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    淀粉樣β蛋白質(zhì)構(gòu)象轉(zhuǎn)換及其抑制的分子動(dòng)力學(xué)模擬

    2019-02-15 08:28:26劉夫鋒
    生物加工過(guò)程 2019年1期
    關(guān)鍵詞:構(gòu)象殘基多肽

    李 麗,劉夫鋒

    (1.天津科技大學(xué) 海洋與環(huán)境學(xué)院,天津 300457;2.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 省部共建食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300457)

    阿爾茨海默病(AD)是老年性癡呆中最常見的類型之一,由于AD的發(fā)病人數(shù)僅次于癌癥、心臟病和腦中風(fēng),已經(jīng)成為危害人類健康的第四大殺手。AD的主要病理變化之一是患者腦內(nèi)出現(xiàn)大量的老年斑。淀粉樣沉淀假說(shuō)[1-3]認(rèn)為淀粉質(zhì)β多肽(Aβ)的聚集沉淀形成有細(xì)胞毒性的聚集體是AD的主要誘因。Aβ是淀粉質(zhì)前體蛋白在β-分泌酶和γ-分泌酶共同作用下的水解產(chǎn)物(圖1)[4]。由于γ-分泌酶存在不同的酶切位點(diǎn),因此Aβ含有多個(gè)變異體,其中Aβ40和Aβ42是最常見的2種類型。Aβ40的含量最多,約為80%。而由于N端含有2個(gè)疏水性氨基酸I和A,從而使Aβ42的聚集速度更快,且其聚集體的毒性更強(qiáng)。因此,Aβ42在AD的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起到關(guān)鍵性作用。Aβ聚集體會(huì)進(jìn)一步與變性的軸突、神經(jīng)纖維以及膠質(zhì)細(xì)胞共沉淀形成病理性斑塊[5]。

    圖1 Aβ生成示意圖及其氨基酸序列Fig.1 Schematic representation of production of Aβand its amino acid sequences

    在正常情況下,人體內(nèi)僅存在納摩爾(nmol)級(jí)含量的Aβ,且其生理功能尚不清楚。早期研究認(rèn)為,只有淀粉斑或成熟的纖維才具有神經(jīng)毒性[6-8]。而近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明Aβ寡聚體和亞纖維才是毒性的罪魁禍?zhǔn)譡9-12],而淀粉斑和成熟的纖維只是為它們提供了一個(gè)藏身之所。寡聚體和亞纖維能夠促發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),造成軸突損傷、突觸丟失和細(xì)胞凋亡等病理改變,是導(dǎo)致神經(jīng)元變性乃至形成癡呆的重要因素。例如,Kayed等[13]研究發(fā)現(xiàn),無(wú)論聚集態(tài)Aβ是否呈Aβ纖維結(jié)構(gòu),均表現(xiàn)出細(xì)胞毒性,導(dǎo)致神經(jīng)突觸的減少和神經(jīng)元凋亡,且Aβ寡聚體的細(xì)胞毒性遠(yuǎn)大于Aβ纖維的毒性。但也有報(bào)道稱Aβ寡聚體、亞纖維和纖維等Aβ聚集體均有神經(jīng)毒性[4]。因此,具體哪種聚集體觸發(fā)了淀粉樣級(jí)聯(lián)反應(yīng)目前尚無(wú)定論。無(wú)論引起疾病的是Aβ寡聚體還是成熟纖維,或者是兩者同時(shí)作用,只要阻止Aβ聚集就可從根本上消除Aβ所引發(fā)的神經(jīng)毒性。

    在Aβ聚集之前,從初始的無(wú)規(guī)卷曲或α-螺旋結(jié)構(gòu)通過(guò)構(gòu)象轉(zhuǎn)換形成β-折疊結(jié)構(gòu)是Aβ聚集的關(guān)鍵步驟。由于Aβ構(gòu)象轉(zhuǎn)換的速度非???,即使用現(xiàn)階段最先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)手段也無(wú)法完全跟蹤檢測(cè),而理論計(jì)算模擬可以較好地彌補(bǔ)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的上述不足。尤其隨著近年來(lái)計(jì)算能力的大幅提高,計(jì)算方法與分子模擬、虛擬實(shí)驗(yàn)已經(jīng)繼實(shí)驗(yàn)方法、理論方法之后,成為第3個(gè)重要的科學(xué)方法,對(duì)未來(lái)科學(xué)和技術(shù)的發(fā)展起著越來(lái)越重要的作用。而作為最常見的分子模擬方法之一,分子動(dòng)力學(xué)(MD)模擬能夠研究足夠小的時(shí)間和空間尺度,可以清晰、直觀地描述Aβ的二級(jí)結(jié)構(gòu)隨模擬時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程,同時(shí)通過(guò)統(tǒng)計(jì)力學(xué)方法又能方便地得到所研究模擬體系的宏觀性質(zhì)[14]。因此,利用MD模擬可從原子、分子水平上研究Aβ構(gòu)象轉(zhuǎn)換及其抑制的分子機(jī)制,從而掌握Aβ構(gòu)象轉(zhuǎn)換及其抑制的一般規(guī)律,進(jìn)而指導(dǎo)相關(guān)Aβ構(gòu)象轉(zhuǎn)換抑制劑的開發(fā),具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。本文中,筆者主要綜述Aβ構(gòu)象轉(zhuǎn)換及其抑制的MD模擬的研究進(jìn)展,為后續(xù)研究提供參考。

