水產(chǎn)品中微生物生物被膜形成機制與控制方法研究進展

藍蔚青,鞏濤碩,陳夢玲,王蒙,謝晶*

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)2(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海,201306)3(上海冷鏈裝備性能與節(jié)能評價專業(yè)技術(shù)服務平臺，上海，201306)；4(上海海洋大學，食品科學與工程國家級實驗教學示范中心，上海，201306)

微生物生物被膜(biofilm, BF)為微生物在特定條件下形成的一種特殊群體結(jié)構(gòu)，是無柄微生物群落附著在各種載體上，通過分泌多糖、纖維蛋白與脂質(zhì)蛋白等胞外基質(zhì)，將載體包繞其中而形成的大量高度組織化、系統(tǒng)化的膜樣聚合物[1]。微生物菌體被包裹在其自身分泌的胞外聚合基質(zhì)(extracellular polymeric substances，EPS)中，具有特定結(jié)構(gòu)，是微生物在生長過程中形成的一種非游離狀態(tài)的微生物細胞集合體[2]。多糖、蛋白質(zhì)、磷脂、磷壁酸與核酸等是EPS的主要組分[3]。相對于以浮游方式存在的微生物，更多微生物以生物被膜形式存在[4]。其還包括原生動物、真菌以及多種生物復合而形成的生物被膜[5]。與浮游方式存在的微生物相比，微生物為適應生存環(huán)境形成的生物被膜危害更大、抗性更強、抑制或消滅也更困難。本文介紹了微生物生物被膜的形成過程與水產(chǎn)品中微生物的生物被膜現(xiàn)象，并對其控制措施予以說明，提出相應的問題與解決方案，以期為后期相關(guān)研究提供理論參考。

生物被膜中含有腐敗菌與病原菌，其增加了水產(chǎn)品后處理的污染和對公眾健康的風險。目前，在水產(chǎn)品中能形成生物被膜的常見微生物主要有沙門氏菌、嗜水氣單胞菌、弧菌與單增李斯特菌等[6]。由于這些微生物被膜的存在，構(gòu)成了世界范圍內(nèi)的食品安全威脅。因此，控制水產(chǎn)品及其加工過程中的腐敗菌和病原菌污染，防止其生成生物被膜進而交叉污染水產(chǎn)品，對控制一些食源性疾病的發(fā)生具有重要意義。其中，細菌生物被膜的動態(tài)形成過程復雜，包括初始細菌的附著粘附、群落形成、生物被膜的成熟與細菌的分散污染[7]。細菌的附著和粘附是生物被膜形成的第一階段與關(guān)鍵步驟。在細胞能結(jié)合到表面前，其表面通過吸附來自周圍環(huán)境的分子而被調(diào)節(jié)。此外，吸附粘附取決于正在進行的食品加工的類型，可能在水產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)中發(fā)現(xiàn)的有機物質(zhì)(肌鈣蛋白、原肌球蛋白和肌球蛋白)，其組成將不同于乳制品工業(yè)中表面上沉積的有機物質(zhì)(α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白和α-乳清蛋白)，從而影響細胞保留與后續(xù)生物膜的結(jié)構(gòu)功能[8-10]。在生物被膜的成熟階段，微生物包裹其自身分泌的多聚糖基質(zhì)中，由扁平不均一結(jié)構(gòu)變?yōu)楦叨冉M織化結(jié)構(gòu)[11]。最后，微生物細胞分散污染其他表面，重復循環(huán)，形成新的生物被膜，這也是微生物生物被膜難以控制的主要原因。

1 水產(chǎn)品中存在的生物被膜現(xiàn)象

生鮮水產(chǎn)品含水量高、營養(yǎng)豐富，其在貯藏與加工過程中極易受到污染，滋生微生物，形成微生物生物被膜，導致其腐敗，這已成為水產(chǎn)品及加工品中存在的主要問題。

