苣酸的含量分別進(jìn)行了比較，結(jié)果見表2。

表2 不同色譜條件檢測結(jié)果表（n=6）Tab 2 Test results using different chromatographic method （n=6）

由于兩種色譜方法均已通過其方法學(xué)驗(yàn)證，均可以準(zhǔn)確控制其指標(biāo)成分。從檢測效率上看，優(yōu)選超高效法（UPLC）色譜圖見圖3－圖10。從樣品噪音和峰形分離度等方面來看，優(yōu)選超高效液相色譜儀條件，背景更干凈，與雜質(zhì)峰的分離度更好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按照實(shí)驗(yàn)方法，將對照品溶液貯存一段時(shí)間后，進(jìn)樣，所得到的圖譜中單咖啡酰酒石酸、菊苣酸峰面積RSD分別為0.47%、0.58%，說明樣品穩(wěn)定，滿足實(shí)驗(yàn)要求。

3 討論與小結(jié)

3.1 檢測波長的選擇 本研究將單咖啡酰酒石酸、菊苣酸的對照溶液利用PDA檢測器采集其光譜圖，在波長190～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)單咖啡酰酒石酸在330 nm處有最大吸收，菊苣酸在331 nm處有最大吸收，參考農(nóng)業(yè)部公告2171號紫錐菊根含量測定項(xiàng)中選用的波長330 nm，在本實(shí)驗(yàn)中選擇330 nm作為紫錐菊根末的檢測波長。光譜圖見圖11－圖13。

3.2 流動相流速的比較 超高效液相流動相的流速為0.35 mL/min，需要運(yùn)行12 min，每針運(yùn)行需要4.2 mL流動相；普通高效液相色譜儀器流速為1.5 mL/min，運(yùn)行時(shí)間35 min，每針運(yùn)行需要52.5 mL流動相。超高效液相色譜更節(jié)約實(shí)驗(yàn)耗材溶劑等，每運(yùn)行一針流動相節(jié)省38.3 mL。在廢液處理高成本的今天，超高效液相色譜方法更有優(yōu)勢，更經(jīng)濟(jì)和快捷。

圖3 10μg/mL單咖啡酰酒石酸20μg/mL菊苣酸對照品UPLC色譜圖Fig 3 Chromatogram of reference solution of 10 μg/mL caftaric acid and 20μg/mLchicoric acid

圖4 1μg/mL單咖啡酰酒石酸2μg/mL菊苣酸對照品UPLC色譜圖Fig 4 UPLC chromatogram of reference solution of 1 μg/mL caftaric acid and 2 μg/mLchicoric acid

圖5 樣品1 UPLC色譜圖Fig 5 UPLC chromatogram of sample 1

圖6 樣品1 HPLC色譜圖Fig 6 HPLC chromatogram of sample 1

圖7 樣品2 UPLC色譜圖Fig 7 UPLC chromatogram of sample 2

圖8 樣品2 HPLC色譜圖Fig 8 HPLC chromatogram of sample 2

圖9 樣品3 UPLC色譜圖Fig 9 UPLC chromatogram of sample 3

圖10 樣品3 HPLC色譜圖Fig 10 HPLC chromatogram of sample 3

圖11 單咖啡酰酒石酸菊苣酸混合對照品光譜圖Fig 11 Chromatogram of caftaric acid and chicoric acid mixture

圖12 樣品1光譜圖Fig 12 Chromatogram of sample 1

圖13 樣品2光譜圖Fig 13 Chromatogram of sample 2

3.3 原藥材主成分含量參差不齊 本實(shí)驗(yàn)選擇了三個(gè)產(chǎn)地的紫錐菊根末進(jìn)行含量測定，紫錐菊根末總含量隨原料產(chǎn)地變化，含量有一定波動，以及有效期內(nèi)含量變化，不同時(shí)期不同部位的菊苣酸含量存在差異，各部位菊苣酸含量在盛花期達(dá)最大值，紫錐菊采收期影響菊苣酸含量；而且一年生紫錐菊10月上旬（即秋季）盛花期采收的藥材對動物機(jī)體的免疫增強(qiáng)作用優(yōu)于其它采收期的藥材。并考慮大生產(chǎn)實(shí)際中藥材產(chǎn)地、采收時(shí)間、加工炮制等因素的影響，含量結(jié)果相差很遠(yuǎn)[12－14]，藥效也存在很大有差異。根據(jù)批準(zhǔn)的新獸藥紫錐菊根末標(biāo)準(zhǔn)，本品按干燥品計(jì)算，含單咖啡酰酒石酸和菊苣酸的總量不得少于0.50%，河北產(chǎn)地的藥材含主成分0.186%，不合格不能投入生產(chǎn)和使用，廣東和云南藥材含量均合格。所以，制定快速的篩選方法還是非常必要的。

綜上所述，使用超高效液相色譜法，對紫錐菊根末中單咖啡酰酒石酸和菊苣酸進(jìn)行定性和定量測定，方法快速，可以作為企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)方法，在原藥材供應(yīng)商的試驗(yàn)過程中，具備精準(zhǔn)快捷、經(jīng)濟(jì)環(huán)保的特點(diǎn)，有效控制紫錐菊根末的質(zhì)量。