    1 淀粉樣多肽構(gòu)象轉(zhuǎn)換的MD模擬研究

    1.1 MD模擬中常用的Aβ片段

    Aβ在聚集狀態(tài)下以β-折疊為主,而溶解狀態(tài)時(shí)會(huì)受到溶液環(huán)境的影響而呈現(xiàn)不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)。例如,在生物膜和有機(jī)溶劑中以α-螺旋為主[15],在水溶液中則以無(wú)規(guī)卷曲為主[16]。但由于Aβ容易聚集,且其構(gòu)象轉(zhuǎn)變非??欤瑥摩?螺旋或無(wú)規(guī)卷曲到β-折疊的構(gòu)象轉(zhuǎn)變過(guò)程到目前為止仍然無(wú)法用實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定,而MD模擬可以彌補(bǔ)上述實(shí)驗(yàn)研究的不足。但由于全原子MD模擬的計(jì)算量非常大且全序列Aβ的構(gòu)象轉(zhuǎn)換比較復(fù)雜,目前的MD研究大多集中在Aβ片段。Aβ10~35、Aβ12~28、Aβ16~22、Aβ16~35、Aβ25~35、Aβ29~42、Aβ30~42、Aβ31~42和Aβ39~42是研究較多的片段。其中,Aβ25~35、Aβ10~35、Aβ1~28、Aβ1~40和Aβ1~42單體的三維結(jié)構(gòu)已經(jīng)被解析出來(lái)(圖2)。

    圖2 典型Aβ單體的三維結(jié)構(gòu)Fig.2 Typical 3D structures of Aβ monomers

    在上述Aβ片段中,Aβ16~22是能夠形成規(guī)則片層聚集體的最短多肽,因此常被用作模型來(lái)研究Aβ聚集沉淀[17]。Aβ16~22片段的三維結(jié)構(gòu)一般從初始結(jié)構(gòu)為無(wú)規(guī)卷曲的Aβ10~35片段截取或利用分子模擬軟件構(gòu)建線性短肽。由于從線性結(jié)構(gòu)到β折疊的構(gòu)象轉(zhuǎn)換比較簡(jiǎn)單,因此,初始結(jié)構(gòu)為無(wú)規(guī)卷曲的Aβ16~22常被作為目標(biāo)肽段用于構(gòu)象轉(zhuǎn)換研究。即使從初始結(jié)構(gòu)為無(wú)規(guī)卷曲的Aβ16~22開始模擬,其構(gòu)象轉(zhuǎn)換仍然過(guò)于簡(jiǎn)單,因此,該肽段的模擬研究主要集中在其聚集及其抑制過(guò)程[18]。與Aβ16~22相比,Aβ10~35是Aβ構(gòu)象轉(zhuǎn)換過(guò)程中應(yīng)用最多的肽段之一。例如,Massi等[19]利用全原子MD模擬研究了Aβ10~35的構(gòu)象轉(zhuǎn)換,發(fā)現(xiàn)Aβ10~35的疏水核心(LVFFA)和轉(zhuǎn)角區(qū)域(VGSN)在分子內(nèi)氫鍵的作用下都非常穩(wěn)定。在U型纖維結(jié)構(gòu)中,殘基22~29為轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu),且殘基D23和K28之間易于形成鹽橋。該鹽橋在Aβ構(gòu)象轉(zhuǎn)換和聚集過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用。因此,鹽橋D23~K28對(duì)于轉(zhuǎn)角VGSN的形成至關(guān)重要,它已經(jīng)成為Aβ10~35構(gòu)象轉(zhuǎn)換和聚集的限速步驟。利用全原子MD模擬Aβ10~35單體,Tarus等[20]發(fā)現(xiàn)鹽橋D23~K28能夠大大提高VGSN轉(zhuǎn)角的穩(wěn)定性。與此類似,Reddy等[21]分別利用2種力場(chǎng)參數(shù)(OPLS和CHARMM)研究了鹽橋D23~K28對(duì)Aβ10~35單體和二聚體構(gòu)象轉(zhuǎn)換的影響,結(jié)果表明,在整個(gè)模擬過(guò)程中,該鹽橋一直保持溶劑化作用且使19~24區(qū)域形成α-螺旋結(jié)構(gòu)。綜上所述,該鹽橋?qū)θ蛄蠥β纖維的穩(wěn)定同樣起著至關(guān)重要的作用。除了Aβ16~22和Aβ10~35之外,Aβ25~35也被用于構(gòu)象轉(zhuǎn)換過(guò)程的MD模擬研究中。例如,Ma等[22]基于Kramer的能壘穿越理論和Morse功能類似勢(shì)能面理論研究了Aβ25~35片段的自由能勢(shì)能面,發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定的α-螺旋和β-折疊二級(jí)結(jié)構(gòu)均有利于寡聚體的形成。

