食品中植物源成分分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)及應(yīng)用研究進(jìn)展

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(1.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510006;2.廣州海關(guān)技術(shù)中心,動(dòng)植物與食品進(jìn)出口技術(shù)措施研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510623)

我國第一本醫(yī)學(xué)專著《黃帝內(nèi)經(jīng)》明確提出“五谷為養(yǎng)”、“五果為助”、“五菜為充”,以植物為主要組成的膳食理念早在戰(zhàn)國時(shí)期就已植根于華夏民族的飲食思想當(dāng)中[1]?，F(xiàn)代食品工業(yè)的發(fā)展和人民生活改善的需要,催生出五花八門以植物原料為主要成分的加工食品。植物源性加工食品龐大的消費(fèi)市場,吸引了各種各樣“經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動(dòng)摻假”(Economically Motivated Adulteration,EMA)[2]的不法逐利行為:不含植物源性成分的植物蛋白飲料[3]、以蕓豆為原料制成的“蓮蓉”月餅[4]、以綠豆為原料制成的板栗酥餅[5]、貴價(jià)養(yǎng)生五谷粉和代餐粉中摻入廉價(jià)淀粉[6-8]、扁桃仁偽充杏仁制作糕點(diǎn)[9-10]。層出不窮的EMA行為引發(fā)社會(huì)廣泛關(guān)注,也對(duì)食品安全監(jiān)管提出了新的挑戰(zhàn),為此國內(nèi)外研究出了大量的針對(duì)食品中植物源成分鑒別的檢測(cè)技術(shù)。

除少量的輕加工植物源性食品可采用肉眼或顯微學(xué)判別外,市場上存在的植物源性加工食品大部分難以采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法進(jìn)行鑒別檢測(cè)。利用植物源性加工食品中或多或少殘余植物細(xì)胞成分,采用分子生物學(xué)方法對(duì)特定植物種類保守基因或蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)是國內(nèi)外植物源性成分鑒別及加工食品鑒偽的重要技術(shù)手段。常規(guī)PCR(Polymerase Chain Reaction)和實(shí)時(shí)熒光PCR是行業(yè)應(yīng)用主流,新型的數(shù)字PCR技術(shù)為定量檢測(cè)提供了新的方案,恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)有效補(bǔ)充了現(xiàn)場快篩和基層實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力,DNA條形碼因?qū)崿F(xiàn)高效篩檢樣品中多物種成分而成為新興發(fā)展方向。

本文從基因水平和蛋白質(zhì)水平兩個(gè)方面對(duì)食品中植物源性成分的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)及應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,并對(duì)將來的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行展望,以期為食品中植物源性成分鑒假監(jiān)管提供技術(shù)參考。

1 基于基因水平的檢測(cè)

1.1 核酸的提取和純化

食品中植物源性成分基因檢測(cè)技術(shù)創(chuàng)新發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ),是獲得適合于下游檢測(cè)的優(yōu)質(zhì)足量核酸。如何獲得高純度的植物DNA,是技術(shù)研發(fā)和應(yīng)用中需要突破的瓶頸[11]。植物物種的復(fù)雜性以及大量次生物質(zhì)的存在,對(duì)植物DNA提取造成困難[12-15]。作為食品原料的植物組織中往往富含碳水化合物和次生物質(zhì)如多糖、酚類、色素以及果膠等,會(huì)造成比較大的背景干擾。此外DNA提取過程中一些提取試劑的殘留也會(huì)影響后續(xù)的分子操作[16]。此外,從粗加工到深加工,食品中的DNA破損程度不斷加深,核酸的提取和純化也需充分考慮對(duì)小片段DNA的回收效率。

1.2 基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的特定基因檢測(cè)

1.2.1 常規(guī)PCR(Conventional PCR) 常規(guī)PCR是在熱穩(wěn)定DNA聚合酶的作用下,以脫氧核糖核苷三磷酸(Deoxy-ribonucleotide triphosphate,dNTP)為原料,在嚴(yán)格的變溫程序中通過特異性引物對(duì)目的片段進(jìn)行體外擴(kuò)增,經(jīng)過DNA雙鏈變性、引物退火、聚合酶延伸等環(huán)節(jié),由單個(gè)核酸分子擴(kuò)增生成數(shù)十億個(gè)拷貝,實(shí)現(xiàn)基因檢測(cè)信號(hào)的放大,通過瓊脂糖凝膠電泳可以對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判斷[17]。常規(guī)PCR以作為生物遺傳信息載體的DNA為模板,其對(duì)物種鑒定的權(quán)威性和科學(xué)性不容置疑,也是基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的特定基因檢測(cè)技術(shù)中發(fā)展最早、應(yīng)用最廣的檢測(cè)技術(shù),已經(jīng)成為食品檢驗(yàn)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)方法。

