高效畢赤酵母表達(dá)載體的改造與應(yīng)用

侯增淼,李曉穎,高 恩,楊小琳,趙金禮

(陜西慧康生物科技有限責(zé)任公司，西安 710054)

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，利用基因工程技術(shù)來(lái)開發(fā)重組蛋白已頗受人們青睞。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是當(dāng)前流行的真核表達(dá)系統(tǒng)之一[1]，具有許多其他蛋白表達(dá)系統(tǒng)所不具備的優(yōu)點(diǎn)，有可誘導(dǎo)的強(qiáng)啟動(dòng)子，外源基因能整合于染色體上，具有高表達(dá)、高穩(wěn)定、高密度發(fā)酵、適度糖基化、表達(dá)產(chǎn)物生物活性好、發(fā)酵純化操作方法簡(jiǎn)便及易于工業(yè)化生產(chǎn)等特點(diǎn)，已成功地表達(dá)了許多極具價(jià)值的蛋白[2]。但是不同的蛋白在畢赤酵母表達(dá)過(guò)程中表現(xiàn)出不同的表達(dá)量，有的蛋白難以在畢赤酵母中表達(dá)，而有的蛋白表達(dá)量可達(dá)10 g/L以上[3]，因此，分泌表達(dá)量成為制約畢赤酵母表達(dá)的瓶頸，如何提高產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本，是目前的研究熱點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，外源蛋白在畢赤酵母表達(dá)過(guò)程中易在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中滯留無(wú)法分泌至胞外，從而導(dǎo)致表達(dá)量較低[4]，因此外源蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的無(wú)法正確折疊和整合嚴(yán)重影響外源蛋白的產(chǎn)率。利用共表達(dá)分子伴侶如蛋白二硫鍵異構(gòu)酶(Protein disulfide isomerase,PDI)能夠有效改善這一狀況[5-6]，使外源蛋白的分泌效率有效提高。另外，外源蛋白在表達(dá)過(guò)程中的降解也是影響分泌表達(dá)量的一個(gè)重要因素，YPS1蛋白酶是一類糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定的天冬氨酸蛋白酶，能特異性地切割底物中的單或雙堿性氨基酸殘基位點(diǎn)[7]，易使外源蛋白在表達(dá)過(guò)程中降解，在人血清白蛋白(HSA)、明膠(Gelatin)和胰高血糖素(Glucagon)等蛋白的表達(dá)過(guò)程中，通過(guò)對(duì)YPS1基因的失活，與野生型酵母中的表達(dá)水平相比，減少了目的蛋白在表達(dá)過(guò)程中的降解，從而有效提高表達(dá)量[8-9]。

本文以畢赤酵母pPICZαA為骨架載體，在特定位點(diǎn)插入PDI表達(dá)盒和YPS1基因C端和N端非功能區(qū)序列，可在同一載體中實(shí)現(xiàn)外源基因與二硫鍵異構(gòu)酶共表達(dá)，同時(shí)失活YPS1基因，為提高外源蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)量提供一種高效載體。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及試劑PichiapastorisGS115、pPICZaA購(gòu)自Invitrogen公司；E.coliDH5α、TaqDNA聚合酶、PFU高保真酶、EsayGeno快速重組克隆試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提取試劑盒、酵母基因組DNA提取試劑盒均購(gòu)自天根生化；SolutionⅠ購(gòu)自Takara公司；堿性磷酸酶(CIP)購(gòu)自NEB公司；限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自Thermo公司；SYBR Premix ExTaqTMII購(gòu)自Takara公司；GeneRuler DNA Ladder Mix、GeneRuler DNA Ladder Mix、Unstained Protein Molecular Weight Marker 26610、PageRuler Unstained Low Range Protein Ladder 26632均購(gòu)自Thermo公司；pPICZαA-HSA、pPICZαA-hGH表達(dá)載體為本公司構(gòu)建。

