間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于卵巢儲備功能減退治療的研究進(jìn)展

曹孟，蔣春艷，崔毓桂，覃蓮菊

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，南京 210029)

卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞的數(shù)量(即卵巢儲備)反映卵巢生殖功能狀態(tài)。卵巢儲備功能減退(Diminished ovarian reserve，DOR)是指女性卵巢內(nèi)剩余的卵母細(xì)胞數(shù)量較少或質(zhì)量較低而導(dǎo)致生殖能力衰減的一種病理癥狀，在女性不孕因素中約占10%。DOR患者仍維持正常的月經(jīng)周期，但卵巢對促排卵藥物反應(yīng)低，助孕結(jié)局相對差。目前DOR的發(fā)病機(jī)制尚不明確，病因復(fù)雜，主要有年齡因素、遺傳因素(如脆性x綜合征)、自身免疫性疾病(如腎上腺損傷)、醫(yī)源性因素(放療、化療或手術(shù))等。目前DOR臨床治療方法包括人工輔助生殖技術(shù)(ART)、激素替代療法(HRT)、卵巢移植、線粒體移植等。但是，因DOR患者卵巢反應(yīng)低，ART成功率并不高；HRT僅能改善患者部分臨床癥狀，并不能從根本上改善DOR患者的卵巢功能和生殖能力，且有增加患者血栓性疾病、卵巢腫瘤及乳腺癌的風(fēng)險；贈卵尚存在醫(yī)學(xué)倫理問題；而卵巢移植、線粒體移植尚需突破技術(shù)瓶頸。因此，臨床迫切需要探討有效的DOR治療新方案以提高DOR患者的生殖能力，提高其ART助孕的活產(chǎn)率。

干細(xì)胞具有多向分化潛能，在誘導(dǎo)條件下能分化為特定類型的各類組織細(xì)胞[1]，在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要應(yīng)用前景。其中，間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)來源充足、免疫原性低，同時可避免倫理問題，國內(nèi)外已應(yīng)用于多項組織修復(fù)/再生醫(yī)學(xué)的臨床研究[2]。近年研究顯示，不同來源的MSCs均可改善小鼠受損的或者自然衰老的卵巢功能及卵巢儲備[3-4]，提示MSCs治療有望成為提高DOR患者生殖能力的新型療法。本文綜述MSCs特性及其治療DOR的基礎(chǔ)與臨床研究進(jìn)展。

一、MSCs特征

1968年Friedenstein等首先發(fā)現(xiàn)并分離了成人骨髓MSCs(BMMSCs)，之后研究者陸續(xù)從許多成體組織中分離到相應(yīng)的MSCs[5]，表明MSCs易于分離、體外增殖，免疫原性低，且具有遺傳穩(wěn)定性[6]。2006年，國際細(xì)胞治療協(xié)會的間充質(zhì)干細(xì)胞和組織干細(xì)胞委員會明確了人類MSCs的基本識別特征[7]：(1)在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下，MSCs可在塑料培養(yǎng)板上貼壁生長；(2)體外高水平表達(dá)CD105、CD73和CD90，不表達(dá)或極低水平表達(dá)CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a、CD19及HLA-DR；(3)具有體外分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及軟骨細(xì)胞的能力。