Kim等[18]設(shè)計(jì)了基于ITS2序列的物種序列特征擴(kuò)增區(qū)(Sequence characterized amplified region,SCAR)標(biāo)記,采用常規(guī)PCR對(duì)目的序列進(jìn)行擴(kuò)增,建立將貴價(jià)青花椒和其他3種花椒屬摻偽品種進(jìn)行區(qū)分鑒別的有效方法,其中,青花椒ITS2序列堿基數(shù)為385,其他3種花椒屬物種的ITS2堿基數(shù)分別為383、388、385,序列比對(duì)結(jié)果證明ITS2序列的物種特異性優(yōu)于matK和rbcL。Zhang等[19]設(shè)計(jì)了油棕屬物種特異基因MT3-B的引物,對(duì)食用油中的廉價(jià)棕櫚油摻假成分進(jìn)行鑒定,采用常規(guī)PCR方法可實(shí)現(xiàn)拷貝數(shù)檢測(cè)低限低至5個(gè)單倍體拷貝,具有較高的靈敏性。Mooney等[20]采用常規(guī)PCR對(duì)加工橙汁中柑桔源性成分的含量進(jìn)行測(cè)定,針對(duì)葉綠體trnT-trnL基因的檢測(cè)能有效的區(qū)分單獨(dú)的橙汁、柑桔汁和兩者的混合物,檢測(cè)結(jié)果顯示該方法重復(fù)性較好,變異系數(shù)為7.5%,對(duì)加工果汁的盲樣測(cè)試中正確識(shí)別了20/22個(gè)樣品,沒有假陽性結(jié)果。常規(guī)PCR方法的應(yīng)用開創(chuàng)了物種鑒別的PCR時(shí)代。采用該技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)需要通過瓊脂糖凝膠電泳和熒光染色對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析,操作繁復(fù)、耗時(shí)較長、未能實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定量,且熒光染料試劑對(duì)操作員的身體健康有一定的危害,因此,開發(fā)檢測(cè)手段更加方便快捷、檢測(cè)試劑低毒害的PCR衍生技術(shù)是PCR技術(shù)研究發(fā)展的指向標(biāo)。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time Fluorescence PCR,qPCR) qPCR技術(shù)在常規(guī)PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料(如SYBR GreenⅠ)或熒光探針(如Taq Man),利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR反應(yīng)進(jìn)程,實(shí)現(xiàn)對(duì)目的DNA片段的分析。在植物源性成分檢測(cè)方面主要是采用Taq Man熒光探針。利用梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線后,qPCR還可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析[21-22]。qPCR與常規(guī)PCR相比,由于增加了特異性結(jié)合目的基因片段的熒光探針,擴(kuò)增片段相對(duì)更短小,且采用靈敏的光電檢測(cè)元件檢測(cè)熒光信號(hào),在一個(gè)離心管中同時(shí)實(shí)現(xiàn)目的基因片段擴(kuò)增和產(chǎn)物分析,因此具有特異性高、靈敏度好、交叉污染風(fēng)險(xiǎn)低、檢測(cè)耗時(shí)少等特點(diǎn)。特別是qCPR檢測(cè)靈敏度可達(dá)到0.01%,對(duì)于背景物質(zhì)干擾多、細(xì)胞殘余少、核酸破壞程度高的植物源性加工食品具有更好的檢測(cè)效果,是目前食品安全監(jiān)管檢驗(yàn)和食品行業(yè)生產(chǎn)質(zhì)量控制中主流的檢測(cè)技術(shù)。