1.1.2 主要儀器 PCR儀(DNA Engine，BIO-RAD)；電轉(zhuǎn)儀(BIO-RAD)；LightCycler? 96實(shí)時(shí)熒光PCR儀(Roche)；5 L發(fā)酵罐系統(tǒng)(上海保興)；凝膠成像分析儀(WD-9413B，北京六一)；DNA電泳系統(tǒng)(北京六一)；蛋白電泳系統(tǒng)(北京六一)。

1.2 方法

1.2.1YPS1基因失活載體pPICZαA-YPSΔ構(gòu)建

以插入pPICZαA原始載體的BamH I位點(diǎn)區(qū)為目的，按照EasyGeno無(wú)縫克隆要求設(shè)計(jì)失活YPS1蛋白酶的C端和N端非功能區(qū)序列引物，缺失YPS1基因的功能區(qū)，在C端序列和N端序列之間添加EcoR I酶切位點(diǎn)GAATTC(最終表達(dá)載體線性化位點(diǎn))，C端非功能區(qū)序列引物為YPS-C-F/YPS-C-R，N端非功能區(qū)序列引物為YPS-N-F/YPS-N-R，引物序列見(jiàn)表1。

以畢赤酵母基因組DNA為模板，分別以YPS-C-F和YPS-C-R、YPS-N-F和YPS-N-R為引物，利用高保真酶PCR獲得YPS1基因N端和C端基因序列。另外，對(duì)pPICZαA原始載體進(jìn)行BamH I單酶切，并對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行堿性磷酸酶去磷酸化，然后利用天根生化EasyGeno無(wú)縫克隆技術(shù)快速將上述獲得的YPS1基因C端序列和N端序列同時(shí)克隆連接至pPICZαA載體的BamH I位點(diǎn)處，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，酶切及測(cè)序鑒定。

1.2.2PDI表達(dá)盒的獲得

按照畢赤酵母二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)序列設(shè)計(jì)PDI序列引物PDI-bspU/PDI-xbaL，序列見(jiàn)表1，在上游引物添加Bsp119 I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，下游引物添加X(jué)baI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，經(jīng)PCR獲得PDI基因片段后，再經(jīng)Bsp119 I和XbaI雙酶切，連接至pPICZαA原始表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，構(gòu)建pPICZαA-PDI。

以獲得的pPICZαA-PDI載體為模板，以插入pPICZαA-YPSΔ載體的BglII位點(diǎn)區(qū)為目的，設(shè)計(jì)EasyGeno無(wú)縫克隆引物PDI-EG-F/PDI-EG-R，序列見(jiàn)表1，利用高保真酶進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物為PDI表達(dá)盒，包括AOX啟動(dòng)子、PDI序列和AOX1轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。

1.2.3 高效表達(dá)載體pPICZαA-PDI-YPSΔ的構(gòu)建

對(duì)上述獲得的pPICZαA-YPSΔ進(jìn)行BglII單酶切，利用堿性磷酸酶進(jìn)行去磷酸化，然后利用天根生化EasyGeno無(wú)縫克隆技術(shù)快速將上述獲得的PDI表達(dá)盒連接至pPICZαA-YPSΔ載體的BglII位點(diǎn)處，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，酶切及測(cè)序鑒定構(gòu)建結(jié)果。