MSCs具有免疫調(diào)節(jié)及抗炎、抗凋亡、促傷口愈合及組織修復(fù)等功能[8]。MSCs移植到體內(nèi)后，能遷移到受損組織(也稱歸巢)并分化成組織特異性細(xì)胞從而達(dá)到修復(fù)的目的[9]，或驅(qū)動由內(nèi)源性細(xì)胞觸發(fā)的修復(fù)[10-11]。早在2008年，Yoshikawa等[12]的一項臨床研究，利用含自體BMSCs的移植物治療了18例患者不同原因的不愈合創(chuàng)面，所有受試者的皮膚創(chuàng)面均獲得了完全的再上皮化。Xu等[13]報道一項小樣本的瘢痕子宮MSCs治療的臨床研究，將附著人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCMSCs)的可降解智能生物材料置入患者的瘢痕子宮，發(fā)現(xiàn)hUCMSCs促進(jìn)了瘢痕處內(nèi)膜、肌層及血管的再生；同時發(fā)現(xiàn)，經(jīng) hUCMSCs治療后子宮瘢痕得到功能性恢復(fù)，甚至可正常妊娠。目前，許多研究關(guān)注于MSCs在細(xì)胞療法中的應(yīng)用。MSCs被用作治療關(guān)節(jié)退行性變化和重建骨骼和軟骨的工具，用于整形手術(shù)、美容醫(yī)學(xué)、心血管疾病、內(nèi)分泌和神經(jīng)系統(tǒng)疾病，以及修復(fù)受損的肌肉骨骼組織[14]。最近，脂肪來源的干細(xì)胞產(chǎn)品已被歐洲藥品管理局注冊用于治療復(fù)雜的肛周瘺[15]。之前一個加拿大的研究小組分析了使用人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMMSCs)的臨床試驗，在對36項研究進(jìn)行徹底分析后，他們發(fā)現(xiàn)MSCs的使用與致瘤潛力之間沒有關(guān)系，印證了臨床應(yīng)用的安全性[16]。越來越多的臨床研究均表明MSCs在明顯改善治療結(jié)局的同時并沒有報道嚴(yán)重的毒副作用[17-19]。

二、 MSCs在DOR動物模型的應(yīng)用研究

近年較多實驗研究，探討MSCs修復(fù)卵巢儲備功能。Asif等[20]采用連續(xù)15 d(50 mg/kg/d)腹腔注射CTX的方法化療構(gòu)建卵巢功能早衰(Premature ovarian failure，POF)的小鼠模型，將1×106個hUCMSCs通過靜脈注射移植至POF小鼠體內(nèi)，一周后卵巢獲卵數(shù)(108±15)個，而對照組POF模型小鼠的獲卵數(shù)為(39±13)個(P<0.01)，hUCMSCs治療組血清E2水平也明顯高于對照組(P<0.05)；卵丘細(xì)胞凋亡減少，卵巢儲備功能明顯改善。Mohamed等[21]則用70 mg/kg/d CTX靜脈注射小鼠1周造模，將5×105個hBMMSCs局部注射至模型小鼠雙側(cè)卵巢中，分別在注射后的第2、4、6、8周從體重、激素水平、卵泡儲備水平進(jìn)行評估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2周時即觀察到hBMMSCs治療組總體重、卵巢重量的增加，并持續(xù)到實驗結(jié)束；治療組平均卵泡數(shù)明顯高于對照組，血清 FSH水平較低(P=0.03)，抗苗勒氏管激素(AMH)水平則較高(P=0.005)，提示hBMMSCs恢復(fù)化療藥物損傷卵巢的小鼠的激素水平、重新激活了小鼠的卵泡發(fā)育。其他一些研究表明，月經(jīng)血、羊膜、羊水、脂肪等多種來源的MSCs在移植入DOR模型小鼠體內(nèi)之后，均發(fā)現(xiàn)E2、AMH水平升高、FSH水平下降；同時卵泡數(shù)量增加、生育能力提高[22-23]。綜合起來，MSCs可明顯改善DOR模型動物的卵巢儲備能力、提高生殖能力。