1.1 水產(chǎn)品原料

水產(chǎn)品原料自身帶有微生物源，當細菌在水產(chǎn)品中形成生物被膜時，其會長時間存活，并對多數(shù)抗菌產(chǎn)品表現(xiàn)出抗性[12]。細菌群體中含有對抗菌產(chǎn)品敏感性降低的亞群體，其可通過適應，產(chǎn)生遺傳抗性元件，形成生物被膜并獲得更高抗性，微生物生物被膜特殊的三維生物結(jié)構(gòu)是抗菌產(chǎn)品的天然屏障[13]。細菌生物被膜主要由微生物、微生物分泌的黏性物質(zhì)和胞外多糖組成，其中微生物占比少于1/3。蛋白質(zhì)、多糖、DNA、RNA與磷脂等生物大分子同細菌存在于生物被膜中，約占其總量的3%，另有97%的水分[14]。暴露于環(huán)境中的高濃度細菌與病毒可能形成生物被膜，并能長時間處于穩(wěn)定狀態(tài)。但當與環(huán)境和食物有關(guān)的因素給予這些生物被膜一定刺激時，其又回到浮游狀態(tài)[15]。如嗜水氣單胞菌已從螃蟹、鯽魚與鯧魚等水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)品中分離出，該菌會引發(fā)食用人群產(chǎn)生敗血癥等疾病[16]。PANISELLO等[17]也關(guān)注了貝類和其他海產(chǎn)魚類中污染的沙門氏菌形成生物被膜引起的食源性疾病。

1.2 水產(chǎn)品加工過程

在水產(chǎn)品加工過程中，主要污染源通常是由于水產(chǎn)品加工設備的清潔和消毒不當造成。水產(chǎn)環(huán)境中，沙門氏菌來源于帶菌者的糞便污染、水產(chǎn)品養(yǎng)殖環(huán)境及生產(chǎn)過程中的一系列環(huán)節(jié)[18]。其中，THOMPSON等[19]報道了由于金槍魚壽司卷的消費感染沙門氏菌，引起食物中毒的現(xiàn)象。食源性病原菌可在設備材料表面、地面、工廠天花板等表面形成微生物生物被膜。在產(chǎn)品表面也可能存在病原菌，進一步形成生物被膜。全球范圍內(nèi)，水產(chǎn)品傳播的疾病主要由霍亂弧菌、副溶血性弧菌或創(chuàng)傷弧菌等引起。弧菌屬中的副溶血性弧菌是主要食源性病原菌，其在亞洲國家尤為如此[20]。海產(chǎn)品在制造、處理和加工過程中會受到產(chǎn)毒或非產(chǎn)毒霍亂弧菌污染[21]。其中，單增李斯特菌在熏海鮮、蝦、軟體動物貝類等各種水產(chǎn)品中被檢出，其可形成生物被膜，造成更大危害[22]。

2 水產(chǎn)品中微生物生物被膜的控制措施

為確保水產(chǎn)品安全，水產(chǎn)品生態(tài)系統(tǒng)的每一步都需采取相應措施對生物被膜加以控制。主要方法有物理法、化學法、化學生物學法等。

2.1 物理法

(1)高壓處理：高壓處理可通過破壞微生物生物被膜的結(jié)構(gòu)，達到消毒和殺菌目的，一般可用于水產(chǎn)品加工處理。其中，莘似韻等[23]使用高于300 MPa的超高壓處理從水產(chǎn)品中分離的單增李斯特菌生物被膜，發(fā)現(xiàn)有2株4 b血清型細菌的生物被膜形成量都有顯著降低。高壓處理在某些情況能使牡蠣中總活菌、乳酸菌、大腸菌群等數(shù)量減少約5個對數(shù)單位，400 MPa、600 s是殺滅牡蠣中總菌數(shù)的最佳條件[24]。從現(xiàn)有分析得知，超高壓技術(shù)在水產(chǎn)品基礎研究與產(chǎn)品項目開發(fā)上仍處于起步階段，實際操作可配合酶處理與熱加工等手段，拓展超高壓技術(shù)在水產(chǎn)品加工中的使用領(lǐng)域[25]。

