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    畢赤酵母表達(dá)環(huán)狀芽胞桿菌殼聚糖酶及其水解產(chǎn)物組成與結(jié)構(gòu)分析

    2019-02-15 08:28:28焦思明賈培媛任立世張毓宸李建軍杜昱光
    生物加工過程 2019年1期
    關(guān)鍵詞:畢赤寡糖乙酰

    程 功,焦思明,賈培媛,任立世,馮 翠,張毓宸,李建軍,杜昱光

    (中國科學(xué)院 過程工程研究所 生化工程國家重點實驗室,北京 100190)

    殼寡糖是甲殼素或者其脫乙酰產(chǎn)物殼聚糖經(jīng)物理、化學(xué)或酶學(xué)等方法降解產(chǎn)生的寡聚物,由氨基葡萄糖及N-乙酰氨基葡萄糖通過β-1,4糖苷鍵連接而成,通常聚合度小于20[1]。研究顯示,殼寡糖具有抗炎、抗腫瘤及激活植物免疫等一系列生物活性[2-5]。在工業(yè)上,殼寡糖主要通過以下方式獲得:蝦蟹殼經(jīng)酸法脫鈣及堿法脫蛋白后得到甲殼素,經(jīng)高濃度強(qiáng)堿脫乙酰得殼聚糖,再經(jīng)酶法水解等方式最終獲得殼寡糖[6]?,F(xiàn)有制備工藝生產(chǎn)的殼寡糖的脫乙酰度通常高于85%,組分種類較少,主要為聚合度小于10的全脫乙酰殼寡糖。

    殼寡糖生物活性的發(fā)揮與其結(jié)構(gòu),如聚合度及脫乙酰度甚至乙?;诠烟擎溕系姆植嫉让芮邢嚓P(guān)[7]。然而,現(xiàn)有殼寡糖的工業(yè)制備過程中已經(jīng)脫去大部分的乙?;?,且通常使用非特異性商品酶類,如纖維素酶[8]、蛋白酶[9]及脂肪酶[10]等對殼聚糖進(jìn)行水解,難以實現(xiàn)產(chǎn)物殼寡糖結(jié)構(gòu)的有效調(diào)控。為解決上述難題,擬對工藝進(jìn)行如下改進(jìn):制備脫乙酰度小于80%的殼聚糖,篩選并高效表達(dá)殼聚糖水解酶類,利用這些酶類水解低脫乙酰度底物,獲得特定結(jié)構(gòu)殼寡糖。

    殼聚糖酶(chitosanase,EC 3.2.1.132)可通過內(nèi)切方式對殼聚糖底物進(jìn)行水解,產(chǎn)物即為殼寡糖。根據(jù)殼聚糖酶對殼聚糖底物水解位點識別的差異,可將其大致分為3種類型:Ⅰ型殼聚糖酶可同時識別并水解GlcN-GlcN及GlcNAc-GlcN糖苷鍵,Ⅱ型殼聚糖酶僅識別并水解GlcN-GlcN糖苷鍵,Ⅲ型殼聚糖酶可同時識別并水解GlcN-GlcN及GlcN-GlcNAc糖苷鍵[11]。利用這些不同水解類型的殼聚糖酶,可以制備不同結(jié)構(gòu)特征的殼寡糖。Chen等[12]已經(jīng)在畢赤酵母中高效表達(dá)了來源于煙曲霉的殼聚糖酶,該酶屬于Ⅰ型殼聚糖酶[13]。Saito等[14]已證實來源于環(huán)狀芽胞桿菌的殼聚糖酶屬于Ⅲ型殼聚糖酶。目前,尚無該酶在畢赤酵母中表達(dá)的研究報道。與其他表達(dá)系統(tǒng)相比,畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)結(jié)合高密度發(fā)酵可實現(xiàn)蛋白高效分泌表達(dá),已在工業(yè)及食品用酶制劑領(lǐng)域取得較廣泛應(yīng)用。