Brzezinskib等[23]根據(jù)芝麻2S白蛋白基因設(shè)計(jì)特異性引物探針,利用qPCR法能夠特異性的檢測(cè)芝麻樣品,對(duì)扁桃仁、腰果、榛子、胡桃、巴西胡桃、花生、南瓜籽、葵花籽、罌粟籽等無交叉反應(yīng),靈敏度可達(dá)5 pg DNA。Elisa等[24]根據(jù)醇溶蛋白基因設(shè)計(jì)了雙重qPCR用于鑒別硬質(zhì)小麥和普通小麥,首次實(shí)現(xiàn)面粉中摻雜/摻偽的分子生物學(xué)分析,檢測(cè)靈敏度達(dá)0.15%,符合相關(guān)法律3%的檢測(cè)靈敏度要求,可用于檢測(cè)部門對(duì)意大利面進(jìn)行成分鑒偽。孫良廣等[4]以蕓豆pvsbe2基因高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物探針,建立蓮蓉制品中蕓豆成分qPCR檢測(cè)的方法,DNA質(zhì)量濃度的檢測(cè)靈敏度達(dá)到1 pg/μL,質(zhì)量百分比檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.01%。Ferreira等[25]設(shè)計(jì)了咖啡及其摻偽物種大麥、玉米、水稻等谷物的特異性引物,通過連續(xù)稀釋咖啡、大麥、玉米、水稻的DNA溶液,分別建立4個(gè)物種的標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性相關(guān)系數(shù)R2均達(dá)到0.99,結(jié)果顯示這些物種DNA的定量檢測(cè)限分別達(dá)到0.4、0.6、14、16 pg,由此開發(fā)了一種較好的基于qPCR檢測(cè)烘焙咖啡、可溶咖啡中谷物成分摻假的方法。Soares等[26]基于大豆凝集素基因Lectin gene建立肉制品中大豆添加量測(cè)定的qPCR方法,利用正態(tài)校正曲線對(duì)豬肉中的大豆蛋白進(jìn)行添加量測(cè)定,線性相關(guān)系數(shù)R2達(dá)到0.998,可檢測(cè)添加量在0.01%～6%范圍內(nèi)的干大豆蛋白,該方法為食品檢測(cè)相關(guān)部門規(guī)范和管理加工肉制品中大豆成分的過量添加現(xiàn)象提供了借鑒。qPCR是目前成分鑒定方法中最主要的技術(shù)之一,已廣泛用于植物源性食品的定性和定量檢測(cè),尤其在食品中植物源性過敏原成分和轉(zhuǎn)基因成分的相關(guān)應(yīng)用實(shí)例眾多。但是qPCR在進(jìn)行定量分析時(shí)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線有較大的依賴性,且標(biāo)準(zhǔn)品與實(shí)際樣品在DNA提取、PCR擴(kuò)增等方面存在著不容忽視的巨大差異,因此限制了qPCR在食品樣品定量分析領(lǐng)域的應(yīng)用。

1.2.3 數(shù)字PCR(Digital PCR,dPCR) dPCR是一項(xiàng)基于單分子目的序列PCR擴(kuò)增的拷貝數(shù)定量技術(shù),根據(jù)泊松分布(Poisson distribution)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理對(duì)大量反應(yīng)室中單分子核酸的PCR擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析,從而計(jì)算出初始樣品中目的序列的精確拷貝數(shù)[27-29]。dPCR擺脫了依賴系列梯度標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的基因定量方式,直接對(duì)樣品中的目的序列進(jìn)行拷貝數(shù)準(zhǔn)確定量[30-31]。商業(yè)化dPCR儀的出現(xiàn),克服了dPCR技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中面臨的操作復(fù)雜、重復(fù)性差、通量低等困難,實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化和高通量的應(yīng)用。主流dPCR分為芯片式數(shù)字PCR(chip digital PCR,cdPCR)和微滴式數(shù)字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)。dPCR的優(yōu)勢(shì)推動(dòng)和擴(kuò)大了其發(fā)展與實(shí)際應(yīng)用范圍,近年來該技術(shù)在食品中動(dòng)植物源性成分鑒別檢測(cè)方面取得了不少研究成果[32]。

在食品中植物源性成分方面,郭楠楠等[33]基于ddPCR技術(shù),建立了定量分析市售杏仁露中杏仁源性成分和摻假花生源性成分的含量的檢測(cè)方法,通過建立兩物種的質(zhì)量與拷貝數(shù)之間的計(jì)算公式進(jìn)行特異性、人為摻假樣品和市售樣品的檢驗(yàn),定量方法的建立、驗(yàn)證和實(shí)際應(yīng)用中各重復(fù)實(shí)驗(yàn)之間變異系數(shù)均小于15%,可以較好地達(dá)到定量分析和甄別摻假的目的。Scollo等[34]建立了ddPCR定量檢測(cè)橄欖油DNA的方法,結(jié)果顯示檢測(cè)靈敏度為10-3,線性擬合相關(guān)系數(shù)R2為0.9972,相關(guān)性比較理想。在食品中動(dòng)物源性成分方面已有較多采用cdPCR或ddPCR建立鑒偽定量檢測(cè)方法的研究報(bào)道,可檢測(cè)低至10 pg的DNA,且定量檢測(cè)限達(dá)8拷貝[35-38]。

