石油降解菌產(chǎn)生物表面活性劑的研究進(jìn)展

李國(guó)麗,康小虎,翟立翔,冷 艷,劉夢(mèng)圓,李師翁

(蘭州交通大學(xué) 化學(xué)與生物工程學(xué)院 甘肅省極端環(huán)境微生物資源與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)科學(xué)院西北生態(tài)環(huán)境資源研究院 沙漠與沙漠化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070)

石油泄漏造成的環(huán)境污染事件屢見(jiàn)不鮮，石油污染過(guò)的土壤寸草不生，嚴(yán)重破壞生態(tài)系統(tǒng)，制約經(jīng)濟(jì)發(fā)展，影響人類健康，已經(jīng)引起了世界各國(guó)的高度關(guān)注，如何解決石油污染已經(jīng)成為迫切需要解決的社會(huì)問(wèn)題。

石油污染的清除方法主要包括物理法、化學(xué)法和生物法。物理法使用一些處理設(shè)備如圍墻、圍欄、撇油器、吸附材料來(lái)回收殘留油?；瘜W(xué)處理法通過(guò)添加一些分散劑和其他化學(xué)制品改變石油的物化性質(zhì)，加速石油分解。傳統(tǒng)的物理、化學(xué)方法不能達(dá)到很好的除油效果，還需要對(duì)含油廢物進(jìn)一步處理，增加后續(xù)處理負(fù)擔(dān)，而生物修復(fù)利用微生物的生長(zhǎng)代謝將石油轉(zhuǎn)化為無(wú)毒無(wú)害或者毒性較低的化合物，甚至直接分解為二氧化碳和水。生物修復(fù)有效性高、環(huán)境友好，而且操作簡(jiǎn)單，除油率高，適應(yīng)性強(qiáng)，并且可用于石油污染治理的微生物種類多，繁殖快，優(yōu)勢(shì)明顯。研究表明，能在石油污染物中生長(zhǎng)的微生物能產(chǎn)生生物表面活性劑，可以乳化油水混合物，從而有利于微生物在油滴中生長(zhǎng)。這類微生物也具有能降解環(huán)境中烴類化合物的基因和酶，能將石油中的烴類物質(zhì)降解，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)石油污染物的徹底清除。生物表面活性劑可促進(jìn)油的分散，增加微生物對(duì)油的代謝，添加生物表面活性劑有助于石油烴污染環(huán)境的修復(fù)，而土著菌株的降解性能優(yōu)于外來(lái)菌株，因此篩選出既能產(chǎn)生物表面活性劑又能高效降解石油烴的微生物已經(jīng)成為解決石油污染問(wèn)題的基礎(chǔ)和關(guān)鍵[1]。

1 生物表面活性劑的類型及其在石油降解上的應(yīng)用

生物表面活性劑是一類由細(xì)菌、真菌和酵母產(chǎn)生的具有嚴(yán)格親水和疏水基團(tuán)的細(xì)胞外表面活性物質(zhì)，大部分微生物產(chǎn)生的表面活性劑是復(fù)雜的分子，具有不同結(jié)構(gòu)。主要包括糖脂、脂肽、多糖蛋白復(fù)合物、脂肪酸和磷脂等(表1)。生物表面活性劑表面性能優(yōu)良，可降低溶劑表面張力和界面能量，穩(wěn)定乳化液增加泡沫，具有滲透、濕潤(rùn)、乳化、增溶、發(fā)泡、消泡、洗滌和去污等表面性能，熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性較好。

表1 生物表面活性劑的類型Table 1 Different types of biosurfactants

Kakinum等首次從枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)發(fā)酵液中提取的表面活性劑是目前效果最好的脂肽類表面活性劑之一，可將水的表面張力從72 mN/m降低至27 mN/m[6]，這一研究引起了人們對(duì)生物表面活性劑的密切關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬一般產(chǎn)脂肽類生物表面活性劑，脂肽類表面活性劑是由β-羥基脂肪酸和肽內(nèi)酯鍵結(jié)合構(gòu)成，一般是7肽[7]，這與Nitschke在木薯廢水中分離到的枯草芽孢桿菌產(chǎn)表面活性劑的結(jié)構(gòu)相一致。通過(guò)紅外光譜測(cè)定脂肽由谷氨酸、天冬氨酸、纈氨酸、亮氨酸組成，質(zhì)譜測(cè)得生物表面活性劑脂肽的氨基酸序列為R-Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu，這類生物表面活性劑都具有相似的化學(xué)組成和肽序列，為合成新型生物表面活性劑提供了理論依據(jù)。Parthipan研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)天然脂肽類表面活性劑的枯草芽孢桿菌可降解87%的石油，表明脂肽類表面活性劑對(duì)石油污染環(huán)境具有修復(fù)潛力[8]，但是目前脂肽類生物表面活性劑的研究相對(duì)較少，凈化石油污染環(huán)境的研究報(bào)告實(shí)為鮮見(jiàn)。另一類廣泛研究的表面活性劑為鼠李糖脂。鼠李糖脂具有去垢、發(fā)泡、乳化、破乳、增稠、形成泡囊等特性，常應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)材料和包裝材料的制作中，鼠李糖脂應(yīng)用于處理石油污染的土壤。李琦等從含油土壤中篩選出高效產(chǎn)生物表面活性劑的銅綠假單胞菌(PseudomonasaeruginosaBD-5)，該菌表面活性劑為8種鼠李糖脂同系物的混合物，其對(duì)柴油、石蠟、甲苯都有較強(qiáng)的乳化作用[9]。