    因此,本研究中,筆者選擇利用該表達(dá)系統(tǒng)對來源于環(huán)狀芽胞桿菌的殼聚糖酶進(jìn)行表達(dá),利用產(chǎn)物酶水解制備低脫乙酰度殼寡糖并對其組成及結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析,為特定結(jié)構(gòu)類型殼寡糖的功能研究及應(yīng)用提供必要前提。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    甲殼素,Sigma-Aldrich公司;質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、T4連接酶及E.coliDH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞,寶日醫(yī)(北京)生物技術(shù)有限公司;畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9,優(yōu)寶生物,pGBG1為pPIC9信號肽核酸序列根據(jù)畢赤酵母密碼子的偏好性優(yōu)化后的載體[15];畢赤酵母GS115、XhoⅠ、NotⅠ、BglⅡ及色譜純乙腈,美國Thermo Fisher公司;蛋白Marker,上海天能科技有限公司。其他試劑均為市售分析純。畢赤酵母培養(yǎng)基MD、BMGY和BMMY的配制方法及電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞制備方法均參考畢赤酵母表達(dá)手冊,美國Thermo Fisher公司。

    1.2 儀器

    ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)、Waters XEVO G2-S QTOF型質(zhì)譜儀(配有Lock-spray 接口、電噴霧離子源(ESI)及Masslynx 4.1質(zhì)譜工作站軟件),美國Waters公司;AVANCE Ⅲ 600 MHz型核磁共振儀,Bruker公司;DYY-6C型核酸及蛋白電泳系統(tǒng),北京六一生物科技有限公司;Tanon-1600型凝膠成像系統(tǒng),上海天能科技有限公司;MicroPulserTM電轉(zhuǎn)儀,美國Bio-Rad公司;LGJ-10FD型真空冷凍干燥機(jī),北京松源華興科技發(fā)展有限公司;RE-2000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,鞏義市英峪高科儀器廠;L535R型低溫冷凍離心機(jī),湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 環(huán)狀芽胞桿菌殼聚糖酶基因序列優(yōu)化、全合成及表達(dá)載體構(gòu)建

    使用畢赤酵母偏好的密碼子,對環(huán)狀芽胞桿菌菌株MH-K1[14]的殼聚糖酶(GenBank登錄號:BAA01474,43-301)編碼基因序列進(jìn)行優(yōu)化,在5′及3′末端分別添加XhoⅠ及NotⅠ酶切位點序列。委托北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司將設(shè)計好的基因序列進(jìn)行全合成。利用內(nèi)切酶XhoⅠ及NotⅠ回收載體pUC18上的目的基因片段,使用T4連接酶連接至相同內(nèi)切酶水解的表達(dá)載體pGBG1中,轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中。使用酶切及雙末端測序方法對構(gòu)建表達(dá)載體的正確性進(jìn)行驗證。

    1.3.2 環(huán)狀芽胞桿菌殼聚糖酶畢赤酵母表達(dá)

    使用BglⅡ?qū)χ亟M質(zhì)粒進(jìn)行線性化并切膠回收目的基因,電轉(zhuǎn)至畢赤酵母GS115中。使用MD平板篩選獲得重組子,轉(zhuǎn)接至含有膠體殼聚糖(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%)的BMMY瓊脂平板上,在30 ℃條件下培養(yǎng)2~3 d,篩選出水解圈最大的菌落。將菌落接種于200 mL BMGY培養(yǎng)基中,在28 ℃、250 r/min條件下培養(yǎng)48 h,離心棄上清,加入200 mL的BMMY誘導(dǎo)表達(dá)。后續(xù)每隔24 h補(bǔ)加1次甲醇至其終體積分?jǐn)?shù)為1%,共計誘導(dǎo)120 h后離心收集上清液。使用SDS-PAGE法檢測上清液中的蛋白表達(dá)情況,Bradford法測定上清的蛋白濃度。