    雖然相對(duì)于全序列Aβ來(lái)說(shuō),Aβ片段的構(gòu)象轉(zhuǎn)換比較快,但利用常規(guī)MD模擬同樣存在構(gòu)象采樣空間小的缺點(diǎn)。為了大幅提高其采樣范圍,復(fù)制交換分子動(dòng)力學(xué)(REMD)模擬常被用于Aβ片段的構(gòu)象轉(zhuǎn)換研究。REMD模擬就是將一系列無(wú)關(guān)的副本系統(tǒng)分別置于不同的溫度體系下進(jìn)行獨(dú)立的MD模擬[23],然后根據(jù)Metropolis標(biāo)準(zhǔn),在溫度相鄰的每個(gè)副本的構(gòu)象之間進(jìn)行交換,從而可以使低溫構(gòu)象易于逃離局部勢(shì)能最低點(diǎn),使其能在更大的構(gòu)象空間上取樣。因此,利用REMD模擬能夠非常容易獲得蛋白質(zhì)構(gòu)象轉(zhuǎn)換過(guò)程中過(guò)渡態(tài)的結(jié)構(gòu)及其相關(guān)的動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)信息。例如,Cao等[24]利用REMD模擬方法在GROMOS9643A1和OPLS-AA 2種力場(chǎng)下研究了Aβ12~28的構(gòu)象轉(zhuǎn)換,結(jié)果表明,Aβ12~28的構(gòu)象主要是無(wú)規(guī)卷曲,同時(shí)出現(xiàn)短暫的β-折疊結(jié)構(gòu)。但同時(shí),他們也發(fā)現(xiàn)采用不同的力場(chǎng),β-折疊結(jié)構(gòu)的位置會(huì)有所不同。例如,在GROMOS9643A1力場(chǎng)下,殘基19~22處形成β-折疊;而在OPLS-AA力場(chǎng)下,殘基17~20處會(huì)形成β-折疊結(jié)構(gòu)。Baumketner等[25]利用REMD模擬方法研究了Aβ10~35構(gòu)象轉(zhuǎn)換,結(jié)果表明,該肽段在水中主要是無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu),同時(shí)殘基13~15、18~20、26~27和31~33位處會(huì)出現(xiàn)β-轉(zhuǎn)角或彎曲等二級(jí)結(jié)構(gòu)。Alves等[26]利用REMD模擬方法研究了Aβ16~35的構(gòu)象轉(zhuǎn)換,發(fā)現(xiàn)該片段直接從初始的無(wú)規(guī)卷曲轉(zhuǎn)變成β-折疊結(jié)構(gòu),且在整個(gè)構(gòu)象轉(zhuǎn)換過(guò)程中,螺旋結(jié)構(gòu)存在的時(shí)間都很短。除了研究野生型Aβ片段的構(gòu)象轉(zhuǎn)換,相應(yīng)的突變體也常用于MD模擬研究中。例如,Nguyen等[27]利用REMD模擬方法研究了Aβ1~28野生型和突變體A2V的構(gòu)象系統(tǒng),結(jié)果表明,突變體A2V的β-折疊結(jié)構(gòu)的形成速率是野生型的4倍,這和突變體的聚集速率遠(yuǎn)高于野生型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。