1.2.4 外源蛋白表達(dá)菌株的構(gòu)建

1)人血清白蛋白表達(dá)菌株構(gòu)建。根據(jù)人血清白蛋白(HSA)的基因序列設(shè)計(jì)引物HSA-XU/HSA-NL，序列見(jiàn)表1。在上游引物中添加X(jué)hoI 酶切位點(diǎn)CTCGAG，同時(shí)在XhoI酶切位點(diǎn)后添加AAAAGA，可在表達(dá)過(guò)程中經(jīng)KEX2酶切割，獲得天然N端目的蛋白；在下游引物中添加NotI限制性酶切位點(diǎn)GCGGCCGC。以人皮膚組織cDNA為模板，經(jīng)PCR獲得HSA基因后，與高效表達(dá)載體pPICZαA-PDI-YPSΔ同時(shí)進(jìn)行XhoI和NotI雙酶切，回收純化酶切產(chǎn)物，再將HSA與pPICZαA-PDI-YPSΔ載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得pPICZαA-PDI-YPSΔ-HSA表達(dá)載體，然后將pPICZαA-PDI-YPSΔ-HSA表達(dá)載體經(jīng)EcoR I內(nèi)切酶線性化后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，同時(shí)將本公司利用pPICZαA原始載體構(gòu)建的HSA表達(dá)載體pPICZαA-HSA以相同條件電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，zeocin篩選高拷貝菌株GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-HSA和GS115/pPICZαA-HSA。

2)人生長(zhǎng)激素表達(dá)菌株構(gòu)建。根據(jù)人生長(zhǎng)激素(hGH)的基因序列設(shè)計(jì)引物hGH-XU/hGH-NL，序列見(jiàn)表1。GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-hGH表達(dá)菌株構(gòu)建過(guò)程同1.2.4中(1)，同時(shí)與本公司構(gòu)建的pPICZαA-hGH以相同條件轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，zeocin篩選。

1.2.5 外源蛋白表達(dá)的檢測(cè)

1)相同質(zhì)?？截悢?shù)菌株篩選及表達(dá)結(jié)果檢測(cè)。以畢赤酵母中高度保守基因三磷酸甘油醛脫氫酶基因(GAPDH)為內(nèi)參基因，利用酵母基因組DNA提取試劑盒提取構(gòu)建的含有外源基因HSA/hGH的畢赤酵母菌株基因組DNA，以表1中Qgapdh-F/Qgapdh-R、Qhsa-F/Qhsa-R和Qhgh-F/Qhgh-R為引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，通過(guò)2-△△Ct法相對(duì)定量GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-HSA和GS115/pPICZαA-HSA、GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-hGH和GS115/pPICZαA-hGH各菌株基因拷貝數(shù)，分析擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線，以確保特異性擴(kuò)增，然后選取相同質(zhì)?？截悢?shù)的菌株進(jìn)行搖瓶和發(fā)酵罐發(fā)酵，SDS-PAGE電泳檢測(cè)表達(dá)情況，利用高效液相色譜外標(biāo)法測(cè)定HSA和hGH的表達(dá)量。

2)PDI過(guò)表達(dá)的檢測(cè)。以畢赤酵母三磷酸甘油醛脫氫酶基因(GAPDH)為內(nèi)參基因，提取GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-HSA和GS115/pPICZαA-HSA、GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-hGH和GS115/pPICZαA-hGH發(fā)酵后菌株基因組DNA，以表1中Qgapdh-F/Qgapdh-R和Qpdi-F/Qpdi-R為引物進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)PDI基因的表達(dá)。

3)YPS1基因失活檢測(cè)。以YPS1基因的功能區(qū)為模板，設(shè)計(jì)檢測(cè)引物YPS-F/YPS-R，以篩選獲得的菌株GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-HSA和GS115/pPICZαA-HSA、GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-hGH和GS115/pPICZαA-hGH基因組DNA為模板，利用檢測(cè)引物進(jìn)行PCR，檢測(cè)YPS1基因的缺失與否。

2 結(jié)果

2.1 YPS1基因失活載體pPICZαA-YPSΔ構(gòu)建

以pPICZαA為骨架載體，PCR獲得YPS1基因C端和N端非功能區(qū)序列，利用EasyGeno無(wú)縫克隆技術(shù)將YPS1基因C端和N端非功能區(qū)序列連接至pPICZαA載體的BamH I位點(diǎn)處，然后用BamH I酶切及測(cè)序鑒定連接結(jié)果，酶切鑒定結(jié)果(見(jiàn)圖1)顯示，構(gòu)建的pPICZαA-YPSΔ經(jīng)BamH I酶切后可切出約1100 bp大小片段，與預(yù)期相符。