三、MSCs治療DOR的臨床研究

國內(nèi)外報道多項MSCs治療DOR的臨床研究。截至2019年5月1日，在國際臨床試驗登記網(wǎng)站(https：∥clinicaltrials.gov)注冊的MSCs治療DOR臨床研究項目共有15個：細(xì)胞類型包括自體骨髓MSCs(8項)、異體骨髓MSCs(1項)、臍帶MSCs(3項)、自體脂肪組織(1項)、自體脂肪間質(zhì)細(xì)胞(1項)、人胚胎干細(xì)胞(hESCs)來源的MSCs樣細(xì)胞(1項)；給藥方式包括卵巢局部移植(11項)、靜脈移植(3項)、卵巢動脈移植(1項)；實施的國家包括中國(6項)、埃及(5項)、美國(1項)、約旦(1項)、西班牙(1項)、伊朗(1項)。

2018年的一項臨床研究，POF患者納入標(biāo)準(zhǔn)為18～39歲、閉經(jīng)持續(xù)時間>1年、1～2次FSH≥40 U/L，HRT方案Premarin(0.625 mg/d，25 d)聯(lián)合Provera(10 mg/d，每月10 d)治療2年后經(jīng)臨床觀察，均無成熟卵泡或未孕(排除染色體核型異常、男方因素，既往手術(shù)史或其他相關(guān)病理)，將符合條件的16名患者隨機(jī)分為兩組：一組(n=6，2例患者取消UC-MSC移植方案)接受UC-MSC移植加HRT(UC-MSC組)，另一組(n=8)接受UC-MSC聯(lián)合膠原移植加HRT(膠原/UC-MSC組)。UC-MSCs移植是將5×106個UC-MSCs在陰道超聲引導(dǎo)下單側(cè)卵巢局部注入。膠原/UC-MSCs組是將UC-MSCs生長于膠原蛋白支架上，然后同UC-MSCs組進(jìn)行移植。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與UC-MSC組比較，膠原/UC-MSCs更有效激活POF患者卵泡生長至排卵前階段，且有助于卵巢功能的長期恢復(fù)，包括卵巢血流量、E2水平和卵泡發(fā)育[24]。

MSCs治療DOR的安全性、有效性已得到臨床初步驗證，將會開展更多和較大樣本的臨床研究。

四、MSCs改善DOR卵巢儲備的可能機(jī)制

1.旁分泌機(jī)制：MSCs可以產(chǎn)生大量的可溶性細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子等[25]促進(jìn)組織損傷的修復(fù)，通常被認(rèn)為是MSCs參與組織損傷修復(fù)的主要機(jī)制。眾多生物活性物質(zhì)協(xié)同作用形成復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可調(diào)控靶細(xì)胞內(nèi)多條信號通路[26]。hBMMSCs移植后可迅速遷移到組織損傷部位，通過旁分泌作用激活組織內(nèi)源性的特異性干/祖細(xì)胞的增殖和分化，參與組織損傷的修復(fù)[27]。研究發(fā)現(xiàn)，MSCs產(chǎn)生眾多生物活性物質(zhì)，參與免疫調(diào)節(jié)、抗纖維化、抗細(xì)胞凋亡、抗氧化和促進(jìn)血管新生等進(jìn)程[28]。諸多研究表明，DOR模型小鼠在靜脈輸注hBMMSCs或局部組織內(nèi)輸注/埋植人經(jīng)血間充質(zhì)干細(xì)胞(hMBMSCs)后，表現(xiàn)出更快的動員和更好的歸巢，在血液及組織局部可檢測到高水平的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)等多種與細(xì)胞生長、炎癥及免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的細(xì)胞因子，修復(fù)組織損傷[29-30]。這些細(xì)胞因子調(diào)節(jié)受損組織的微環(huán)境，觸發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和侵入，生成新的血管進(jìn)而改善局部缺血。歸巢的hMBMSCs或人全血來源的MSCs分泌多種抑制凋亡的因子，抑制卵巢局部的炎癥和細(xì)胞凋亡，從而改善卵巢功能[20，22]。