現(xiàn)有報(bào)道顯示,ddPCR可以顯著排除干擾背景的影響[39-40],有效提高了檢測(cè)性能。有學(xué)者認(rèn)為,ddPCR不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線,對(duì)稀有事件檢測(cè)準(zhǔn)確靈敏,具有較好的準(zhǔn)確性和應(yīng)用性[41]。目前,ddPCR以其通量高、操作便捷、定量檢測(cè)精準(zhǔn)等突出優(yōu)勢(shì),已經(jīng)成為dPCR檢測(cè)技術(shù)的主要技術(shù)。dPCR搭建精準(zhǔn)定量平臺(tái),為判別食品中物種源性成分無意摻雜和有意摻偽提供了新的研究思路。

1.3 基于恒溫?cái)U(kuò)增的特定基因檢測(cè)

1.3.1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated Isothermal Amplification,LAMP) LAMP通過對(duì)目的基因的6個(gè)特定區(qū)域進(jìn)行4種引物設(shè)定,在60～65 ℃恒溫條件下利用具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶對(duì)目的基因進(jìn)行高效擴(kuò)增,從而實(shí)現(xiàn)高效靈敏的檢測(cè)[42]。與PCR技術(shù)相比,LAMP無需提供精確的變溫反應(yīng)條件,反應(yīng)時(shí)間可短至30～60 min,檢測(cè)結(jié)果判讀可視化。而且由于引入多條引物對(duì)目的序列多個(gè)特定區(qū)域識(shí)別匹配才能發(fā)生反應(yīng),因此LAMP具有很高的特異性[43-45]。由于LAMP技術(shù)特異性強(qiáng)、檢測(cè)效率高、操作簡便、對(duì)儀器設(shè)備要求低、結(jié)果判讀簡單,已經(jīng)在食品檢測(cè)中得到越來越廣泛的應(yīng)用[46-47]。

Focke等[47]以rDNA的ITS1區(qū)域?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)引物,采用LAMP技術(shù)檢測(cè)面包混合物中的植物源性成分,檢測(cè)出黑芥、白芥和芹菜,定性檢測(cè)限為16 mg/kg,定量檢測(cè)限分別達(dá)到16 mg/kg,與qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)。Vaagt等[48]采用LAMP方法對(duì)親緣關(guān)系密切的食用菌和來路不明甚至有毒性的蘑菇進(jìn)行鑒別,通過蘑菇樣品(原料和油炸原料)的交叉反應(yīng)研究和分析驗(yàn)證了該方法的適用性,在不同的蘑菇混合物中,可以檢測(cè)到2%(w/w)的摻雜污染,為食用菌的現(xiàn)場快速鑒定提供技術(shù)手段。目前LAMP在食品領(lǐng)域中關(guān)于轉(zhuǎn)基因成分和過敏原的檢測(cè)應(yīng)用已較成熟[49-51],在動(dòng)物源性成分檢測(cè)方面的應(yīng)用也較為廣泛[52-53]。但是該技術(shù)在引物設(shè)計(jì)時(shí),其對(duì)應(yīng)的序列均為較大的片段,而深度加工食品中的DNA片段較小,因此,其在深加工食品檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用受到了限制。在較小的目的序列區(qū)域設(shè)計(jì)高靈敏度和特異性的引物也是LAMP亟需突破的技術(shù)難點(diǎn)[54]。

1.3.2 重組酶聚合酶擴(kuò)增(Recombinase polymerase amplification,RPA) RPA通過設(shè)計(jì)2種特異性引物(可增加1種探針),在25～42 ℃恒溫條件下,重組酶與寡核苷酸引物結(jié)合形成酶-引物復(fù)合體,復(fù)合體在重組酶催化下以及單鏈DNA結(jié)合蛋白(Single-strand DNA binding protein,SSB)協(xié)助下,定位到模板的目的序列,使DNA雙鏈解旋,并在DNA聚合酶催化下形成新鏈[55]。與LAMP檢測(cè)方法相比,RPA具有更短的反應(yīng)時(shí)間,一般5～20 min即可完成反應(yīng),且反應(yīng)溫度條件更低,接近人的正常體溫。RPA靈敏度高、成本低、反應(yīng)速度快、樣品預(yù)處理要求低、引物設(shè)計(jì)更靈活便捷,可以在條件簡陋的實(shí)驗(yàn)室和資源不足的戶外等地實(shí)現(xiàn)應(yīng)用,近年來RPA技術(shù)在食品檢測(cè)中的應(yīng)用越來越廣泛[56-57]。