    除了采用增強(qiáng)型的采樣方法(如REMD),采用粗?;P屯瑯涌梢岳糜邢薜挠?jì)算資源獲得蛋白質(zhì)的構(gòu)象空間。將粗粒化模型和REMD結(jié)合起來(lái)會(huì)進(jìn)一步提高Aβ片段的構(gòu)象空間。例如,Chebaro等[28]結(jié)合OPEP粗?;?chǎng)和REMD方法計(jì)算了Aβ16~35的單體和二聚體的結(jié)構(gòu)和熱力學(xué)信息,結(jié)果表明,殘基20~21和29~30形成β-折疊結(jié)構(gòu),而殘基22~27形成α-螺旋結(jié)構(gòu)。而相對(duì)于N端,C端更不易形成β-折疊結(jié)構(gòu)。Wu等[29]利用REMD模擬研究了不同C端片段的構(gòu)象轉(zhuǎn)換,結(jié)果發(fā)現(xiàn)片段Aβ29~42、Aβ30~42、Aβ31~42和Aβ39~42都易于形成瞬時(shí)的β-折疊結(jié)構(gòu)。也就是說(shuō),C端的瞬時(shí)β-折疊或β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)是Aβ聚集的前提。上述Aβ片段的研究結(jié)果對(duì)于了解全序列Aβ構(gòu)象轉(zhuǎn)換的研究具有非常重要的意義。雖然在MD模擬研究中經(jīng)常利用這些短肽來(lái)代替全序列Aβ,但這些Aβ片段的聚集過(guò)程、聚集速率和細(xì)胞毒性與全序列Aβ尚有一定的差別。例如,與全序列Aβ1~42相比,Aβ25~35具有更快的聚集速率[30]。然而,由于不同大小的Aβ片段之間的作用力會(huì)有一定差別,從而會(huì)影響該片段構(gòu)象的形成。因此,僅研究Aβ片段仍然不能很好地了解全序列Aβ的聚集中間體的具體構(gòu)象以及它們的聚集特性。

    表1 淀粉樣β多肽片段構(gòu)象轉(zhuǎn)換的分子動(dòng)力學(xué)研究

    1.2 全序列Aβ1~40和Aβ1~42

    由于計(jì)算資源的限制,早期的研究主要集中在不同溶液環(huán)境中Aβ片段的構(gòu)象轉(zhuǎn)換。隨著近年來(lái)計(jì)算機(jī)軟硬件技術(shù)的飛速發(fā)展,越來(lái)越多的研究集中在全序列Aβ的構(gòu)象轉(zhuǎn)換。例如,Xu等[39]利用全原子MD模擬研究了Aβ1~40在水和膜環(huán)境中從初始的α-螺旋到β-折疊的整個(gè)構(gòu)象轉(zhuǎn)換過(guò)程,發(fā)現(xiàn)殘基G25、G29、G33和G37對(duì)于Aβ1~40形成β-折疊結(jié)構(gòu)至關(guān)重要。將這4個(gè)甘氨酸(Gly)突變成丙氨酸(Ala)后就完全抑制了其構(gòu)象轉(zhuǎn)換,在整個(gè)100 ns模擬過(guò)程中,Aβ1~40一直保持初始的α-螺旋結(jié)構(gòu)。而在1,2-二棕櫚酸甘油-3-磷脂酰膽堿(DPPC)膜內(nèi),Aβ1~40主要為α-螺旋結(jié)構(gòu)。Flock等[40]發(fā)現(xiàn)殘基V18、F19、A21和G25發(fā)生疏水團(tuán)聚,兩段α-螺旋結(jié)構(gòu)的殘基8~25和28~39至少有一段會(huì)快速變成無(wú)規(guī)卷曲或β-折疊結(jié)構(gòu)。為了研究不同力場(chǎng)參數(shù)對(duì)Aβ構(gòu)象轉(zhuǎn)換的影響,Olubiyi等[41]分別利用2種不同的GROMOS力場(chǎng)參數(shù)(GROMOS96 43a2和GROMOS96 53a6)研究了不同pH條件下Aβ1~40和Aβ1~42的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化,結(jié)果表明,N端的10個(gè)氨基酸殘基為無(wú)定序結(jié)構(gòu),而3個(gè)組氨酸的質(zhì)子化會(huì)加速β-折疊結(jié)構(gòu)的形成。