    1.3.3 低脫乙酰度殼寡糖制備及組成分析

    使用表達(dá)的殼聚糖酶水解脫乙酰度為62%的殼聚糖[15]制備殼寡糖,具體方法如下:稱取50 g殼聚糖,加至1 000 mL水中,加入乙酸溶解并調(diào)節(jié)至pH 6.0;再加入10 mL殼聚糖酶,在40 ℃條件下攪拌反應(yīng)48 h;離心去除不溶物,使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將上清濃縮至約300 mL后凍干。稱取10 mg殼寡糖凍干樣品,使用超純水配制成1 mg/mL溶液。

    液相檢測條件:使用Waters ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱,流動相為0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脫(0~2 min,15% A;2~32 min,15%~50% A;32~33 min,50%~80% A;33~36 min,80% A;36~37 min,80%~15% A;37~44 min,15% A),柱溫為35 ℃,流速為0.3 mL/min,進(jìn)樣量為1 μL。

    質(zhì)譜檢測條件:ESI源,正離子掃描模式,毛細(xì)管電壓為3 kV,錐孔電壓為60 V,離子源溫度為150 ℃,脫溶劑氣溫度為500 ℃,錐孔氣流量為50 L/h,脫溶劑氣流量為800 L/h,碰撞能量為30~60 V,離子能量為3 V,每0.25 s采集1次圖譜;質(zhì)量掃描范圍為150~2 000m/z。

    使用Masslynx 4.1軟件對獲取的液質(zhì)結(jié)果進(jìn)行分析,以獲得潛在的殼寡糖信息。依據(jù)一級質(zhì)譜信息進(jìn)行潛在殼寡糖組分的組成分析,具體方法如下:首先建立聚合度為2~20的所有可能結(jié)構(gòu)殼寡糖的H+、Na+和K+衍生物及多電荷離子的理論質(zhì)荷比(m/z)數(shù)據(jù)庫,如含有4個N-乙酰氨基葡萄糖(A)及8個氨基葡萄糖(D)的殼寡糖(D8A4)不同正離子衍生物及其理論m/z值包括[D8A4+H]+/2 119.9、[D8A4+Na]+/2 141.9、[D8A4+K]+/2 157.9、[D8A4+2H]2+/1 060.5及[D8A4+3H]3+/707.3等,將測定的m/z值與數(shù)據(jù)庫中殼寡糖的理論m/z值對比,即可推測產(chǎn)物殼寡糖的潛在組成。

    1.3.4 低脫乙酰度殼寡糖結(jié)構(gòu)特征分析

    使用液體1H NMR及13C NMR分別對制備的殼寡糖的還原端及非還原端單糖組成進(jìn)行分析,具體方法:稱取25 mg制備的殼寡糖凍干樣品,加入0.50 mL D2O,待其充分溶解后加樣檢測。以3-(三甲基甲硅烷基)丙酸-d4鈉鹽為內(nèi)標(biāo),使用AVANCE III 600MHz型核磁共振儀對樣品進(jìn)行檢測,其中,1H NMR檢測時對水峰進(jìn)行抑制以減少干擾。獲得的原始數(shù)據(jù)使用MestReNova軟件打開后,使用內(nèi)標(biāo)校正位移值后,參照文獻(xiàn)[16]對特定部位單糖進(jìn)行標(biāo)記,具體的參考位移值包括1H NMR中的還原端氨基葡萄糖(-D,δ5.43)、還原端N-乙酰氨基葡萄糖(-A,δ5.19)以及13C NMR中5位碳(C5)的非還原端氨基葡萄糖(D-,δ79.0)及非還原端N-乙酰氨基葡萄糖(A-,δ78.5)等。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 殼聚糖酶基因優(yōu)化、全合成及畢赤酵母表達(dá)

