南極磷蝦中不同形態(tài)蝦青素的分離制備、結(jié)構(gòu)鑒定及含量分析

叢心緣，孫偉紅，張輝珍，冷凱良，邢麗紅，苗鈞魁，劉小芳

1 (青島大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，山東 青島，266071)2 (中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部極地漁業(yè)開發(fā)重點實驗室，山東 青島，266071)3(青島市食品藥品監(jiān)督管理局，山東 青島，266100) 4(海洋國家實驗室海洋藥物與生物制品功能實驗室，山東 青島，266100)

南極磷蝦(Antarctic krill)是生活在南極洲水域的甲殼類無脊椎動物，蘊(yùn)藏量十分豐富，有極大的開發(fā)價值[1]，富含二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等n-3多不飽和脂肪酸，生物利用度高于魚油，有降血脂，預(yù)防心腦血管疾病的保健功效[2-4]。南極磷蝦除了具有高優(yōu)質(zhì)蛋白、低碳水化合物、高脂質(zhì)等優(yōu)點外[5]，還含有活性物質(zhì)蝦青素。

蝦青素(astaxanthin)為萜烯類不飽和化合物，分子式:C40H52O4，具有較長的共軛雙鍵鏈，其化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，存在多種同分異構(gòu)體[6]，最常見有13-順蝦青素、全反式蝦青素和9-順蝦青素。蝦青素共軛雙鍵鏈兩端環(huán)結(jié)構(gòu)存在兩個手性中心，分別可以產(chǎn)生3種光學(xué)異構(gòu)體: 3S,3′S、3S,3′R、3R，3′R[7]。蝦青素在海洋生物如藻類、蝦、蟹中含量較高[8]，是目前已知的抗氧化性最強(qiáng)的天然抗氧化劑之一，能緩解皮膚因紫外線輻照而帶來的傷害[9]，有清除自由基、增強(qiáng)免疫力、改善動脈硬化等作用[10-11]。雨生紅球藻、紅發(fā)夫酵母和南極磷蝦是蝦青素的重要生物來源[12]，其中雨生紅球藻和南極磷蝦中的蝦青素大多以蝦青素酯的形態(tài)存在，脂肪酸的羧基可以和蝦青素共軛雙鍵末端的羥基結(jié)合形成酯，根據(jù)結(jié)合脂肪酸的數(shù)量，可以分為蝦青素單酯和蝦青素雙酯[13]。

南極磷蝦中超過90%的蝦青素是以蝦青素酯的形式存在[14]。目前對蝦青素的研究主要集中在對游離蝦青素的提取及活性研究[15-16]，張莎莎[17]利用硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯為洗脫劑分離南極磷蝦蝦青素酯，該方法只能分別制備蝦青素單酯或蝦青素雙酯，無法1次完成不同形態(tài)蝦青素的分離。南極磷蝦總蝦青素中3S,3′S、3S, 3′R、3R，3′R 3種立體異構(gòu)體比例分別為: 10%～20%、10%～20%、60%～70%[18]，但對南極磷蝦中不同形態(tài)的蝦青素結(jié)構(gòu)的研究未見報道。YAMAGUCHI等[19]研究表明南極磷蝦中蝦青素單酯占25%～35%，雙酯占55%～64%，該研究利用薄層色譜法進(jìn)行相對含量的測定，缺少對不同形態(tài)蝦青素含量的準(zhǔn)確定量。本實驗首次采用石油醚-丙酮溶液作為洗脫體系，利用硅膠柱層析分離南極磷蝦中不同形態(tài)的蝦青素，并對分離出的蝦青素進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和含量測定，為深入研究南極磷蝦中不同形態(tài)蝦青素的構(gòu)效關(guān)系和功能食品開發(fā)提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南極磷蝦，遼寧省大連海洋漁業(yè)集團(tuán)公司，于-80 ℃ 保存；全反式蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品，德國Dr.Ehrenstorfer公司，純度(95.8±0.5)%。

甲醇、正己烷、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷(色譜純)，德國Merck公司；柱層析硅膠(200-300目)、GF254薄層色譜硅膠，青島海洋化工廠；所有分離用有機(jī)溶劑均為國產(chǎn)分析純。無水MgSO4、NaOH等均為優(yōu)級純。

1.2 儀器與設(shè)備

1100液相色譜儀(配紫外檢測器)，美國Agilent公司；R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士Buchi公司；KQ-300E超聲波清洗機(jī)，昆山超聲儀器有限公司；CR22G 高速冷凍離心機(jī)，日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