表1 設(shè)計(jì)的引物序列Table 1 Design of primer sequences

1：pPICZαA-YPSΔ質(zhì)粒；2：pPICZαA-YPSΔ酶切結(jié)果；M：DNA Marker

圖1 pPICZαA-YPSΔ酶切鑒定結(jié)果
Figure 1 Analysis of pPICZαA-YPSΔ digested byBamH I

2.2 高效表達(dá)載體pPICZαA-PDI-YPSΔ的構(gòu)建

將畢赤酵母二硫鍵異構(gòu)酶基因(PDI)連接至pPICZαA，再經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得PDI表達(dá)盒，PCR結(jié)果見(jiàn)圖2-A，擴(kuò)增出2900 bp大小片段，與預(yù)期相符，然后將PDI表達(dá)盒利用天根生化EasyGeno無(wú)縫克隆技術(shù)連接至pPICZαA-YPSΔ載體的BglII位點(diǎn)處，用BglII酶切及測(cè)序鑒定連接結(jié)果，酶切鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2-B，獲得正確連接的pPICZαA-PDI-YPSΔ高效表達(dá)載體，pPICZαA-PDI-YPSΔ質(zhì)粒圖譜見(jiàn)圖3。

A：PDI表達(dá)盒PCR結(jié)果(1、2為平行樣)；B：pPICZαA-PDI-YPSΔ酶切結(jié)果

圖2 PDI表達(dá)盒和pPICZαA-PDI-YPSΔ酶切結(jié)果
Figure 2 PDI expression cassette and analysis of pPICZαA-PDI-YPSΔ digested byBglII

圖3 pPICZαA-PDI-YPSΔ質(zhì)粒圖譜Figure 3 The plasmid profile of pPICZαA-PDI-YPSΔ

2.3 人血清白蛋白的表達(dá)

2.3.1 相同質(zhì)粒拷貝數(shù)菌株篩選及表達(dá)結(jié)果檢測(cè)

以GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-HSA和GS115/pPICZαA-HSA菌株基因組DNA為模板，以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，使用熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀，對(duì)GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-HSA和GS115/pPICZαA-HSA菌株HSA基因拷貝數(shù)進(jìn)行比較，HSA和GAPDH基因溶解曲線(見(jiàn)圖4)顯示無(wú)特異性擴(kuò)增。然后選取拷貝數(shù)相同的菌株進(jìn)行搖瓶及發(fā)酵罐發(fā)酵，SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-HSA較GS115/pPICZαA-HSA表達(dá)量明顯提高，表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖5(搖瓶上清液與上樣緩沖液等體積混合，取10 μL上樣)。對(duì)兩種菌株在同一條件下經(jīng)發(fā)酵罐發(fā)酵檢測(cè)(pH 5.5，溫度28℃)，利用高效液相色譜外標(biāo)法測(cè)定HSA的表達(dá)量，GS115/pPICZαA-HSA表達(dá)量約1 g/L，而GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-HSA表達(dá)量可達(dá)到6 g/L，較改造前提高了6倍，結(jié)果見(jiàn)圖6(發(fā)酵上清液稀釋10倍后與上樣緩沖液等體積混合，10 μL上樣)。

圖4 GAPDH、HSA和hGH溶解曲線Figure 4 The amplification curves of GAPDH,HSA and hGH

1、2：GS115/pPICZαA-HSA；3、4、5：GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-HSA

圖5 HSA搖瓶發(fā)酵電泳結(jié)果
Figure 5 Shake flask fermentation results of HSA

F1：GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-HSA；F2：GS115/pPICZαA-HSA