    環(huán)狀芽胞桿菌菌株MH-K1殼聚糖酶編碼基因長度為906 bp,編碼蛋白包含301個氨基酸,在蛋白的氨基末端包含1個信號肽。將密碼子優(yōu)化后的基因命名為bccsn(GenBank:MG595777)。使用酶切方法對構(gòu)建好的表達(dá)載體進(jìn)行驗證,電泳結(jié)果見圖1。由圖1可知,經(jīng)XhoⅠ及NotⅠ雙酶切后,在750~1 000 bp附近出現(xiàn)了1個條帶(E1),與目的基因(813 bp)大小相符;使用BglⅡ?qū)|(zhì)粒線性化后出現(xiàn)了預(yù)期的2個片段(E2),其中,10 kb附近為含有目的基因的片段,3 kb附近為含有抗性基因的片段。雙末端測序結(jié)果也確認(rèn)目的基因被正確構(gòu)建至表達(dá)載體中。使用SDS-PAGE方法分析目標(biāo)蛋白(記為BCCSN)的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,在3.5×104附近出現(xiàn)了1個較明顯的蛋白條帶(P1),稍大于該蛋白的預(yù)測值(2.99 ×104)(圖1(b))。Bradford法測定發(fā)酵上清中的粗蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.77 mg/mL。

    圖1 重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物及其蛋白表達(dá)產(chǎn)物電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis map of recombinant plasmidrestriction enzyme hydrolysates (a) andprotein expression products (b)

    在本研究之前,已有多篇針對環(huán)狀芽胞桿菌MH-K1殼聚糖酶的相關(guān)報道。Yabuki等[17]最先對該酶進(jìn)行純化及鑒定,確定該酶分子量約為3.0×104;Saito等[14]對該酶的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析,確定該酶水解特定糖苷鍵類型的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ);Fukamizo等[18]確定該酶蛋白序列中第218位的賴氨酸為底物結(jié)合關(guān)鍵氨基酸;Kouzai等[19]將該酶的基因?qū)胨净蚪M中,證實其可增強(qiáng)水稻對稻瘟病的抵抗能力;Tomita等[20]

    利用千葉短芽胞桿菌表達(dá)了該酶,并對其體外抗真菌活性進(jìn)行了研究,但都沒有研究該酶水解產(chǎn)物的組成及結(jié)構(gòu)。

    2.2 水解產(chǎn)物組成及結(jié)構(gòu)特征分析

    使用UPLC-QTOF MS對水解產(chǎn)物進(jìn)行檢測及分析,結(jié)果見圖2。由圖2可知,水解產(chǎn)物已被一定程度分離。選取其中的12個典型峰(A~L),利用對應(yīng)的質(zhì)譜信息,在這些峰中一共找到37個較為明顯的潛在殼寡糖組分,結(jié)果見圖3。由圖3可知,這些潛在殼寡糖組分的聚合度為2~20,并根據(jù)不同的脫乙酰度將這些殼寡糖的分析結(jié)果總結(jié)于表1。

    由圖2~3及表1結(jié)果可知:殼寡糖根據(jù)其中含有的氨基葡萄糖的數(shù)量由少至多出峰,使用的色譜柱基本能將不同氨基葡萄糖含量的殼寡糖組分分離開來;當(dāng)相同氨基葡萄糖含量下出現(xiàn)不同數(shù)量的N-乙酰氨基葡萄糖時,該色譜柱難以對其有效分離。

    結(jié)合全基因合成及密碼子優(yōu)化,利用畢赤酵母分泌表達(dá)系統(tǒng),可以快速獲得高活性的殼聚糖酶。液質(zhì)分析結(jié)果顯示,利用該酶水解低脫乙酰度殼聚糖,可以獲得多種殼寡糖組分。與使用傳統(tǒng)的高脫乙酰度殼聚糖底物相比,改用低脫乙酰度底物獲得的產(chǎn)物殼寡糖組分更加多樣。

    2.3 水解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)特征分析

    為獲得殼聚糖酶對底物的位點識別特性及產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征,進(jìn)一步使用1H NMR及13C NMR對水解產(chǎn)物進(jìn)行鑒定,結(jié)果見圖4。由圖4可知:水解產(chǎn)物的還原末端主要由氨基葡萄糖組成(圖4(a)),而非還原末端則同時含有氨基葡萄糖及N-乙酰氨基葡萄糖(圖4(b))。上述結(jié)果說明該酶可同時水解糖苷鍵GlcN-GlcN及GlcN-GlcNAc,與Ⅲ型殼聚糖酶底物識別特性相符。