與化學(xué)合成的表面活性劑相比較，生物表面活性劑在極端溫度、鹽度、pH條件下有較低的毒性，并具有可生物降解性、生態(tài)可利用性、對(duì)環(huán)境友好等特點(diǎn)。因此生物表面活性劑可成為合成表面活性劑的理想替代品。生物表面活性劑還具有抗菌性，如Gudia研究報(bào)道生物表面活性劑具有抗細(xì)菌、真菌、病毒和腫瘤活性的能力，有助于減少病原微生物的黏附和繁殖，在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中存在潛在替代傳統(tǒng)治療劑的可能[10]；Nakayama通過(guò)重組枯草桿菌產(chǎn)一種新型的表面活性肽，在抗菌方面具有應(yīng)用潛力[11]。生物表面活性劑不僅可以乳化石油，降低石油降解菌表面疏水性，促進(jìn)石油的降解，在環(huán)保領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用之外，也涉獵于食品、化妝品、農(nóng)業(yè)等其他行業(yè)。

提高生物表面活性劑的產(chǎn)量也是研究的重點(diǎn)。Huang等[12]利用不同Mn2+濃度培養(yǎng)枯草芽孢桿菌發(fā)現(xiàn)Mn2+在0.001到0.1 g/L時(shí)能達(dá)到最大生產(chǎn)量1500 mg/L，是不加Mn2+的6.2倍。Wei等[13]發(fā)現(xiàn)加入0.01 mmol的Mn2+使得表面活性劑由0.33 g/L增加到2.6 g/L。

表2 石油烴的降解菌及其產(chǎn)表面活性劑Table 2 Hydrocarbons degraded by different microorganisms using biosurfactants

石油是由不同數(shù)量的碳?xì)錁?gòu)成的復(fù)雜混合物，包括直鏈烷烴、支鏈烷烴、環(huán)烷烴和芳香烴等，而凈化石油污染物的本質(zhì)是對(duì)烴的代謝。已有的研究成果表明，石油中的各種烴類化合物都能被微生物所降解，而這些微生物均能產(chǎn)生某種表面活性劑(表2)。Rocha等[14]報(bào)道了銅綠假單胞菌ATCC 55925產(chǎn)鼠李糖脂，對(duì)直鏈烷烴C11-C21具有降解效果，而且降解率達(dá)到100%，而對(duì)異烷烴則不受影響，表明烴的不同程度降解與底物的利用度相關(guān)。

2 產(chǎn)生物表面活性劑的石油降解微生物類群

已報(bào)道的降解石油污染物的微生物大約有100余屬200多種，包括細(xì)菌、放線菌、酵母、霉菌等，細(xì)菌是產(chǎn)生物表面活性劑的主要來(lái)源，目前研究最多的是假單胞菌和枯草芽孢桿菌，不同的石油降解菌產(chǎn)生物表面活性劑的種類和特性不同(表3)。Atlas研究發(fā)現(xiàn)降解石油的微生物占總微生物群落的1%，當(dāng)有石油污染物存在時(shí)，降解石油的微生物會(huì)迅速增加到10%[24]。

表3 石油降解菌及其產(chǎn)生物表面活性劑類型Table 3 Petroleum degrading-bacteria and their biosurfactants

