ICSI完全受精失敗的機(jī)制、原因及處理

黃學(xué)鋒，李燕

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，溫州 325000)

常規(guī)體外受精(IVF)的受精率通常在70%～85%，有5%～15%的周期出現(xiàn)完全受精失敗(total fertilization failure，TFF)。其主要原因是精子缺乏正常受精能力，但采用卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)通?？色@得受精。雖然ICSI已可以獲得與IVF相似的正常受精率，但I(xiàn)CSI后也會(huì)發(fā)生TFF(ICSI-TTF)。ICSI-TFF是指所有成熟卵子行ICSI后未能形成雄性和雌性原核，其文獻(xiàn)報(bào)道的發(fā)生率為1%～4%[1]。本文就ICSI-TTF的發(fā)生機(jī)制、原因以及臨床處理策略綜述如下。

一、ICSI后卵子受精失敗的機(jī)制

1.受精機(jī)制：哺乳動(dòng)物卵子受精過(guò)程包含精子獲能、透明帶結(jié)合、精子卵子膜融合和卵子激活等一系列生理過(guò)程，最終導(dǎo)致卵子減數(shù)分裂恢復(fù)和原核產(chǎn)生。在ICSI時(shí)，卵子激活是受精的必要過(guò)程。目前認(rèn)為，精子進(jìn)入卵子后釋放精子特異性卵子激活因子(sperm-borne oocyte activation factor，SOAF)是卵子激活的主要機(jī)制。SOAF可引起膜電位改變，引起鈣離子釋放和震蕩，從而導(dǎo)致減數(shù)分裂恢復(fù)和原核產(chǎn)生[2]。

2.ICSI后卵子受精失敗的機(jī)制：ICSI后卵子受精失敗的原因可能是精子未注入卵子，但主要原因是卵子激活失敗。Flaherty等[3]對(duì)1 005個(gè)ICSI未受精卵進(jìn)行Hoechst 33342核染色，通過(guò)分析精子頭核的形態(tài)、位置以及原核和極體數(shù)目，發(fā)現(xiàn)只有18%的卵子形成原核顯示已被激活，82%的卵子無(wú)雌性原核形成表明未被被激活，其中，17%卵子未注入精子，83%的卵子顯示精子雖然已注入到卵子但未見(jiàn)原核形成。

ICSI后卵子激活失敗(oocyte activation failure，OAF)的原因可能是精子SOAF異常，也可能是卵子激活信號(hào)通路異常[2]。目前認(rèn)為磷脂酶Cζ(phospholipases C zeta，PLCζ)是主要SOAF，是鈣離子振蕩誘導(dǎo)蛋白的最主要候選者[4]。Hachem等[5]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)建立PLCζ基因缺失小鼠模型，發(fā)現(xiàn)PLCζ缺失小鼠精子生成和精子質(zhì)量參數(shù)正常，但是卵母細(xì)胞不能產(chǎn)生Ca2+振蕩，表明PLCζ在觸發(fā)Ca2+震蕩過(guò)程中的重要作用。頂體后鞘WW-結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白(post-acrosomal WW-domain binding protein，WBP2NL/PAWP)也可能是鈣離子振蕩誘導(dǎo)蛋白之一，但尚存爭(zhēng)議[6]。

在SOAF觸發(fā)激活過(guò)程中，卵子需具備鈣離子釋放、震蕩、減數(shù)分裂恢復(fù)和原核形成等過(guò)程的相關(guān)正常信號(hào)通路。PIP2、IP3R、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)和Ca2+相關(guān)蛋白等物質(zhì)參與這些信號(hào)通路[2]。這些物質(zhì)及相關(guān)信號(hào)通路異?？赡苁荗AF的卵源性因素[2]。

二、ICSI后完全受精失敗的原因和分析

在ICSI臨床中，不同精子和成熟卵子的質(zhì)量可能不同，并不都具有正常激活機(jī)制。ICSI技術(shù)因素可導(dǎo)致精子未注入卵子和卵子激活失敗。在出現(xiàn)完全受精失敗時(shí)，需要分析其原因可能是隨機(jī)的配子因素和操作技術(shù)因素，還是大部分甚至所有配子激活機(jī)制異常導(dǎo)致的OAF。