    針對(duì)全序列Aβ,國(guó)內(nèi)外很多研究組也開展了氨基酸突變對(duì)其構(gòu)象的影響。例如,Viet等[44]利用MD模擬研究了Aβ1~40和Aβ1~42及其突變體D7N的構(gòu)象轉(zhuǎn)換情況,結(jié)果表明,突變體D7N的二級(jí)結(jié)構(gòu)中,R5和M35的β-折疊含量很高。而與之相反,F(xiàn)4和K16的β-折疊含量卻很低。野生型Aβ1~42的殘基R5、K6、V18、F19、N27、K28、V40和I41極易形成β-折疊結(jié)構(gòu)。而突變體D7N的β-折疊主要集中在殘基V12、H13、I31、I32、M35和G38??傊蠖鄶?shù)全序列Aβ單體的MD研究結(jié)果表明,N端殘基1~10主要為無(wú)定序結(jié)構(gòu),疏水核心區(qū)域(殘基10~21)主要為α-螺旋結(jié)構(gòu),而C端30~42殘基主要為β-折疊結(jié)構(gòu),殘基21~30是Aβ聚集的核心部位。然而,由于Aβ構(gòu)象轉(zhuǎn)換速度比較慢,僅利用傳統(tǒng)MD模擬很難獲得其構(gòu)象轉(zhuǎn)換過(guò)程中的瞬時(shí)構(gòu)象。因此,利用增強(qiáng)性采樣方法來(lái)增強(qiáng)Aβ構(gòu)象轉(zhuǎn)換過(guò)程中的構(gòu)象采集就顯得非常必要,其中REMD是最常用的增強(qiáng)性采樣方法[23]。因此,REMD也已廣泛用于全序列Aβ構(gòu)象轉(zhuǎn)換的研究中[45]。例如,Sgourakis等[46]利用REMD模擬發(fā)現(xiàn),Aβ1~42的C端比Aβ1~40的有序,其主要原因是Aβ1~42的殘基31~34和38~41形成的β-折疊結(jié)構(gòu)大大降低了C端柔性,從而使其易于纖維化。而Roseman等[47]的研究結(jié)果表明殘基16~23更易于形成β-折疊結(jié)構(gòu)。Yang等[43]利用微秒(μs)級(jí)的REMD模擬發(fā)現(xiàn),Aβ1~42的β-折疊結(jié)構(gòu)遠(yuǎn)比Aβ1~40的穩(wěn)定,且Aβ1~42的殘基30~42的接觸比Aβ1~40頻繁得多,從而使Aβ1~42更易于形成轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。

    表2 全序列Aβ構(gòu)象轉(zhuǎn)換的分子動(dòng)力學(xué)研究

    除了溶液pH、溫度和突變對(duì)Aβ構(gòu)象轉(zhuǎn)換影響的研究之外,Aβ1~42中一些殘基(如甲硫氨酸)的氧化還原對(duì)Aβ構(gòu)象轉(zhuǎn)換的影響也是研究比較多的。其中,殘基M35的氧化會(huì)對(duì)Aβ1~42構(gòu)象轉(zhuǎn)換產(chǎn)生較大的影響。例如,Triguero等[48]利用全原子MD模擬研究了M35 Cγ上的亞甲基被亞砜(M35(O))和砜M35(O2)替代后對(duì)Aβ1~42二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響,結(jié)果表明,M35(O)突變體在疏水區(qū)域29~35部分形成穩(wěn)定的由轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)連接的β-折疊結(jié)構(gòu),而M35(O2)突變體的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋為主。即,Met35氧化成亞砜和砜均會(huì)影響其與周圍殘基I31、K34和I41之間的疏水相互作用。

    2 抑制劑抑制Aβ構(gòu)象轉(zhuǎn)換的MD模擬研究

    2.1 小分子抑制劑

    淀粉樣假說(shuō)認(rèn)為,AD病發(fā)的關(guān)鍵因素之一是Aβ在大腦內(nèi)由無(wú)規(guī)卷曲的單體轉(zhuǎn)變?yōu)楹笑?折疊為主的結(jié)構(gòu),然后進(jìn)一步相互聚集形成各種形態(tài)的具有細(xì)胞毒性的聚集體。因此,抑制其單體的構(gòu)象轉(zhuǎn)變和聚集就成為治療AD的首選療法。海藻糖是最早發(fā)現(xiàn)的能夠抑制Aβ構(gòu)象轉(zhuǎn)換的抑制劑之一,但其抑制Aβ構(gòu)象轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制尚不清楚。為了解決這個(gè)問(wèn)題,Liu等[18,49]利用全原子MD模擬研究了海藻糖與Aβ1~40和Aβ1~42之間的相互作用,揭示了海藻糖抑制2種全序列Aβ構(gòu)象轉(zhuǎn)變的分子機(jī)制,研究發(fā)現(xiàn),海藻糖溶液的濃度對(duì)Aβ的構(gòu)象轉(zhuǎn)變具有非常重要的影響[50],在水和低濃度的海藻糖溶液中,Aβ1~42單體可由初始的α-螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成β-折疊的二級(jí)結(jié)構(gòu);但高濃度海藻糖能夠有效抑制Aβ1~42的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。抑制Aβ1~40和Aβ1~42的海藻糖濃度是不同的,分別為0.18和0.37 mol/L,這主要是因?yàn)锳β1~42的疏水作用要強(qiáng)于Aβ1~40。海藻糖的優(yōu)先排阻作用會(huì)使水分子在多肽周圍0.2 nm內(nèi)富集,而海藻糖卻在距離多肽0.4 nm的位置附近團(tuán)聚,這是海藻糖抑制Aβ構(gòu)象轉(zhuǎn)變的主要原因。海藻糖的優(yōu)先排阻作用是通過(guò)降低多肽間的疏水相互作用,減少多肽分子內(nèi)遠(yuǎn)距離的接觸,有效抑制多肽的疏水塌縮和構(gòu)象轉(zhuǎn)變。