3 研究篩選產(chǎn)生物表面活性劑石油降解菌的技術(shù)方法

篩選產(chǎn)生物表面活性劑石油降解菌的技術(shù)方法主要有直接法和間接法。直接法采用添加原油作為唯一碳源和能源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，根據(jù)原油降解效率或者OD600表征，直接篩選法簡(jiǎn)單有效，但是周期長(zhǎng)。間接篩選法主要利用生物表面活性劑可溶血的原理進(jìn)行血平板篩選和產(chǎn)脂肽類表面活性劑的藍(lán)色凝膠平板篩選。薛婷婷采用血平板、油平板篩選到6株產(chǎn)生物表面活性劑的菌株，其中K6菌株可降解70.17%的石油烴[5]。結(jié)合薄層層析和HPLC法分析菌株代謝產(chǎn)物類型為脂肽類表面活性劑。石油降解菌株產(chǎn)表面活性劑能力的檢測(cè)方法主要有油滴坍塌、排油圈法、顯色法、發(fā)酵液表面張力測(cè)定法等。油滴坍塌法精度高，但是操作繁瑣，常用的是排油圈檢測(cè)法，可篩選能夠產(chǎn)生較大圈的菌株。該法簡(jiǎn)單，易操作，可用于較低表面活性劑產(chǎn)量的測(cè)定，而且能夠間接反映生物表面活性劑濃度和發(fā)酵液表面張力的大小。胡申才等采用排油圈法和表面張力測(cè)定法篩選得到5株產(chǎn)表面活性劑的優(yōu)良菌株，而且該表面活性劑具有很強(qiáng)的抗真菌活性[28]。隨著分析鑒定技術(shù)的不斷發(fā)展，采用薄層色譜(TLC)、高效液相色譜、柱層析、核磁共振等方法可對(duì)生物表面活性劑進(jìn)行定性分析。周俊和潭寧華等應(yīng)用茚三酮試劑顯色的薄層原位化學(xué)反應(yīng)方法鑒定了73個(gè)環(huán)肽化合物，采用各種波譜、化學(xué)、酶學(xué)方法確定分子中的氨基酸殘基及其序列，而且通過(guò)雙向薄層層析比較了環(huán)肽和肽酰胺的不同薄層結(jié)果[29]。測(cè)定生物表面活性劑乳化能力及其穩(wěn)定性常采用分光光度法和超聲波法。Bilgi等采用分光光度法測(cè)定乳化性能，測(cè)定簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，適用于實(shí)驗(yàn)室科研快速檢測(cè)[30]。

4 生物表面活性劑在石油烴降解中的作用機(jī)制

20世紀(jì)40年代Zobell提出微生物產(chǎn)生表面活性劑是細(xì)菌驅(qū)油的主要機(jī)制之一。依據(jù)生物表面活性劑具有的親水性和疏水性可引起石油的分散，降低石油表面張力，將疏水性的石油轉(zhuǎn)化為親水性的物質(zhì)。研究認(rèn)為生物表面活性劑是提高微生物對(duì)污染物利用的關(guān)鍵，其主要的作用模式有3個(gè)方面：1)生物表面活性劑改變微生物與污染物之間的傳質(zhì)作用；2)生物表面活性劑改變微生物表面特征，調(diào)節(jié)對(duì)污染物的吸附狀況，促進(jìn)相互作用；3)生物表面活性劑可能改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，促進(jìn)對(duì)污染物的攝取，該作用模式是生物表面活性劑作用石油污染物主要機(jī)理。但是石油中不同烴的代謝途徑和機(jī)理各不相同，芳香烴對(duì)生物的毒性最大，尤其是多環(huán)芳烴，微生物很難降解，Schippers提出了生物表面活性劑促進(jìn)多環(huán)芳烴PAH(polycyclic aromatic hydrocarbon)降解的機(jī)理(圖1)。首先生物表面活性劑以其疏水作用與PAH鏈接，形成含有PAH的膠束，然后接觸細(xì)胞膜，利用生物表面活性劑的親水性增加細(xì)胞膜孔隙度，使PAH進(jìn)入細(xì)胞，之后被混合酶分解利用。Bisone等研究?jī)艋寥乐秀~、鋅和PAH，發(fā)現(xiàn)添加生物表面活性劑可以有效提高對(duì)PAH的去除[31]。

圖1 多環(huán)芳香烴的降解機(jī)理[21]Figure 1 The degradation mechanism of polycyclic aromatic hydrocarbons[21]

5 展望

生物表面活性劑能夠有效促進(jìn)微生物對(duì)石油烴的降解，在環(huán)保領(lǐng)域發(fā)揮至關(guān)重要的作用，但生物表面活性劑的生產(chǎn)成本高出化學(xué)合成的3～10倍，因此篩選高產(chǎn)生物表面活性劑菌株和采用低成本原材料是研究的基礎(chǔ)和關(guān)鍵，只有降低生產(chǎn)成本，大規(guī)模生產(chǎn)生物表面活性劑才有可能實(shí)現(xiàn)。努力提高菌株產(chǎn)率并降低產(chǎn)生物表面活性劑的成本是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)和主要目標(biāo)。

研究菌株生長(zhǎng)與生物表面活性劑生產(chǎn)之間的關(guān)系，以及影響產(chǎn)生物表面活性劑的因素，生產(chǎn)高效、綠色的生物表面活性劑。從分子結(jié)構(gòu)出發(fā)，合成高效、易降解的新型表面活性劑也是研究的熱點(diǎn)，將研究結(jié)果應(yīng)用于石油污染環(huán)境修復(fù)也是目前應(yīng)該重視的方向，可以預(yù)見(jiàn)，生物表面活性劑在未來(lái)環(huán)境保護(hù)應(yīng)用中將會(huì)發(fā)揮積極的作用。