1.技術(shù)操作及隨機(jī)因素：技術(shù)因素主要由于精子未注入卵子或注入精子未激活卵子，包括精子制動(dòng)時(shí)膜損傷不充分、回吸卵胞漿不足、注射時(shí)沒(méi)有很好地避開(kāi)紡錘體位置，注射針質(zhì)量等也有可能影響ICSI受精率。在人員培訓(xùn)嚴(yán)格和質(zhì)控工作到位的生殖中心，可以較容易發(fā)現(xiàn)這一技術(shù)因素。

獲卵數(shù)較少的周期發(fā)生ICSI-TTF在除外明顯精子和卵子因素后，要考慮隨機(jī)因素的可能。其理論概率可以通過(guò)實(shí)際ICSI受精率計(jì)算。以目前大部分胚胎實(shí)驗(yàn)室70%～85%的ICSI受精率計(jì)算，理論上1、2和3個(gè)成熟卵子不受精的隨機(jī)概率約為15%～30%、2.25%～9%和0.3%～2.7%。這是大部分ICSI-TTF發(fā)生在獲卵數(shù)少的周期的主要原因。分析我中心2014～2017年共5 926個(gè)ICSI周期數(shù)據(jù)，共150個(gè)周期出現(xiàn)TFF，發(fā)生率為2.52%，其中1、2、3和≥4個(gè)卵周期的TTF發(fā)生率分別是26.8%、11.9%、1.9%和0.32%，而<4個(gè)和≥4個(gè)卵周期發(fā)生TFF的占比分別是78.5%和21.5%。

2.精源性因素：在采用不活動(dòng)精子、嚴(yán)重畸形精子、圓頭精子和非梗阻性無(wú)精子癥睪丸精子行ICSI時(shí)可出現(xiàn)不同程度的ICSI受精率低下和TTF，這些精子的SOAF候選蛋白PLCζ可出現(xiàn)表達(dá)和定位異常[7]。正常精液參數(shù)的精子也可出現(xiàn)SOAF異常，在原因不明ICSI-TTF中，精子PLCζ陽(yáng)性精子比例、總量和分布與ICSI受精率顯著相關(guān)，PLCζ的缺失、表達(dá)部位異常以及活性降低都可導(dǎo)致卵子激活失敗，導(dǎo)致ICSI受精率低下甚至是TFF的發(fā)生[8-9]。也有發(fā)現(xiàn)精子PAWP的表達(dá)水平與ICSI受精率以及胚胎發(fā)育情況相關(guān)[10]。

3.卵源性因素：異常卵子形態(tài)增加了發(fā)生TTF的風(fēng)險(xiǎn)。有報(bào)道一例形態(tài)異常的卵子，采用自身精液、供精和卵母細(xì)胞輔助激活(assisted oocyte activation，AOA)均不能受精[11]。

目前研究未發(fā)現(xiàn)有明確臨床意義的卵源性激活特異相關(guān)分子。精子釋放 PLCζ進(jìn)入卵母細(xì)胞質(zhì)后，啟動(dòng)了激活連鎖反應(yīng)，包括PIP2、IP3R、PKC和Ca2+相關(guān)蛋白等眾多物質(zhì)參與這些不同信號(hào)通路[2]，這提示卵子因素激活失敗可能存在復(fù)雜的分子和通路機(jī)制。有文獻(xiàn)報(bào)道一例反復(fù)TFF，其配偶的人精子鼠卵激活實(shí)驗(yàn)(mouse oocyte activation test，MOAT)顯示為正常，但卵子的30 000個(gè)基因mRNA芯片結(jié)果表明，控制細(xì)胞周期的基因表達(dá)譜發(fā)生異常[12]。