準(zhǔn)確稱取南極磷蝦試樣100 g，加入無水MgSO4，按1∶5的料液比(g∶mL)用丙酮低溫超聲浸提15 min，4 ℃下8 000 r/min離心5 min取上清液，多次提取直至提取液無明顯紅色，合并上清液，室溫下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得到5.29 g南極磷蝦蝦青素粗提物。

1.3.2 硅膠柱層析分離蝦青素酯

實驗對層析柱的規(guī)格(2 cm×30 cm、3 cm×40 cm、2.5 cm×50 cm)、硅膠用量(30、50、70倍上樣量)和洗脫體系(石油醚-乙酸乙酯體系、石油醚-丙酮體系)進(jìn)行比較。稱取75 g 200～300目的硅膠，120 ℃活化4 h，冷卻至室溫后在石油醚中浸泡過夜。采用濕法裝柱，首先倒入適量石油醚充分潤洗層析柱，在柱內(nèi)預(yù)留5～10 cm的石油醚，將硅膠沿壁緩緩倒入層析柱中，用玻璃棒輕輕敲打?qū)游鲋苊鈹鄬雍蜌馀莸漠a(chǎn)生。硅膠完全倒入后，石油醚沖洗1 h，待硅膠柱高度不變后，取2.5 g樣品用少量石油醚溶解后沿內(nèi)壁緩慢倒入，塞入小團(tuán)脫脂棉開始洗脫。利用石油醚-丙酮作為洗脫體系，以3.5 mL/min的流速洗脫。首先用2%丙酮-石油醚淋洗，棄去開始流出的約300 mL餾分；然后依次用石油醚-丙酮(94∶6、88∶12、75∶25)3個梯度洗脫，收集洗脫下來的3條色帶，室溫下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將溶劑旋出，稱重，充氮密封冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 展開劑的篩選

考察11種展開劑體系，分別進(jìn)行薄層層析實驗。選擇適合分離蝦青素酯的展開劑系統(tǒng)，將展開劑倒入展開缸中穩(wěn)定30 min，少量丙酮溶解樣品后，用3 mm毛細(xì)點樣管在距離硅膠板下緣1.5 cm處重復(fù)點樣，盡量減小點樣斑點，待硅膠板完全干燥后放入展開缸，在溶劑前沿距離硅膠板邊緣2 cm處取出。展開劑體系的組成見表1。

表1 不同展開劑的組成Table 1 Composition of different developers

1.3.4 南極磷蝦中不同形態(tài)蝦青素的光學(xué)異構(gòu)體鑒定

首先將蝦青素酯水解為游離蝦青素，參考孫偉紅等[20]水解過程，皂化條件如下:將制備的蝦青素酯用丙酮溶解，加入適量0.02 mol/L NaOH甲醇溶液在4 ℃條件下反應(yīng)過夜，然后在試樣溶液中加入0.6 mol/L磷酸甲醇溶液中和剩余的堿，最后加入N-丙基乙二胺(PSA)填料凈化，渦旋靜置后使微孔濾膜待測。游離蝦青素不需皂化，通過微孔濾膜后可直接進(jìn)樣。

色譜條件[21]： Chiralpak IC柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以甲基叔丁基醚-甲醇(50∶50，V/V)為流動相，采用等度洗脫，洗脫流速為1 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

1.3.5 南極磷蝦中不同形態(tài)蝦青素含量的測定

稱取30 mg蝦青素雙酯、6 mg蝦青素單酯分別加入2 mL丙酮溶解后，進(jìn)行1.3.4的皂化步驟后，供HPLC檢測，游離蝦青素不需皂化可直接進(jìn)樣。

液相色譜條件[20]：C30色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相A：甲醇溶液，流動相B：叔丁基甲醚，流動相C：1%磷酸溶液；洗脫流速為1 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。線性梯度洗脫條件：0 ～15 min，B由15%上升到30%、C為4%；15～23 min，B由30%上升到80%、C為4%；23～27 min，B為80%、C為4%；27～30 min，B由80%上升到15%、C為4%；30～35 min，B為15%、C為4%。

實驗以全反式蝦青素標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行定量，但皂化過程中會有一部分全反式蝦青素轉(zhuǎn)化為13-順蝦青素和9-順蝦青素，具體計算公式如下[19]：