    茶多酚(EGCG)在預(yù)防和治療Aβ的錯(cuò)誤折疊和聚集方面有顯著的功效,現(xiàn)已進(jìn)入Ⅱ期臨床。但是EGCG抑制Aβ構(gòu)象轉(zhuǎn)換的作用機(jī)制尚不明確。筆者利用全原子MD模擬和分子力學(xué)-泊松-波爾茨曼可接近表面積方法(MM/PBSA)研究了EGCG抑制Aβ1~42構(gòu)象轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制[51],結(jié)果發(fā)現(xiàn),EGCG抑制Aβ1~42的構(gòu)象轉(zhuǎn)變與其濃度正相關(guān),在水和低濃度EGCG溶液中,Aβ1~42能夠從初始的α-螺旋結(jié)構(gòu)通過(guò)構(gòu)象轉(zhuǎn)換形成β-折疊為主的二級(jí)結(jié)構(gòu),但在高濃度(0.08 mol/L)EGCG溶液中,EGCG完全抑制了β-折疊的形成。EGCG和Aβ1~42之間的直接相互作用是其抑制Aβ1~42構(gòu)象轉(zhuǎn)換的主要原因。在EGCG溶液中,EGCG能夠?qū)⒍嚯闹車乃肿优砰_并直接與多肽發(fā)生作用。為了進(jìn)一步解析EGCG 和Aβ1~42之間的作用力類型,又利用 MM/PBSA計(jì)算了EGCG和Aβ1~42之間的作用力,結(jié)果表明,EGCG和Aβ1~42之間的非極性和極性作用都有利于EGCG和Aβ1~42的結(jié)合,但非極性作用的貢獻(xiàn)為主(71%),且主要由范德華作用提供,而極性相互作用卻很小。進(jìn)一步利用 MM/PBSA自由能分解確定了Aβ1~42的12個(gè)關(guān)鍵的氨基酸殘基F4、R5、F19、F20、E22、K28、G29、L34~G37和I41,它們與 EGCG一樣具有非常重要的作用。MM/PBSA 作用力分解結(jié)果表明,非極性相互作用主要由疏水性殘基的側(cè)鏈和一些非疏水性殘基的主鏈所提供。與此相反,EGCG與Aβ1~42之間的極性相互作用卻由多肽的主鏈所提供,尤其是殘基Gly29和Gly37。該研究從全新的角度闡釋了EGCG 抑制Aβ1~42構(gòu)象轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制,為進(jìn)一步理性設(shè)計(jì)AD的高效抑制劑奠定了理論基礎(chǔ)。

    海洋類植物含有大量的化學(xué)結(jié)構(gòu)各異的化合物,現(xiàn)已從中篩選出一些比較有效的抗菌、抗腫瘤和殺蟲的化合物,為新藥研發(fā)提供了新的途徑。其中,巖藻黃素是存在于褐藻、硅藻和金藻等海洋藻類植物中的一種海洋類胡蘿卜素,系統(tǒng)的生物物理、生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等研究發(fā)現(xiàn):巖藻黃素能夠有效抑制Aβ聚集形成低聚物和纖維,并能顯著降低Aβ聚集體的神經(jīng)毒性[52]。同時(shí),利用MD模擬分析,揭示了巖藻黃素與Aβ1~42之間的作用力主要為疏水相互作用,且進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),巖藻黃素通過(guò)阻止Aβ的構(gòu)象轉(zhuǎn)換來(lái)抑制其聚集。此外,巖藻黃素還能顯著抑制Aβ寡聚體注射小鼠海馬的氧化應(yīng)激反應(yīng),大大減輕Aβ寡聚體注射小鼠的認(rèn)知障礙,增加腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)和ChAT陽(yáng)性區(qū)域。5-Hydroxycyclopenicillone是從海綿植物中分離獲得的一種環(huán)狀戊烯酮分子,利用斑點(diǎn)印跡分析和透射電子顯微鏡(TEM)發(fā)現(xiàn)其能夠有效地減少Aβ1~42寡聚體形成。為了進(jìn)一步探究5-hydroxycyclopenicillone抑制Aβ1~42構(gòu)象轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制,Zhao等[53]利用全原子MD模擬研究了其與Aβ1~42單體之間的相互作用,結(jié)果表明,5-hydroxycyclopenicillone和Aβ1~42之間的疏水作用可能會(huì)阻止Aβ1~42構(gòu)象的轉(zhuǎn)變和寡聚化。此外,Aβ1~42寡聚體和5-hydroxycyclopenicillone一起預(yù)孵育后加入到神經(jīng)元SH-SY5Y細(xì)胞中時(shí),其毒性比正常Aβ1~42寡聚體低。