(2)超聲波處理：超聲波處理具有設備要求低、使用方便、處理迅速，且對原料及操作人員傷害極低等特點，在水產(chǎn)品加工業(yè)中應用前景廣闊，現(xiàn)已逐漸應用于各類食品加工中。目前，超聲波處理在消除細菌生物被膜方面應用廣泛。相關(guān)報道顯示，超聲波處理能簡單有效去除微生物生物被膜，使其風險最小化，且能提高產(chǎn)品的一致性與綜合質(zhì)量[26]。其中，黃靜等[27]使用超聲波處理120 s，能消除多數(shù)金黃色葡萄球菌形成的生物被膜，且易于控制，人為影響較小。盡管較低頻率的超聲波在降低生物被膜內(nèi)的細菌存活力方面較高頻率更有效，但使用現(xiàn)有的超聲波技術(shù)不能僅消除水產(chǎn)品及加工過程中的微生物，因此可將超聲波技術(shù)與其他處理技術(shù)相結(jié)合[28]。

2.2 化學法

(1)消毒劑：在水產(chǎn)品加工過程中消毒劑可減少細菌在非生物表面形成生物膜，其是清除細菌生物被膜的必要條件[29]。在水產(chǎn)品行業(yè)中，要有符合要求的清潔和消毒設施，使用消毒劑須安全有效、易于處理、無殘留。常用消毒劑有臭氧、過氧化氫、氯、苛性堿、過氧乙酸、碘與異噻唑啉酮等。其中，李長青等[30]研究得出，鄰苯二甲醛消毒劑對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌與枯草桿菌黑色變種芽孢殺滅效果較好。但與浮游細胞相比，生物被膜對消毒劑的抗性更強。

(2)天然抗菌劑：從芳香族植物中提取的一些抗菌化合物天然安全，現(xiàn)已證明對浮游細菌具有良好的抗微生物活性[31]。如植物精油的次生代謝物具有抗微生物作用，其主要作用于微生物細胞質(zhì)膜的脂質(zhì)雙層[32]。相關(guān)報道顯示，肉桂精油處理可使水產(chǎn)品生產(chǎn)加工中不銹鋼表面上的無固定細胞數(shù)量減少2.54個數(shù)量級，肉桂醛被證明能完全殺滅細菌或使其菌數(shù)明顯減少，現(xiàn)已成為商業(yè)化學消毒劑的有效替代品[33]。

2.3 化學生物學法

(1)噬菌體：噬菌體在大自然中無處不在，是感染和裂解細菌的病毒，可控制霍亂弧菌、鏈球菌和大腸埃希氏菌等人類病原體，現(xiàn)已提議作為生物膜的控制方法之一[34]。許多噬菌體都會產(chǎn)生解聚酶，通過EPS擴散，產(chǎn)生的解聚酶會水解生物被膜中的胞外聚合物，引發(fā)其破壞[35]。因此，需要進一步評估噬菌體在控制水產(chǎn)品傳播的病原體方面的用途，改善水產(chǎn)品的安全性。但噬菌體的宿主范圍很窄，因此噬菌體混合物或工程噬菌體可提供更好的解決方案。其中，SILLANKORVA等[36]研究了噬菌體Phi S1的特定裂解噬菌體作為熒光假單胞菌生物被膜控制劑的功效。發(fā)現(xiàn)其可感染浮游細胞和生物被膜，導致2種情況下生物量降低約85%。研究表明，單裂解性噬菌體可通過解聚酶介導作用，顯著根除舊生物膜。應用P100噬菌體對單增李斯特菌的特異性生物防治也非常有效，與對照組相比，噬菌體P100在第0天和第10天均能使單增李斯特菌數(shù)減少2.5個對數(shù)單位[37]。然而，目前仍需進一步研究使用噬菌體來徹底根除病原體。噬菌體與抗生素聯(lián)用能使生物膜根除程度有所增強，其證實了噬菌體可增強抗生素功效的推測[38]。