4.精源性和卵源性因素OAF的鑒別：在精子和卵子形態(tài)正常，而成熟卵子數(shù)較多(≥4～5)時(shí)，ICSI-TTF是由于技術(shù)和隨機(jī)因素導(dǎo)致的可能性較小，需要考慮原因不明OAF。PLCζ的檢測(cè)可能有助于鑒別精子因素，但尚不能用于臨床常規(guī)檢測(cè)。采用激活失敗夫婦的精子和卵子與供卵和供精行交叉試驗(yàn)有助于鑒別精子或卵子因素受精失敗。患者精子與捐贈(zèng)的廢棄不成熟卵子體外培養(yǎng)成熟卵子行ICSI，完全無(wú)受精，考慮精源性因素；受精率≥30%～50%，考慮卵源性因素；其他結(jié)果難以明確鑒別。也可采用患者卵子與供精I(xiàn)CSI試驗(yàn)以幫助鑒別。采用人卵子和精子交叉試驗(yàn)存在卵子來(lái)源、倫理以及體外成熟卵子本身可能存在激活異常等問(wèn)題，而且當(dāng)試驗(yàn)卵子數(shù)量較少時(shí)增加了試驗(yàn)的假陰性率，降低了試驗(yàn)的可靠性。

MOAT也被用于鑒別OAF的原因。通常采用B6D2F1雜交小鼠卵子與被測(cè)精子行ICSI。MOAT激活率與正常對(duì)照相比，無(wú)顯著性差異為卵源性因素，MOAT 激活率低或無(wú)激活提示精源性因素[13]。MOAT需要設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照和空白對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠需要三組的2-細(xì)胞率分別>90%、<10%和<10%。也有文獻(xiàn)認(rèn)為測(cè)試精子的MOAT 激活率≤20%，提示為精源性因素；MOAT 激活率在21%～84%之間，提示為精子或其他原因；MOAT 激活率≥85%，則提示為卵源性因素[14]。該方法的缺點(diǎn)是小鼠精子PLCζ作用不及人精子，可導(dǎo)致假陰性。

最近有報(bào)道采用小鼠卵鈣分析(mouse oocyte Ca2+analysis)和人卵鈣分析(human oocyte Ca2+analysis)作為鑒別精源性或卵源性因素OAF的方法[15]。

三、ICSI-TFF的臨床處理

對(duì)嚴(yán)重精子和卵子形態(tài)異常及成熟卵子數(shù)較少的ICSI周期，ICSI治療前要考慮其出現(xiàn)ICSI-TTF的風(fēng)險(xiǎn)。隨機(jī)和技術(shù)因素的ICSI-TTF再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)小。原因不明OAF導(dǎo)致的ICSI-TFF較難預(yù)測(cè)，而且可反復(fù)發(fā)生[16]，需鑒別精子或卵子因素。精卵交叉試驗(yàn)、MOAT和精子PLCζ的免疫熒光檢測(cè)等有助于鑒別，可作為臨床處理的主要依據(jù)。以下綜述了ICSI-TTF的臨床處理方法。

1.改善臨床促排方案，增加卵子數(shù)目，改善卵子質(zhì)量：卵母細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的不成熟狀態(tài)可能抑制卵子對(duì)精子PLCζ激活的反應(yīng)[17]。在臨床實(shí)踐中應(yīng)優(yōu)化促排卵方法盡可能改善卵子質(zhì)量，增加卵子數(shù)量。文獻(xiàn)報(bào)道這可以改善成熟卵子少導(dǎo)致的ICSI-TFF的受精率，雖然移植周期的活產(chǎn)率可能仍然不高[18]。

2.改善精子質(zhì)量，選擇形態(tài)正常的活精子：嚴(yán)重精子異常導(dǎo)致的ICSI-TFF可在治療前改善精子質(zhì)量，ICSI時(shí)選擇形態(tài)正常的活精子，但臨床少有報(bào)道?？梢越柚游膊康蜐B膨脹試驗(yàn)(HOST)、Laman光譜顯微鏡等選擇活精子，也可采用形態(tài)學(xué)選擇性卵胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic morphologically selected sperm injection，IMSI)。

3.卵母細(xì)胞輔助激活(AOA)：AOA技術(shù)可以有效克服因OAF引起的TFF或受精率低下，并能獲得正常發(fā)育的胚胎，是目前臨床上針對(duì)反復(fù)ICSI-TFF的有效治療。AOA還應(yīng)用于圓頭精子癥[19]，也有應(yīng)用于高ICSI-TFF風(fēng)險(xiǎn)的不活動(dòng)精子和嚴(yán)重形態(tài)異常精子[20]。