圖6 HSA發(fā)酵罐發(fā)酵不同時(shí)間取樣電泳結(jié)果
Figure 6 Electrophoresis results of HSA fermentation at different time

2.3.2PDI過(guò)表達(dá)的檢測(cè)

以GAPDH基因作為內(nèi)參基因，利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR分別檢測(cè)2.3.1中發(fā)酵罐發(fā)酵后兩種菌株菌體DNA中PDI基因的表達(dá)，利用2-△△Ct法，對(duì)GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-HSA和GS115/pPICZαA-HSA菌株P(guān)DI基因表達(dá)進(jìn)行比較，利用LightCycler? 96實(shí)時(shí)熒光PCR儀系統(tǒng)軟件作圖，結(jié)果見(jiàn)圖7，GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-HSA菌株中PDI基因表達(dá)量明顯高于GS115/pPICZαA-HSA菌株。

2.3.3YPS1基因失活檢測(cè)

當(dāng)pPICZαA-PDI-YPSΔ-HSA質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)化畢赤酵母，質(zhì)粒兩端的YPS1基因N端序列和C端序列與GS115基因組YPS1基因兩端進(jìn)行置換，從而使外源基因同源重組整合到酵母基因組DNA，同時(shí)缺失基因組YPS1基因功能區(qū)序列，失活過(guò)程見(jiàn)圖8-A。對(duì)于上述GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-HSA和GS115/pPICZαA-HSA菌株，利用YPS1基因功能區(qū)擴(kuò)增引物YPS-F/YPS-R擴(kuò)增YPS1基因功能區(qū)片段，從圖8-B可以看出，GS115/pPICZαA-HSA可以擴(kuò)增出目的條帶，說(shuō)明YPS1基因功能區(qū)完整，而GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-HSA以相同PCR條件未擴(kuò)增出目的條帶，說(shuō)明YPS1基因功能區(qū)已缺失。

圖7 Real-time PCR檢測(cè)PDI基因在不同菌株中的表達(dá)Figure 7 Detection of PDI gene expression in different strains by Real-time PCR

A：YPS1基因失活過(guò)程；B：YPS1基因PCR檢測(cè)(1: GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-HSA,2:GS115/pPICZαA-HSA)

圖8YPS1基因失活過(guò)程和PCR檢測(cè)
Figure 8 Deletion process and PCR detection ofYPS1 gene

1、2：GS115/pPICZαA-hGH；3、4、5、6：GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-hGH

圖9 hGH搖瓶發(fā)酵電泳結(jié)果
Figure 9 Shake flask fermentation results of hGH

2.4 人生長(zhǎng)激素的表達(dá)

參考2.3.1，選取拷貝數(shù)相同的菌株進(jìn)行搖瓶及發(fā)酵罐發(fā)酵。SDS-PAGE電泳鑒定結(jié)果顯示，GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-hGH較GS115/pPICZαA-hGH表達(dá)量明顯提高，結(jié)果見(jiàn)圖9(搖瓶上清液與上樣緩沖液等體積混合，沸水煮5 min，取20 μL上樣)。另外，對(duì)兩種菌株在同一條件下經(jīng)發(fā)酵罐發(fā)酵檢測(cè)(pH 4.5，溫度29℃)，利用高效液相色譜外標(biāo)法測(cè)定hGH的表達(dá)量，GS115/pPICZαA-hGH表達(dá)量約50 mg/L，而GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-hGH表達(dá)量可達(dá)到200 mg/L，較改造前提高了約4倍，結(jié)果見(jiàn)圖10(PDI表達(dá)和YPS1缺失檢測(cè)結(jié)果同上述2.3.2、2.3.3)。

F1：GS115/pPICZαA-hGH；F2：GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-hGH

圖10 hGH發(fā)酵罐發(fā)酵不同時(shí)間取樣電泳結(jié)果
Figure 10 Electrophoresis results of hGH fermentation at different times