實際蝦青素含量=1.3×13-順式蝦青素+全反式蝦青素+1.1×9-順式蝦青素。

2 結(jié)果與分析

2.1 硅膠柱層析分離南極磷蝦中不同形態(tài)蝦青素

本實驗參考張沙沙[17]對南極磷蝦中蝦青素酯的分離提純方法，采用硅膠柱層析法分離蝦青素酯。為保證最佳分離效果，經(jīng)過反復(fù)實驗發(fā)現(xiàn)2 cm×30 cm層析柱上樣量小，不能滿足后續(xù)實驗需要；2.5 cm×50 cm層析柱洗脫時間過長，洗脫劑用量較大；3 cm×40 cm層析柱在上樣量、分離效果和洗脫時間都可以達(dá)到要求。硅膠用量不僅與上樣量有關(guān)，也影響洗脫時間和分離效果，多次試驗后發(fā)現(xiàn)，上樣量2.5 g，硅膠用量為上樣量的30倍，硅膠高度30 cm時，分離和制備效果最佳。硅膠石油醚-乙酸乙酯體系是柱層析常用體系，但在研究過程中發(fā)現(xiàn)這個體系洗脫時間較長，可能導(dǎo)致蝦青素氧化；石油醚-丙酮體系在分離效果和洗脫時間上都優(yōu)于石油醚-乙酸乙酯體系，依次嘗試不同比例的丙酮-石油醚溶液，丙酮比例過大會導(dǎo)致所有蝦青素色帶整體下移，未能達(dá)到分離效果，若丙酮比例過小則洗脫速度太慢或蝦青素酯無法洗脫。經(jīng)多次實驗發(fā)現(xiàn)依次用2%、6%、12%和25%的丙酮-石油醚溶液洗脫可接下3條紅色色帶且硅膠柱上無明顯紅色殘留。根據(jù)上述實驗結(jié)果，本實驗使用3 cm×40 cm的層析柱、硅膠填充量為75.0 g、上樣量為2.5 g，石油醚-丙酮作為洗脫體系。收集的第一條色帶重量為1.06 g，第二條色帶重量為0.13 g，第三條色帶因含量太低未進(jìn)行準(zhǔn)確稱量。

2.2 展開劑的篩選及薄層層析法鑒定

薄層層析法是一種快速分離和定性分析少量化合物的方法，具有操作簡單、快速等優(yōu)點。蝦青素有肉眼可見的紅色，無需使用顯色劑或者紫外燈照射，可直接采用薄層層析法分離鑒定不同形態(tài)蝦青素。本研究嘗試了幾種常見的適用于弱極性脂類的展開劑，結(jié)果見表2。

表2 不同展開劑的展開效果Table 2 Efficiency of different developers

表2采用正己烷-乙酸乙酯、正己烷-二氯甲烷等展開體系進(jìn)行薄層層析時，蝦青素隨展開劑的前沿呈一條直線上移，無法將不同形態(tài)蝦青素進(jìn)行分離。而正己烷-丙酮展開體系表現(xiàn)出較強(qiáng)的分離蝦青素及蝦青素酯的能力，HAA1和HAA2都可以將不同形態(tài)蝦青素分開，加入適量的乙酸還可以改善拖尾現(xiàn)象。通過計算比移值(Rf值)發(fā)現(xiàn)，HAA1展開體系分離的雙酯、單酯、游離蝦青素的Rf值分別為0.86、0.70、0.47；HAA2展開體系分離的雙酯、單酯、游離蝦青素的Rf值分別為0.73、0.53、0.30。Rf值一般在0.2～0.8較為合適，所以最終選擇V(正己烷)∶V(丙酮)∶V(乙酸)=8∶2∶0.2做為最佳展開劑。

用HAA1展開劑分離南極磷蝦中不同形態(tài)蝦青素時，薄層層析板有3條清晰的色帶，如圖1中的b所示。圖1中的a、c、d分別是收集的第三條、第一條和第二條色帶。根據(jù)蝦青素的極性大小和孫曉昀研究內(nèi)容來看[22]可以確定圖中點1為蝦青素雙酯，點2為蝦青素單酯，點3為游離蝦青素。a、c、d 3個樣品都只出現(xiàn)了1條色帶，說明樣品的純度較高。3條色帶與南極磷蝦蝦青素粗提物的3點一一對應(yīng)，證明接下來的3條色帶依次為蝦青素雙酯、蝦青素單酯及游離蝦青素，柱層析法可以從南極磷蝦中分離制備不同形態(tài)蝦青素。