AOA的基本原理是通過(guò)增加卵母細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，模擬自然受精時(shí)卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的生理變化。AOA的方法主要有3種：機(jī)械激活、電激活和化學(xué)激活。機(jī)械激活屬于ICSI技術(shù)改良的一部分。行ICSI時(shí)，在注射針對(duì)側(cè)區(qū)域多次抽吸以增加機(jī)械刺激，可提升TFF病人的受精率和臨床妊娠率。Ebner等[21]對(duì)ICSI-TFF采用機(jī)械激活獲得53.6%的受精率和33.3%的妊娠率。Tesarik等[22]也認(rèn)為反復(fù)抽吸卵母細(xì)胞胞質(zhì)可以增加溶液中Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)破壞卵胞質(zhì)中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系統(tǒng)，從而增加內(nèi)源Ca2+的釋放，達(dá)到改善患者受精結(jié)局的目的。但應(yīng)注意避免因反復(fù)抽吸胞漿而造成卵母細(xì)胞死亡。

電激活法則通過(guò)對(duì)卵母細(xì)胞施加直流電，引起卵母細(xì)胞膜蛋白的重排而形成膜孔道，細(xì)胞外的Ca2+可以通過(guò)孔道內(nèi)流進(jìn)入胞漿，從而誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高。Manipalviratn等[23]利用電激活技術(shù)，ICSI后胚胎形成率從16%提高到80%。但基于電激活操作的安全性和復(fù)雜性考慮，目前采用電激活進(jìn)行AOA的臨床報(bào)道較為少見(jiàn)。

化學(xué)激活法由于非侵入性和操作便利性在臨床上應(yīng)用最為廣泛。目前有Ca2+載體、氯化鍶(Strontium chloride，SrCl2)、無(wú)水乙醇和6-二甲基苯胺嘌呤(6-dimethylaminopurine，6-DMAP)、嘌呤霉素(puromycin)等化學(xué)激活劑。Ca2+載體、嘌呤霉素和6-DMAP能夠增加膜穿透性，通過(guò) Ca2+的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)觸發(fā)Ca2+內(nèi)流，迅速產(chǎn)生單個(gè)Ca2+峰，促進(jìn)卵母細(xì)胞激活。氯化鍶、無(wú)水乙醇可以將細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+釋放到胞質(zhì)內(nèi)形成鈣震蕩[2，24-25]。其中A23187和離子霉素(ionomycin)是最常用的Ca2+載體激活劑。一項(xiàng)涵蓋14項(xiàng)研究的Meta分析[26]顯示，鈣離子載體可以顯著提高受精率、卵裂率、囊胚形成率、臨床妊娠率以及活產(chǎn)率。A23187還具有改善胚胎發(fā)育潛能的作用，一項(xiàng)前瞻性多中心研究[27]顯示，在具有胚胎發(fā)育阻滯、發(fā)育延遲或者之前囊胚形成率很低的患者中，應(yīng)用A23187可以顯著提高2-細(xì)胞卵裂率(98.5% vs.91.9%)、囊胚形成率(47.6% vs.5.5%)、種植率(44.4% vs.12.5%)、臨床妊娠率(45.14% vs.12.8%)和活產(chǎn)率(45.14% vs.12.8%)。Nikiforaki等[28]在B6D2F1小鼠卵和人卵中比較了離子霉素和A23187的激活效率，結(jié)果顯示離子霉素誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+振幅更高、區(qū)域更廣。在鼠卵中，離子霉素的激活效率顯著超過(guò)A23187，而在人卵中，離子霉素的激活率也高于A23187，雖然差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另一項(xiàng)RCT研究[29]表明，雖然SrCl2和A23187都能改善臨床結(jié)局，但這兩種激活劑對(duì)不同的病人作用不同。SrCl2的作用在低受精史的病人中優(yōu)于A23187，但A23187在男性因素的病人中的作用優(yōu)于SrCl2。因此，對(duì)不同ICSI-TFF選擇不同的化學(xué)激活劑可能有助于治療結(jié)局。