    大量的實(shí)驗(yàn)證明磺胺類藥能夠抑制Aβ聚集并減緩AD的癥狀。其中,體內(nèi)和體外研究結(jié)果證明,(2,5-dichloro-N)-4-piperidinophenyl 3-thiophenesulfonamide(C1)能夠抑制Aβ1~42的聚集沉淀。為了探明C1抑制Aβ1~42構(gòu)象轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制,Shuaib等[54]利用全原子MD模擬研究了C1與Aβ1~42單體構(gòu)象轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制,結(jié)果表明,C1通過(guò)氫鍵和π-π相互作用緊密結(jié)合Aβ1~42的α-螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)域13~26,從而抑制其構(gòu)象轉(zhuǎn)換。MM/PBSA自由能計(jì)算結(jié)果表明,殘基Ala2、Phe4、Tyr10、Gln5、Lys6、Leu7、Val8、Phe20、Glu22和Met35的貢獻(xiàn)最大。

    2.2 多肽抑制劑

    相對(duì)于小分子,多肽具有優(yōu)良的生物相容性、易透過(guò)血腦屏障、毒副作用小以及易合成和修飾改性等優(yōu)點(diǎn),已廣泛用于Aβ構(gòu)象轉(zhuǎn)換的抑制[55]。目前,大多數(shù)短肽類抑制劑均是從Aβ的疏水核心序列和β-折疊序列中抽取的片段,如Aβ16~20(KLVFF)、Aβ17~21(LVFFA)、Aβ31~42(IIGLMVGGVVIA)和Aβ39~42(VVIA)等以及它們的衍生序列(LPFFD)。例如,Yang等[56]利用分子對(duì)接獲得的Aβ1~42-LPFFD復(fù)合物為初始結(jié)構(gòu),利用全原子MD模擬解析了多肽抑制劑 LPFFD 抑制 Aβ1~42構(gòu)象轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制,結(jié)果表明LPFFD通過(guò)破壞Aβ1~42的鹽橋D23~K28來(lái)抑制Aβ1~42的構(gòu)象轉(zhuǎn)換。Viet等[57]結(jié)合MD模擬和自由能計(jì)算方法解析了短肽抑制劑KLVFF和LPFFD影響Aβ16~22聚集和Aβ1~40構(gòu)象轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制,并解析了抑制劑與Aβ之間的親和力與其抑制能力之間的關(guān)系。筆者應(yīng)用MD模擬和結(jié)合自由能計(jì)算方法研究了多肽抑制劑KLVFF、VVIA和LPFFD抑制Aβ1~42構(gòu)象轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制[49,58],結(jié)果表明,3種多肽抑制劑均能夠有效抑制Aβ1~42的構(gòu)象轉(zhuǎn)換。另外,多肽抑制劑降低了Aβ1~42分子內(nèi)的疏水相互作用,減少了多肽分子內(nèi)遠(yuǎn)距離的接觸,有效抑制了Aβ1~42的疏水塌縮,從而起到穩(wěn)定其初始構(gòu)象的作用。這些抑制劑與Aβ1~42之間的疏水和靜電相互作用均有利于它們抑制Aβ1~42的構(gòu)象轉(zhuǎn)換。此外,抑制劑中的帶電氨基酸殘基可以增強(qiáng)其和Aβ1~42之間的靜電相互作用,并降低抑制劑之間的聚集,從而大大增強(qiáng)對(duì)Aβ1~42構(gòu)象轉(zhuǎn)換的抑制能力,但脯氨酸的引入會(huì)破壞多肽的線性結(jié)構(gòu),從而大大降低其與Aβ1~42之間的作用力。為了進(jìn)一步提高短肽抑制劑與Aβ之間的親和性,筆者基于Aβ纖維的分子作用機(jī)制[59],在Aβ17~21(LVFFA)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上添加2個(gè)帶正電荷的R和K,獲得LK7(LVFFARK)短肽抑制劑[60],硫黃素(ThT)結(jié)合試驗(yàn)和投射電子顯微鏡(TEM)的分析結(jié)果表明,LK7能夠抑制Aβ1~42聚集,但LK7的抑制效果呈現(xiàn)先上升后下降的效果。即,當(dāng)LK7與Aβ1~42的濃度比大于1∶ 1之后,LK7的抑制效果反而下降。究其原因,LK7具有非常強(qiáng)烈的自聚效果,LK7的自聚除了會(huì)大大降低其抑制Aβ1~42的聚集性,且其聚集體具有強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性作用。為了克服LK7的自聚,Xiong等[60]將其固定化到PLGA納米球上,獲得納米抑制劑LK7@PLGA-NPs,通過(guò)進(jìn)一步系統(tǒng)的生物物理、生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,該納米抑制劑在較低的濃度下仍然具有很好的抑制Aβ1~42聚集的效果;在同濃度的游離LK7條件下,LK7基本沒有任何抑制效果。