1-蝦青素雙酯;2-蝦青素單酯;3-游離的蝦青素 a-第三條色帶;b-南極磷蝦蝦青素粗提物;c-第一條色帶;d-第二條色帶圖1 分離不同形態(tài)蝦青素效果對比圖Fig.1 The effect of separating different forms of astaxanthin

2.3 南極磷蝦中不同形態(tài)蝦青素光學(xué)異構(gòu)體的鑒定

通過手性柱對南極磷蝦中不同形態(tài)蝦青素和合成蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了立體結(jié)構(gòu)鑒定。由圖2看出，合成蝦青素中3S,3′S、3S, 3′R、3R，3′R的比例為1∶2∶1， 南極磷蝦雙酯和南極磷蝦單酯中3R,3′R所占比例都在70%以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于3S,3′S和3S,3′R、3S,3′S比例最低，南極磷蝦的游離蝦青素約含有65%的3R、3′R，3R，3′R含量比蝦青素酯低，3S,3′S和3S, 3′R所占比例相近。雨生紅球藻粉含有87.6%的3S，3′S，10.1%的3S和3′R和2.3%的3R，3′R，紅發(fā)夫酵母中提取的蝦青素絕大部分以3R，3′R組成，僅含有1.5%的3S，3′R[23]。3種不同生物來源的蝦青素相比較，發(fā)現(xiàn)立體結(jié)構(gòu)存在很大差別，南極磷蝦中3R，3′R所占比例高于雨生紅球藻但低于紅發(fā)夫酵母；3S，3′R含量：南極磷蝦>雨生紅球藻>紅發(fā)夫酵母；3S，3′S在雨生紅球藻蝦青素中高達(dá)87.6%，紅發(fā)夫酵母不存在這個光學(xué)異構(gòu)體結(jié)構(gòu)。

圖2 蝦青素光學(xué)異構(gòu)體組成Fig.2 Composition of astaxanthin optical isomers

2.4 南極磷蝦中不同形態(tài)蝦青素含量的測定

由于蝦青素酯沒有相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品，因此南極磷蝦中蝦青素酯需要轉(zhuǎn)化為游離態(tài)蝦青素后才能進(jìn)行準(zhǔn)確定量。本實驗將南極磷蝦中不同形態(tài)蝦青素樣品通過水解凈化后經(jīng)C30-HPLC法進(jìn)行了測定(圖3～圖5)。

圖3 南極磷蝦中游離蝦青素譜圖Fig.3 Free astaxanthin spectrum in Antarctic krill

圖4 南極磷蝦中蝦青素雙酯皂化后譜圖Fig.4 Spectrogram of saponification of Astaxanthin diester in Antarctic krill

圖5 南極磷蝦中蝦青素單酯皂化后譜圖Fig.5 Spectrogram of saponification of astaxanthin monoester in Antarctic krill

南極磷蝦中總蝦青素含量為18.9 mg/kg，南極磷蝦的蝦青素雙酯中蝦青素含量為12.0 mg/kg，蝦青素單酯中蝦青素含量為6.1 mg/kg，南極磷蝦中游離蝦青素含量為0.8 mg/kg。蝦青素雙酯約為蝦青素單酯的2倍，游離蝦青素含量不到總蝦青素的5%。

3 結(jié)論

本研究以丙酮-石油醚溶液為洗脫體系，對硅膠柱層析技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化，分離南極磷蝦中不同形態(tài)蝦青素。篩選出最佳展開劑體系V(正己烷)∶V(丙酮)∶V(乙酸)=8∶2∶0.2，對制備的蝦青素進(jìn)行檢驗。利用手性柱對南極磷蝦蝦青素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了定性分析，發(fā)現(xiàn)南極磷蝦不同形態(tài)蝦青素中含有3S,3′S、3S,3′R、3R，3′R 3種異構(gòu)體，且3R，3′R異構(gòu)體含量遠(yuǎn)大于3S，3′S，3S，3′R 2種異構(gòu)體。通過C30-HPLC法測定南極磷蝦中不同形態(tài)蝦青素的含量，測得蝦青素雙酯中蝦青素含量為6.3 mg/kg，蝦青素單酯中蝦青素含量為3.2 mg/kg，游離蝦青素含量為0.4 mg/kg。本實驗系統(tǒng)研究了南極磷蝦中不同形態(tài)蝦青素的分離制備方法，并進(jìn)行了立體結(jié)構(gòu)組成分析和含量測定，可以促進(jìn)南極磷蝦資源的有效利用和功能食品升級。