2.抗氧化作用：研究發(fā)現(xiàn)，hBMMSCs治療可顯著提高四氯化碳誘導(dǎo)的肝損傷模型小鼠受損肝臟組織內(nèi)的SOD水平。在受損肝組織局部，hBMMSCs分泌STC-1，后者調(diào)節(jié)肝細(xì)胞線粒體呼吸鏈，促進(jìn)細(xì)胞存活，減少由活性氧介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[31]。在DOR發(fā)病機(jī)制中，年齡相關(guān)的氧化應(yīng)激是一個重要環(huán)節(jié)，在卵泡發(fā)育成熟過程中，細(xì)胞內(nèi)ROS和抗氧化劑保持動態(tài)平衡；當(dāng)這種動態(tài)平衡被破壞，發(fā)生氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致顆粒細(xì)胞、卵母細(xì)胞或早期胚胎的細(xì)胞凋亡[32]。已有研究表明，hUCMSCs及其分泌細(xì)胞因子可能通過抗氧化應(yīng)激機(jī)制降低DOR模型小鼠卵巢內(nèi)間質(zhì)細(xì)胞、顆粒細(xì)胞的凋亡，改善卵母細(xì)胞質(zhì)量及其胚胎發(fā)育潛能[33]。

3.分化為組織特異細(xì)胞：早在2003年，Ortiz等發(fā)現(xiàn)給博來霉素誘導(dǎo)肺損傷的小鼠注射mBMMSCs后，mBMMSCs可以歸巢至受損的肺部，分化成上皮樣表型的細(xì)胞，并減少肺組織炎癥[34]。另有研究將綠色熒光蛋白標(biāo)記的1×104個hEnSCs的局部注射至環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的POF模型小鼠雙側(cè)卵巢21 d后，采用活體成像和免疫熒光檢測技術(shù)發(fā)現(xiàn)，帶有綠色熒光蛋白標(biāo)記的hEnSCs遷移至卵巢間質(zhì)中，并且形成了有功能的類間質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)了卵巢內(nèi)在生殖干細(xì)胞的更新，明顯改善模型小鼠的卵巢功能[21]。將2×106個人羊膜上皮細(xì)胞(hAECs)麻醉狀態(tài)下種植至化療藥物誘導(dǎo)的POF模型小鼠雙側(cè)卵巢，在7 d至2個月檢查發(fā)現(xiàn)，卵巢細(xì)胞形態(tài)學(xué)恢復(fù)；活體示蹤顯示，移植的hAECs存活并遷移到卵巢組織，一些hAECs分化為顆粒細(xì)胞[23]。這些研究表明，DOR和POF模型小鼠在MSCs治療后，MSCs可遷移到受損的卵巢組織，繼而在卵巢的微環(huán)境中分化形成某種(些)具有功能的實體細(xì)胞，部分替代或補(bǔ)償了受損細(xì)胞，維護(hù)卵泡發(fā)育成熟微環(huán)境的完整性，改善卵巢功能，促進(jìn)卵巢儲備卵泡的發(fā)育。

五、總結(jié)與展望

定向誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化為卵母細(xì)胞，也可能成為臨床治療DOR的有效方案[35]，但該技術(shù)剛起步，尚需克服眾多的理論及技術(shù)障礙。鑒于MSCs來源廣泛、免疫原性低、可體外增殖，成為目前臨床細(xì)胞治療研究較多的細(xì)胞，也是有希望應(yīng)用于臨床的細(xì)胞。MSCs對卵巢功能修復(fù)的效果已經(jīng)凸顯，初步臨床研究的成功給DOR患者的生育帶來希望。目前迫切需要開展規(guī)范的臨床試驗和多中心合作，以明確MSCs治療DOR的適應(yīng)癥、禁忌癥、給藥方式、劑量、治療周期，以及合適的細(xì)胞類型，客觀、真實、完整地評估其有效性和安全性，還要追蹤長期安全性和子代安全性。我國已經(jīng)對干細(xì)胞臨床研究發(fā)布了政策文件，有望通過強(qiáng)化管理，規(guī)范干細(xì)胞治療的臨床研究。