(2)益生菌：益生菌為“活性微生物的給藥量足以為宿主帶來健康益處”[39]。其菌株可作為傳統(tǒng)化學滅菌劑的替代方式，通過競爭、排斥和置換，有效減少水產(chǎn)品中沙門氏菌、單增李斯特菌等病原菌生物被膜的形成。PETROVA等[40]研究發(fā)現(xiàn)益生菌菌株鼠李糖乳桿菌GG株的凝集素對各種病原體的生物被膜形成具有明顯的抑制作用，其還能破壞一些致病性病原體的成熟生物被膜。預防性使用益生菌，可提高養(yǎng)殖水生動物的健康和畜牧性能，溶藻弧菌現(xiàn)已被用作許多厄瓜多爾蝦孵化場的益生菌，孵化時間從每月約7 d減少到每年約21 d，而生產(chǎn)量增加了35%[41]。

(3)酶：酶是對特定化學分子具有催化活性的蛋白質(zhì)，在食品加工過程中去除微生物生物被膜效果顯著。由于生物膜基質(zhì)中的異質(zhì)性，選擇恰當?shù)拿柑幚矸绞胶苡斜匾?，使用幾種不同酶的混合物能增加其對水產(chǎn)品中生物被膜的降解與消除[42]。相關(guān)學者在研究商業(yè)蛋白酶和淀粉酶對熒光假單胞菌形成的生物被膜的影響中發(fā)現(xiàn)，蛋白酶對熒光假單胞菌生物被膜EPS的降解效果較好，而淀粉酶的效果較差[43]。微生物生物被膜的去除和殺滅處理條件苛刻，其中以蛋白酶與多糖水解酶作用效果較好[44]。因此，根據(jù)安全無毒的特點，生物被膜的酶解控制技術(shù)可作為環(huán)保替代策略。

(4)群體感應抑制劑：生物被膜中的微生物可通過信號分子進行交流，并使用群體感應優(yōu)化其毒力因子，提高其生存能力[45]。群體感應被廣泛認為是調(diào)節(jié)微生物中共同行為特定基因表達的有效機制[46]。前人研究發(fā)現(xiàn)，20 μg/mL北海苔蘚蟲中的次生代謝產(chǎn)物溴化生物堿就可引起微生物生物被膜信號分子的強度降低，阻斷其生物被膜形成[47]。螺旋藻提取物等群體感應抑制劑對生物被膜的抑制也具有良好效果，對水產(chǎn)品中希瓦氏菌形成的生物被膜抑制率達77.05%[48]。群體感應可調(diào)節(jié)生物膜中微生物的基因表達，但使用群體感應抑制劑解決上述問題還有待深入研究。

3 前景與展望

與浮游微生物相比，微生物為適應生存環(huán)境形成的生物被膜危害更大，抑制或消滅也更困難。水產(chǎn)品中的微生物生物被膜構(gòu)成了世界范圍內(nèi)的健康威脅，幾乎都可引起食源性疾病，嚴重程度從輕度腸胃炎到危及生命的感染，預防生物被膜形成比治療生物被膜更加有效。因此，需要進一步研究用以解決水產(chǎn)品中生物被膜的抑制和消除問題，最大限度減少水產(chǎn)品污染，提高其安全性。然而，目前還未僅使用一種方法可完全消除生物被膜而無副作用，仍須通過柵欄因子將多種處理方式優(yōu)化組合，發(fā)揮其協(xié)同作用，獲得更有效的處理效果。因此，研究人員需更好完善微生物生物被膜的控制技術(shù)，確保消費者在水產(chǎn)品生產(chǎn)、加工、貯藏與食用等方面的安全。