AOA技術(shù)可適用于精子和卵子因素ICSI-TFF，但應(yīng)用于精子因素TFF的臨床結(jié)果較好。最新的一項(xiàng)研究[30]對(duì)應(yīng)用AOA技術(shù)的191周期分為精子因素組(MOAT激活率≤20%)、精子相關(guān)的卵激活能力下降組(MOAT激活率為21%～84%)和疑似卵子因素組(MOAT激活率≥85%)，三組的受精率分別為70.1%、63.0%和57.3%，其中精子因素組臨床妊娠率(49.0% vs.29.4%)和活產(chǎn)率(41.2% vs.22.1%)均顯著高于疑似卵子因素組。最近的一些研究隨訪了AOA出生子代。Miller等[31]比較了83例AOA出生的子代與595例ICSI子代，兩組的子代出生缺陷率和缺陷類型、子代出生體重、孕周、胎兒性別均無(wú)顯著差異。Deemeh等[32]比較了79名AOA出生子代和89名常規(guī)ICSI子代，顯示兩組的出生缺陷、子代出生體重和發(fā)育量表評(píng)分均無(wú)顯著差異。但由于AOA可能無(wú)法完全模擬自然受精生理過(guò)程中的Ca2+周期性震蕩和頻率，其是否會(huì)改變Ca2+調(diào)控通路下游中特殊蛋白和酶的活性，是否會(huì)影響人類胚胎早期基因表達(dá)以及表觀遺傳學(xué)等，仍有待更多研究。

4.注射重組人PLCζ(recombinant human PLCζ，rhPLCζ)：向卵母細(xì)胞內(nèi)注射rhPLCζ可以顯著改善由于激活失敗導(dǎo)致的ICSI-TFF。Nomikos等[33]將rhPLCζ蛋白注射到人卵和鼠卵中，都可以誘發(fā)自然受精激活樣的鈣振蕩圖譜，可有效激活卵子，激活鼠卵的囊胚形成率高達(dá)60%。而且，在由于PLCζ突變導(dǎo)致激活失敗的人卵母細(xì)胞中，注入rhPLCζ還能起到“挽救”作用。Sanusi等[34]利用熱處理后精子建立卵子激活失敗的小鼠模型，比較了鈣離子載體、Sr2+和rhPLCζ的激活作用，發(fā)現(xiàn)Sr2+和rhPLCζ能夠獲得更高的囊胚形成率，提示注射rhPLCζ可能為一種挽救ICSI-TFF發(fā)生和治療ICSI-TFF的方法。但目前未見(jiàn)臨床應(yīng)用報(bào)道。

5.供精或供卵治療：AOA失敗可以依據(jù)鑒別原因予以供精或供卵治療。

四、結(jié)語(yǔ)

ICSI-TFF臨床上少見(jiàn)但處理困難。獲卵數(shù)少、卵子形態(tài)和精子嚴(yán)重異常者具有較高的ICSI-TFF風(fēng)險(xiǎn)。發(fā)生ICSI-TTF后，應(yīng)結(jié)合臨床和實(shí)驗(yàn)室結(jié)果綜合分析原因。對(duì)技術(shù)和隨機(jī)因素導(dǎo)致的ICSI-TTF，可以通過(guò)改變臨床促排方案提高卵子質(zhì)量和增加獲卵數(shù)，選擇形態(tài)正常精子，ICSI操作時(shí)適當(dāng)加強(qiáng)機(jī)械刺激等方法，以提高ICSI受精率，降低TFF的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于原因不明OAF導(dǎo)致的ICSI-TTF，鑒別是精子因素或卵子因素有助于進(jìn)一步的治療選擇和預(yù)后估計(jì)。對(duì)精子和卵子因素激活失敗導(dǎo)致的ICSI-TTF，再次ICSI時(shí)結(jié)合AOA可以顯著提高受精率、卵裂率和治療結(jié)局。AOA對(duì)精子因素的ICSI-TTF的治療結(jié)果更好。但AOA臨床應(yīng)用應(yīng)有嚴(yán)格的指征，應(yīng)在患者充分知情同意的基礎(chǔ)上慎重使用。AOA的子代安全性仍需要長(zhǎng)期隨訪的研究。