    圖2 BCCSN酶解產(chǎn)物總離子流圖(TIC)Fig.2 TIC of BCCSN hydrolysis products

    圖3 BCCSN酶解產(chǎn)物質(zhì)譜Fig.3 Mass spectrogram of BCCSN hydrolysis products

    序號保留時間/min實測m/z理論m/z推測組成A110.27341.4341.1[D2+H]+B112.28544.6544.2[D2A1+H]+C116.10502.5502.2[D3+H]+D117.40705.8705.3[D3A1+H]+E118.69909.0908.4[D3A2+H]+F121.76866.9866.4[D4A1+H]+F221.761 070.11 069.4[D4A2+H]+G122.99637.2636.8[D4A3+2H]2+H125.16514.6514.2[D5A1+2H]2+H225.16616.2615.8[D5A2+2H]2+H325.16717.8717.3[D5A3+2H]2+H425.16819.4818.8[D5A4+2H]2+I127.56696.8696.3[D6A2+2H]2+I227.56798.3797.8[D6A3+2H]2+I327.56900.0899.4[D6A4+2H]2+I427.561 001.61 000.9[D6A5+2H]2+I527.561 103.21 102.4[D6A6+2H]2+J130.24878.9878.4[D7A3+2H]2+J230.24980.5979.9[D7A4+2H]2+J330.241 082.21 081.4[D7A5+2H]2+J430.241 183.81 183.0[D7A6+2H]2+J530.241 285.31 284.5[D7A7+2H]2+K131.69707.7707.3[D8A4+3H]3+K231.69775.5775.0[D8A5+3H]3+K331.69843.2842.7[D8A6+3H]3+K431.69911.0910.4[D8A7+3H]3+K531.69978.7978.1[D8A8+3H]3+L132.87761.5761.0[D9A4+3H]3+L232.87829.2828.7[D9A5+3H]3+L332.87897.0896.4[D9A6+3H]3+L432.87964.7964.1[D9A7+3H]3+L532.871 032.41 031.8[D9A8+3H]3+L632.87950.7950.1[D10A6+3H]3+L732.871 018.41 017.7[D10A7+3H]3+L832.871 086.21 085.4[D10A8+3H]3+L932.871 153.91 153.1[D10A9+3H]3+L1032.871 221.61 220.8[D10A10+3H]3+

    注:D代表氨基葡萄糖,A代表N-乙酰氨基葡萄糖,隨后的數(shù)字代表對應(yīng)單糖的數(shù)量。

    圖4 酶解產(chǎn)物1H NMR(a)及13C NMR(b)分析Fig.4 1H NMR (a) and 13C NMR (b) spectra of hydrolysis products

    與動植物的特定受體結(jié)合并激活免疫等下游信號通路,是殼寡糖發(fā)揮生物活性的重要方式。研究發(fā)現(xiàn),在動植物細(xì)胞中存在多種可識別殼寡糖鏈上N-乙酰氨基葡萄糖的特異性受體[21-27]。這些受體是否可以與低脫乙酰度的復(fù)雜結(jié)構(gòu)殼寡糖結(jié)合以及何種結(jié)構(gòu)殼寡糖可以激發(fā)最大的生物學(xué)活性等問題都缺乏系統(tǒng)研究。我們將進(jìn)一步對特定結(jié)構(gòu)殼寡糖進(jìn)行制備及分離,以期為其結(jié)構(gòu)與功能研究及新型殼寡糖產(chǎn)品開發(fā)提供前提及參考。

    3 結(jié)論

    利用畢赤酵母分泌表達(dá)環(huán)狀芽胞桿菌殼聚糖酶并使用該酶水解制備了低脫乙酰度殼寡糖。組分及結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示,這些殼寡糖的聚合度為2~20,可以獲得不同脫乙酰度的組分,寡糖鏈的還原末端主要由氨基葡萄糖組成,非還原端同時含有氨基葡萄糖及N-乙酰氨基葡萄糖。與傳統(tǒng)殼寡糖相比,本研究制備的殼寡糖組分更加復(fù)雜多樣,可能具有更高或者新的生物活性。

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