Nosi等[57]基于RPA對(duì)加工食品中的芒果肉進(jìn)行檢測(cè),建立食品中芒果成分摻假的鑒偽方法,檢測(cè)低限為1 copies/μL。Liu等[58]采用RPA建立了鑒別草本銀杏葉及其摻偽物種槐樹葉的方法。RPA以其獨(dú)特的優(yōu)越性引起了廣泛的關(guān)注,近年來發(fā)展迅速。但是該技術(shù)本身還存在著許多缺點(diǎn)和不足,比如所需的探針(46～52 bp)和引物(30～35 bp)比其他核酸擴(kuò)增技術(shù)的探針和引物長,增加了設(shè)計(jì)的難度,限制了其深加工食品中的應(yīng)用范圍。

1.4 基于基因序列多態(tài)性分析的通用基因檢測(cè)

DNA條形碼(DNA barcoding)是一種新興的基因序列分析技術(shù),其基本原理是利用DNA序列“低的種內(nèi)變異”且“高的種間變異”的特點(diǎn),通過分析一段較短的DNA標(biāo)準(zhǔn)序列的多態(tài)性來實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確的物種鑒定[59]。目前,DNA條形碼已經(jīng)被認(rèn)為是一種強(qiáng)大、快速、成本低廉且用途廣泛的物種鑒別檢測(cè)技術(shù),在食品真?zhèn)舞b別技術(shù)領(lǐng)域已經(jīng)成為有效的檢測(cè)工具之一。

Kumar等[60]以DNA條形碼技術(shù)對(duì)橄欖油及其假冒樣品蓖麻和向日葵的識(shí)別區(qū)域進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性分析,通過擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域,將所得序列同蓖麻和向日葵的DNA序列相匹配,檢測(cè)出橄欖油中存在5%的摻假成分。Madesis等[61]利用植物通用條形碼trnL結(jié)合高分辨率溶解曲線(High-resolution melting,HRM)對(duì)希臘和地中海地區(qū)常見豆科作物的識(shí)別和摻假進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)大豆粉中存在1%的羽扇豆屬摻假成分。Uncu等[62]通過與氣相色譜分析方法作比較,發(fā)現(xiàn)PCR毛細(xì)管電泳條形碼(PCR-CE barcode)在鑒別橄欖油的植物來源摻假物種時(shí),表現(xiàn)出更好的靈敏度和檢測(cè)效率,驗(yàn)證了PCR-CE條形碼技術(shù)在檢測(cè)橄欖油中成分摻假現(xiàn)象的可行性。韓晴等[63]設(shè)計(jì)并篩選同時(shí)能對(duì)杏仁、花生、核桃、大豆、芝麻和榛子六個(gè)物種進(jìn)行擴(kuò)增的通用引物,試驗(yàn)表明引物ITS2-2和trn H-psb A-1分別對(duì)六個(gè)物種的擴(kuò)增成功率和測(cè)序成功率均較高,且引物ITS2-2對(duì)于摻入85.80%的花生檢測(cè)結(jié)果為杏仁,trn H-psb A-1對(duì)于摻入6.94%的花生檢測(cè)結(jié)果為花生,這兩種引物可作為鑒別杏仁露中花生源性成分的植物DNA條形碼組合。Bruni等[64]使用rbcL和trnH-psbA質(zhì)體區(qū)域作為條形碼標(biāo)記,對(duì)意大利北部阿爾卑斯山區(qū)的植物區(qū)系中不同地方產(chǎn)生的4種多花蜂蜜的植物來源進(jìn)行檢測(cè),在4種蜂蜜樣品中鑒定出39種植物物種,發(fā)現(xiàn)樣品均來自于栗屬、櫟屬和幾種草本植物分類群的常見植物的混合物,且在所檢測(cè)的4種蜂蜜樣品中都發(fā)現(xiàn)了至少1種特有植物,為這些產(chǎn)品的地理特征提供了明確的標(biāo)識(shí),同時(shí)也可以對(duì)蜂蜜植物來源的毒性進(jìn)行安全性評(píng)估。