    利用MD模擬、MM/PBSA自由能計(jì)算和分解方法研究了ZAβ3-Aβ16~40復(fù)合物之間的相互作用機(jī)制[61],結(jié)果表明,ZAβ3的β-股和Aβ16~40單體的β-股之間的親和作用占主導(dǎo),而α-螺旋與 Aβ16~40的作用力很小。利用MM/PBSA自由能分解發(fā)現(xiàn)ZAβ3和Aβ16~40的熱點(diǎn)殘基,ZAβ3通過(guò)將發(fā)夾型Aβ單體包埋在α-螺旋圍成的疏水性腔體內(nèi)來(lái)阻礙Aβ聚集。這種結(jié)合模式為設(shè)計(jì)高效的Aβ蛋白質(zhì)類抑制劑提供了3個(gè)基本要素:高親和性的結(jié)合片段β-股、附屬結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定的構(gòu)象。高親和性結(jié)合片段能競(jìng)爭(zhēng)性地與Aβ單體結(jié)合,附屬結(jié)構(gòu)卻能夠阻礙其他Aβ單體靠近,而穩(wěn)定的構(gòu)象是上述2種要素發(fā)揮作用的基礎(chǔ),三者協(xié)同作用可以有效地抑制Aβ聚集。

    考慮到基于Aβ片段衍生出的多肽抑制劑極易自聚形成富含β-折疊片段的纖維結(jié)構(gòu),Wang等[62]首次提出了相似作用的理念去設(shè)計(jì)新的異源自組裝多肽抑制劑,他們認(rèn)為具有相似β二級(jí)結(jié)構(gòu)特征多肽序列作為異源多肽抑制劑的候選,這些異源多肽抑制劑可以自組裝成β折疊片結(jié)構(gòu),與Aβ聚集的β折疊片非常相似。這種相似的結(jié)構(gòu),很有可能導(dǎo)致相似的抑制Aβ作用,從而達(dá)到抑制 Aβ之間的相互作用和聚集;然后用定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)和分子對(duì)接設(shè)計(jì)篩選了1 000條異源自組裝多肽抑制劑;最后利用系統(tǒng)的生物物理、生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)篩選出一些高效多肽抑制劑序列,發(fā)現(xiàn)這些多肽具有以下3個(gè)優(yōu)點(diǎn):自身無(wú)毒或低毒,抑制Aβ聚集或結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換,抑制或減低Aβ所引起的細(xì)胞毒性。分子模擬實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了這些高效多肽抑制劑是通過(guò)形成β折疊片結(jié)構(gòu)來(lái)抑制 Aβ寡聚體的形成。

    3 展望

    Aβ構(gòu)象轉(zhuǎn)換和聚集在AD的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。利用MD模擬研究探明Aβ構(gòu)象轉(zhuǎn)換及其現(xiàn)有抑制劑抑制其構(gòu)象轉(zhuǎn)換的作用機(jī)制,可以進(jìn)一步揭示AD的發(fā)病機(jī)制,為今后AD藥物的開發(fā)和研究提供思路和方向。

    力場(chǎng)對(duì)于利用MD模擬研究Aβ構(gòu)象轉(zhuǎn)換的影響非常大[63]。合適的力場(chǎng)能夠揭示很多有用的信息,但不合適的力場(chǎng)很可能就會(huì)得到錯(cuò)誤的信息[64]。隨著計(jì)算機(jī)軟硬件技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展,尤其是分子力場(chǎng)和MD模擬基本原理的飛速發(fā)展,MD模擬現(xiàn)存的上述問(wèn)題將逐步得到解決,作為一種新興的技術(shù),MD模擬必將在Aβ構(gòu)象轉(zhuǎn)換和抑制及其Aβ聚集抑制劑開發(fā)方面的應(yīng)用越來(lái)越廣泛,從而為AD有效藥物的開發(fā)貢獻(xiàn)更多的力量。

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