3 討論

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中外源蛋白的分泌表達(dá)是一個(gè)復(fù)雜連續(xù)的過(guò)程，很多因素均能影響其表達(dá)量，其中包括外源基因密碼子的優(yōu)化、提高基因的拷貝數(shù)、分泌信號(hào)的改造等方法[2]。在以往研究中，通過(guò)增加基因的拷貝數(shù)來(lái)提高表達(dá)量是一種有效的手段，在一些蛋白的表達(dá)中已得到應(yīng)用，但是，某些蛋白的表達(dá)量并不是一直隨著基因拷貝數(shù)的增加而增加[10-11]，當(dāng)?shù)鞍状罅勘磉_(dá)時(shí)，易造成蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯(cuò)誤折疊和積累，而錯(cuò)誤折疊的蛋白被禁止離開內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或被降解清除，這就產(chǎn)生了外源蛋白分泌的瓶頸。另外，畢赤酵母發(fā)酵周期較長(zhǎng)，在發(fā)酵過(guò)程中酵母自身會(huì)分泌大量的蛋白酶，這些蛋白酶會(huì)特異性識(shí)別外源蛋白序列，從而使外源蛋白降解。

鑒于以上原因，我們利用二硫鍵異構(gòu)酶催化蛋白二硫鍵的形成及抑制錯(cuò)誤折疊蛋白聚集的分子伴侶活性[12]，同時(shí)失活蛋白酶YPS1抑制外源蛋白降解，通過(guò)二者的聯(lián)合作用，達(dá)到提高外源蛋白表達(dá)量的目的。目前，在同一畢赤酵母菌株中共表達(dá)外源目的蛋白和分子伴侶二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)，或失活YPS1基因，常規(guī)方法為分別構(gòu)建不同的載體，包括外源蛋白表達(dá)載體、過(guò)表達(dá)二硫鍵異構(gòu)酶載體和YPS1失活載體，Wang等[13]共表達(dá)伴侶蛋白PDI、BiP和HAC1以提高蝎毒活性肽BmK AngM1的表達(dá)，其中BmK AngM1肽采用pPIC9K載體表達(dá)，而伴侶蛋白PDI、BiP和HAC1采用pPICZ-A載體進(jìn)行表達(dá)；Yao等[14]利用YPS1基因失活減少HSA-AX15蛋白的降解，HSA-AX15采用pPIC9K載體表達(dá)，而YPS1基因失活采用pPICαA載體來(lái)實(shí)現(xiàn)。

分析上述采用方法，構(gòu)建不同載體分別進(jìn)行轉(zhuǎn)化篩選，過(guò)程繁瑣復(fù)雜，還需考慮采用不同的篩選標(biāo)記，篩選周期長(zhǎng)，難度較大，因此，我們對(duì)畢赤酵母常用表達(dá)載體pPICZαA進(jìn)行改造，在同一載體實(shí)現(xiàn)外源蛋白和二硫鍵異構(gòu)酶共表達(dá)并失活蛋白酶YPS1基因的方法，同時(shí)，在載體轉(zhuǎn)化過(guò)程中，以YPS1基因的C端和N端非功能區(qū)之間的EcoR I酶切位點(diǎn)作為線性化位點(diǎn)，線性化后以YPS1的C端和N端序列作為同源臂同源重組插入畢赤酵母基因組，讓該載體更易于操作。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了畢赤酵母高效表達(dá)載體pPICZαA-PDI-YPSΔ，并以人血清白蛋白和人生長(zhǎng)激素作為報(bào)告基因進(jìn)行功能驗(yàn)證。結(jié)果表明，該載體可實(shí)現(xiàn)外源蛋白人血清白蛋白和人生長(zhǎng)激素在畢赤酵母中的高效表達(dá)，但對(duì)于該載體，我們僅對(duì)上述兩種蛋白進(jìn)行試驗(yàn)，是否對(duì)其他外源蛋白有效，有待進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。