2 基于蛋白質(zhì)水平的檢測(cè)

基于蛋白質(zhì)水平的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù),主要依據(jù)免疫學(xué)原理,通過植物源性成分中具有抗原活性的特定蛋白質(zhì)與特異性抗體的結(jié)合為基礎(chǔ)開展定性或定量檢測(cè)。確保進(jìn)行免疫特異性反應(yīng)的蛋白質(zhì)抗原表面決定簇不受破壞、蛋白質(zhì)濃度適宜以及干擾雜質(zhì)較少的反應(yīng)背景[65-67]是蛋白質(zhì)水平免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的關(guān)鍵。植物組織細(xì)胞中的次生物質(zhì)會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)免疫反應(yīng)的背景和結(jié)果讀取造成極大干擾,反應(yīng)體系中的RNA、DNA和其他抗原表面決定簇相近的蛋白質(zhì)可能會(huì)產(chǎn)生競爭性結(jié)合[67]。深加工植物源性食品具有抗原活性的特定蛋白質(zhì)可能因?yàn)榧庸み^程的溫度、酸堿度、高鹽高糖等因素而發(fā)生蛋白質(zhì)變性,失去進(jìn)行免疫學(xué)特異性反應(yīng)的特定結(jié)構(gòu),影響抗原和抗體之間的結(jié)合力,會(huì)造成假陰性檢測(cè)結(jié)果[68]。有些蛋白質(zhì)難以制備合適的血清抗體。有些蛋白質(zhì)的表達(dá)具有時(shí)空或組織特異性等。這些因素都會(huì)制約蛋白質(zhì)水平檢測(cè)技術(shù)在食品中植物源性成分鑒別檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用。

食品中植物源性成分蛋白質(zhì)水平的檢測(cè)技術(shù)主要分為免疫膠體金技術(shù)(Immune colloidal gold,ICA)和酶聯(lián)免疫吸附分析(Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA)兩大類型,集中應(yīng)用于食品致敏原成分如芝麻[69]、杏仁[70]、花生[71-72]和轉(zhuǎn)基因成分如大豆[73]的檢測(cè)。ICA操作簡便,可以快速得到定性檢測(cè)結(jié)果[74];ELISA通過引入系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品和顯色生化反應(yīng),利用光學(xué)檢測(cè)設(shè)備實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的,具有高通量的優(yōu)勢(shì)[75-76]。

3 展望

與蛋白質(zhì)相比,核酸對(duì)溫度、化學(xué)物質(zhì)、酸堿度、紫外線等具有更好的穩(wěn)定性,且所具有的物種保守性更為理想,因此基因檢測(cè)成為食品中動(dòng)植物源性成分分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)研究和應(yīng)用的主要方向。食品摻假時(shí)有發(fā)生,食品成分檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用范圍也不同。原料經(jīng)過破碎、攪拌、高溫、高壓等加工過程,殘余植物源性特征成分的質(zhì)與量發(fā)生了極大下降,檢測(cè)技術(shù)應(yīng)能夠適用于核酸含量低、破碎程度高的樣品;有意摻假和無意混雜在性質(zhì)和安全風(fēng)險(xiǎn)上差別巨大,檢測(cè)技術(shù)應(yīng)能夠?yàn)樵u(píng)價(jià)和區(qū)分的解決方案提供技術(shù)依據(jù);食品生產(chǎn)、流通和安全監(jiān)管對(duì)要求檢測(cè)時(shí)長不斷縮短,快速檢測(cè)甚至是現(xiàn)場檢測(cè)將會(huì)是未來一個(gè)重要的發(fā)展方向。

目前,食品中植物源性成分基因檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì),一方面以dPCR為代表,正在逐步實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定量的目標(biāo),從而為有意摻假和無意混雜提供可靠的評(píng)價(jià)依據(jù);另一方面以DNA條碼技術(shù)為新興發(fā)展方向,對(duì)復(fù)雜樣品中未知物種成分鑒別從“大海撈針”轉(zhuǎn)變?yōu)椤叭鼍W(wǎng)捕魚”,改變以往PCR技術(shù)只能針對(duì)已知特定物種的保守基因進(jìn)行逐個(gè)檢測(cè)、對(duì)未知物種成分無能為力的窘?jīng)r,實(shí)現(xiàn)高效篩檢樣品中多物種成分的目的。